[국내논문]Chemical Agent를 이용한 추가 활성화 처리가 돼지 단위발생란의 발달에 미치는 영향 Development of Porcine Parthenogenetic Oocytes Activated with Different Combination of Chemicals원문보기
핵이식 방법을 이용하여 성공적인 복제를 이루기 위해서 인위적인 활성화 처리는 필수적인 요소이다. 본 연구는 전기자극에 의해 활성화된 난자를 chemical agent를 이용하여 추가적인 활성화 처리를 하였을 때 돼지 단위발생란의 발달에 미치는 영향을 알아보고자 수행되었다. 체외에서 $40{\sim}44$시간 동안 배양된 난자를 전기자극(E)으로 활성화 처리한 후 Thimerasol + Dithiothreitol(Thi+DTT), 6-Dimethylaminopurine(6-DMAP) 및 Cycloheximide(CH)를 사용하여 추가 활성화 처리를 하였다. 활성화 방법(E, E+Thi+DTT, E+6-DMAP 및 E+CH)에 따른 단위발생란의 배반포까지의 발달율을 조사한 결과, chemical agent에 의해 추가 활성화된 단위발생란이 전기자극만으로 처리된 구의 단위발생란보다 유의적으로 높은 발달율을 보였다($21.5{\sim}28.1%$ vs. 18.0%, P<0.05). 특히, E+Thi+DTT를 이용하였을 때 발달율이 유의적으로 높게 나타났다(28.1%, P<0.05). 활성화 처리별 전핵 형성율을 조사한 결과, chemical agent에 의해 추가 활성화 처리된 구에서 하나의 극체(1PN) 형성률은 처리별로 차이를 보이지 않았으나$(59.9{\sim}64.7%)$, 2PN 형성율은 추가 활성화 처리구에서 전기자극만을 사용하였을 때보다 유의적으로 높게 나타났다($7.2{\sim}9.7%$ vs. 4.3%, P<0.05). 이상의 결과를 살펴볼 때, 전기자극 후 chemical agent를 이용한 추가 활성화는 단위발생란의 배반포까지의 발달능력을 증가시키는 것으로 생각된다.
핵이식 방법을 이용하여 성공적인 복제를 이루기 위해서 인위적인 활성화 처리는 필수적인 요소이다. 본 연구는 전기자극에 의해 활성화된 난자를 chemical agent를 이용하여 추가적인 활성화 처리를 하였을 때 돼지 단위발생란의 발달에 미치는 영향을 알아보고자 수행되었다. 체외에서 $40{\sim}44$시간 동안 배양된 난자를 전기자극(E)으로 활성화 처리한 후 Thimerasol + Dithiothreitol(Thi+DTT), 6-Dimethylaminopurine(6-DMAP) 및 Cycloheximide(CH)를 사용하여 추가 활성화 처리를 하였다. 활성화 방법(E, E+Thi+DTT, E+6-DMAP 및 E+CH)에 따른 단위발생란의 배반포까지의 발달율을 조사한 결과, chemical agent에 의해 추가 활성화된 단위발생란이 전기자극만으로 처리된 구의 단위발생란보다 유의적으로 높은 발달율을 보였다($21.5{\sim}28.1%$ vs. 18.0%, P<0.05). 특히, E+Thi+DTT를 이용하였을 때 발달율이 유의적으로 높게 나타났다(28.1%, P<0.05). 활성화 처리별 전핵 형성율을 조사한 결과, chemical agent에 의해 추가 활성화 처리된 구에서 하나의 극체(1PN) 형성률은 처리별로 차이를 보이지 않았으나$(59.9{\sim}64.7%)$, 2PN 형성율은 추가 활성화 처리구에서 전기자극만을 사용하였을 때보다 유의적으로 높게 나타났다($7.2{\sim}9.7%$ vs. 4.3%, P<0.05). 이상의 결과를 살펴볼 때, 전기자극 후 chemical agent를 이용한 추가 활성화는 단위발생란의 배반포까지의 발달능력을 증가시키는 것으로 생각된다.
Artificial activation of oocytes is a prerequisite for the successful cloning by nuclear transfer. This study investigated the effect of the different combination of activation agents such as electric pulse (E), thimerosal (Thi) + dithiothreitol (DTT), 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) or cycloheximide...
Artificial activation of oocytes is a prerequisite for the successful cloning by nuclear transfer. This study investigated the effect of the different combination of activation agents such as electric pulse (E), thimerosal (Thi) + dithiothreitol (DTT), 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) or cycloheximide (CH) on the developmental ability of porcine embryos derived from parthenogenetic activation (PA). PA embryos activated with chemicals showed significantly higher developmental rate to the blastocyst stage compared to the embryos activated with E alone ($21.5{\sim}28.1%$ vs. 18.0%, respectively). Of chemicals, Thi + DTT supported higher development to the blastoryst stage (28.1%). There was no significant difference in 1 pronucleus (PN) formation rate $(59.9{\sim}64.7%)$, but 2PN formation rate was significantly higher in PA embryos with additional activation using chemicals $(7.2{\sim}9.7%)$. In conclusion, this study shows that chemical activation after electric pulse can increase the development of porcine PA embryos.
Artificial activation of oocytes is a prerequisite for the successful cloning by nuclear transfer. This study investigated the effect of the different combination of activation agents such as electric pulse (E), thimerosal (Thi) + dithiothreitol (DTT), 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) or cycloheximide (CH) on the developmental ability of porcine embryos derived from parthenogenetic activation (PA). PA embryos activated with chemicals showed significantly higher developmental rate to the blastocyst stage compared to the embryos activated with E alone ($21.5{\sim}28.1%$ vs. 18.0%, respectively). Of chemicals, Thi + DTT supported higher development to the blastoryst stage (28.1%). There was no significant difference in 1 pronucleus (PN) formation rate $(59.9{\sim}64.7%)$, but 2PN formation rate was significantly higher in PA embryos with additional activation using chemicals $(7.2{\sim}9.7%)$. In conclusion, this study shows that chemical activation after electric pulse can increase the development of porcine PA embryos.
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문제 정의
그러므로, 본 연구는 전기자극 후 chemical agent를 이용한 추가 활성화 처리가 단위발생된 돼지 난자의 발달에 미치는 영향을 알아보고자 실시되었다.
제안 방법
5 μg/ml follide stimulating hormone, 75 μg/ml penicillin G 및, 50 μg/ml strepotomycdn이 첨가된 TCM-199(Gibco-BRL, Grand Island, NY, U§A)을 사용하였다. 성숙배양은 4-well dish(Nunc, Roskilde, Denmark)를 이용하여 well당 50~70개의 난자를 넣어 40~44시간 동안 실시하였다. 배양조건은 38.
40~44시간 성숙 배양된 난자를 0.1% PVA와 0.1% hyaluronidase가 포함된 TL-Hepes에 넣어 5분간 votexing하여 난구세포를 제거하였다. 난구세포가 제거된 난자들 중 제 1 극체가 방출된 난자만을 선별하여 사용하였다.
난구세포가 제거된 난자들 중 제 1 극체가 방출된 난자만을 선별하여 사용하였다. 난구 세포가 제거된 난자들을 BTX-Cell Manipulator 200(BTX, San Diego, CA, USA)을 이용하여 활성화 처리를 하였다. 활성화용 배지는 1.
2 kV/cm의 DC pulse를 1초 간격으로 2회 30μs 동안 처리하였다. 전기자극을 이용하여 활성화 처리된 난자들은 각각 0.2 mM thimerosal(Thi) 10분 + 8 mM dithiothreitol(DTT) 30분, 2 mM 6-dimethylaminopurine(6-DMAP) 3시간 및 10 μg/ml cycloheximide(CH) 6시간를 사용하여 추가 활성화 처리되었다.
배반포의 inner cell mass(ICM)와 trophectoderm(TE)을 즉정하기 위하여 propidium iodide(Sigmaz P-4170; PI)와 bisBenzimide(Sigma, B-2261)를 사용하여 deferential staining을 실시하였다. 투명대를 0.
이 배양액 내에는 PI와 bisBenzimide가 각각 10μg/ml 첨가되었다. 염색된 배반포를 slide glass에 위치시켜 형광현미경(Nikon Corp., Tokyo, Japan) 하에서 배반포의 ICM과 TE를 각각 조사하였다.
재구축 및 활성화 처리 후 6시간 후에 난자를 2% formaldehide가 첨가된 D-PBS 내에 위치시켜 4℃에서 24시간 동안 고정한 후 slide glass에 위치시킨 후 10 μg/ml Hoechest를 사용하여 전핵을 염색하였다. 염색된 난자의 전핵 형성 여부를 형광현미경(Nikon Corp., Tokyo, Japan) 하에서 관찰하였다.
직경 3~6 mm의 난포로부터 18 guage 주사바늘이 부착된 주사기로 난포액을 흡입하여 미성숙 난자를 채취하였다. 채취한 난자는 실체 현미경 하에서 난구세포 및 세포질이 균질한 것을 선별하여 0.1% PVA(Polyvinyl alcohol)가 첨가된 TL-Hepes에 3회 세척 후에 성숙배양에 이용하였다. 성숙배양액은 0.
1% PVA(Polyvinyl alcohol)가 첨가된 TL-Hepes에 3회 세척 후에 성숙배양에 이용하였다. 성숙배양액은 0.1% PVA(w/v), 3.05 mM D-glucose, 0.91 mM sodium pyruvate, 0.57 mM cysteine, 0.5 μg/ml lutenizing hormone, 0.5 μg/ml follide stimulating hormone, 75 μg/ml penicillin G 및, 50 μg/ml strepotomycdn이 첨가된 TCM-199(Gibco-BRL, Grand Island, NY, U§A)을 사용하였다. 성숙배양은 4-well dish(Nunc, Roskilde, Denmark)를 이용하여 well당 50~70개의 난자를 넣어 40~44시간 동안 실시하였다.
1% hyaluronidase가 포함된 TL-Hepes에 넣어 5분간 votexing하여 난구세포를 제거하였다. 난구세포가 제거된 난자들 중 제 1 극체가 방출된 난자만을 선별하여 사용하였다. 난구 세포가 제거된 난자들을 BTX-Cell Manipulator 200(BTX, San Diego, CA, USA)을 이용하여 활성화 처리를 하였다.
난구 세포가 제거된 난자들을 BTX-Cell Manipulator 200(BTX, San Diego, CA, USA)을 이용하여 활성화 처리를 하였다. 활성화용 배지는 1.0 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2 및 0.5 mM Hepes가 첨가된 0.3 M mannitol을 사용하였다. 사용된 전압은 1.
9% 생리식염수 용액에 넣어 실험실로 운반하였다. 직경 3~6 mm의 난포로부터 18 guage 주사바늘이 부착된 주사기로 난포액을 흡입하여 미성숙 난자를 채취하였다. 채취한 난자는 실체 현미경 하에서 난구세포 및 세포질이 균질한 것을 선별하여 0.
데이터처리
사용하여 분석하였다. 자료의 유의차는 Duncan's multiple range-test를 사용하여 나타내었고, 모든 자료는 Least Square(LS) mean±SEM으로 나타내었다. 유의차는 P<0.
이론/모형
Hoechest staining를 사용하여 전핵 형성을 조사하였다(Koo 등, 2000). 재구축 및 활성화 처리 후 6시간 후에 난자를 2% formaldehide가 첨가된 D-PBS 내에 위치시켜 4℃에서 24시간 동안 고정한 후 slide glass에 위치시킨 후 10 μg/ml Hoechest를 사용하여 전핵을 염색하였다.
분할율, 배반포율, 세포수 및 전핵 형성율은 Statistical Analysis System의 Generalized Linear Model procedure(Proc-GLM)를 사용하여 분석하였다. 자료의 유의차는 Duncan's multiple range-test를 사용하여 나타내었고, 모든 자료는 Least Square(LS) mean±SEM으로 나타내었다.
성능/효과
활성화 처리에 따른 난자의 발육율을 검토한 결과, 분할율은 각 처리구간 (66.7~79.6%)에 유의적인 차이를 보이지 않았지만 배반포 발생율은 추가적인 chemical agent로 처리된 구들에서 전기자극으로만 처리된 구보다 유의적으로 높았다(21.5~28.1% vs 18.0%, P<0.05). 특히, 전기자극 후 Thi+DTT를 이용하여 추가 활성화 처리를 하였을 때 6-DMAP 또는 CH를 사용한 처리구보다 유의적으로 높은 배반포 형성율을 보였다(Table 1).
05). 특히, 전기자극 후 Thi+DTT를 이용하여 추가 활성화 처리를 하였을 때 6-DMAP 또는 CH를 사용한 처리구보다 유의적으로 높은 배반포 형성율을 보였다(Table 1).
각 처리구별로 세포수 및 세포의 구성을 검토한 결과, ICM(9.9~14.4%)과 TE(85.6~90.1%) 및 총 세포수는 각 처리구간에 차이가 없었다(Table 2).
단위발생란의 활성화 후 6시간에 핵의 현태를 검토한 결과(Table 3), 활성화가 유기된 난자의 대부분은 1PN의 구조를 나타내었으나(59.9~64.7), 6-DMAP 추가 처리 구에서는 전기자극만 처리한 대조구에 비하여 2PN 형성율이 유의적으로 높았다(9.7 vs 4.3, P<0.05).
본 연구의 결과는 돼지 단위발생란을 전기자극 후 chemical agent를 이용하여 주가 활성화 처리하면 전기자극만으로 처리되었을 때보다 배반포 단계까지의 발달을 증가시킬 수 있다는 사실을 보여준다. Metaphase II 상태에 있는 포유동물 난자의 활성화는 다양한 화학적 또는 물리적인 자극에 의해서 유도되어질 수 있으며, 또한 배란 후 aging에 의해서도 야기되어질 수 있다.
Tao 등(1999)은 Thi+DTT에 의해 활성화된 돼지 핵이식란이 배반포기까지 발달할 수 있다고 보고하였다. 또한, 본 연구에서 전기자극 후 chemical agent에 의해 추가 활성화된 단위발생란이 전기자극만으로 활성화된 난자보다 더 높은 ICM:TE 비율을 나타냈다. 이전의 보고들에 의하면 체내, 체외 및 핵이식 유래 배반포의 ICM:TE 비율은 각각 44~50%, 16~17% 및 17%였다(Machaty 등, 1998; Koo 등, 2004).
후속연구
핵이식 수정란의 ICM과 TE의 비정상적인 비율은 비정상적인 태반 또는 초기 태아 손실의 원인이 될 수 있으며, 착상 후에도 영향을 미칠 수 있다(Koo 등, 2004). 이 같은 결과로 볼 때 전기자극 후 chemical agent를 이용한 추가 활성화는 핵이식 수정란의 ICM:TE 비율을 조절하여 착상 후의 발달에까지 영향을 미칠 수 있을 것으로 생각된다.
본 연구의 결과에 의하면 전기자극 후 chemical agent를 이용한 추가 활성화는 돼지 단위발생란의 배반포까지의 발달 능력을 증가시키는데 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
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