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문제 정의
- 본 연구에서는 T. roseopersicina NCIB 8347에서 수소생산효소를 정제하는데 있어서 (NH4)2SO4 침전과 열처리하는 것이 효소의 활성과 정제에 미치는 영향을 연구하였다. (NH4)2SO4 침전 농도가 40-60%일 때 가장 많은 단백질을 침전시킬 수 있었고 수소생산 활성 효율 측면에서 가장 높은 활성을 가진 효소를 얻을 수 있었다.
- 본 연구에서는 효율적인 효소생산을 위한 기초연구로 (NH4)2SC)4의 침전 농도와 열처리 온도 및 시간 등이 수소생산 효소를 분리 정제하는데 미치는 영향에 대해서 연구하였다.
제안 방법
- roseopersicina NCIB 8347 균체를 다량 배양하여 수소생산효소를 분리하기 위하여 다음과 같이 연속적으로 배지를 첨가하면서 배양하였다. 즉 초기 균체 농도를 660 nm에서 흡광도가 0.7이 되도록 pfennig's 배지에 접종하고, 24시간 광합성 배양 후 0.05% acetate, 6 mM ammonium chloride 와각종 trace elements(Na2'EDTA 8 "M, FeSOe-THzO 4 “M, CoCWW 0.7 jt/M, MnCSHQ 0.3 pM, ZnCl2 0.3 pM, NiCl2-6H2O 0.1 NaeWfoO/HzO 0.07 pM, HsBOa 5 pM, CuCheHzO 0.01 “M)를 첨가하였다. 이와 같이 연속적으로 배지를 첨가하여 약 96시간 배양하고, 균체 농도가 660 nm에서 흡광도 약 3.
- Cell extract로부터 세포질 분획 각 단계마다 단백질이 제거되는 것을 sodium dodecyl sulfate 전기영동으로 확인하였다. Sodium dodecyl sulfate 전기영동은 단백질을 분자량에 따라 분리할 수 있다.
- T. roseopersicim NCIB 8347 배양액을 원심 분리(5, 500xg, 40분) 하여 균체를 얻은 후 균체와 50 mM photassium phosphate buffer(pH 7.0) 를 섞어 4℃, 혐기 조건으로 sonication(20 kHz, 5분; Sonic dismembrator 550, Fisher)을 5번 반복하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄액을 4℃에서 원심 분리 (28, 000xg, 20분)하여 얻은 상등액을 cell extract로 하였으며, 이를 다시 4℃에서 초 원심 분리(400, 000xg, 1시간) 하여 상등액인 cytoplasmic fraction(세포질 분획)을준비하였다.
- 5%)를 함유한 N2를 200 ml/min 의 속도로 공급하여 독립영양 조건을 유지하였다. T. roseopersicina NCIB 8347 균체를 다량 배양하여 수소생산효소를 분리하기 위하여 다음과 같이 연속적으로 배지를 첨가하면서 배양하였다. 즉 초기 균체 농도를 660 nm에서 흡광도가 0.
- 0)조건에서 침전시켰다. T. roseopersidna NCIB 8347에서 생산되는 수소생산 효소는 (NH4)2SO4 70% 또는 25-35%에서 membrane-bound 수소생산/소비효소를 침전시켰다는 보고가 있었으나购, 본 연구에서는 (NH4)2SO4 의 농도 0, 20, 40, 60, 100%를 실험 1이라 하고 0, 20, 35, 60, 100%를 실험 2라 정하여 단백질을 침전 시키 고 남은 상등액에 다시 (NH4)2SQ를 넣 어단 백 질을 침전시키는 방법으로 단백질을 얻어 비교 분석하였다(Table 1).
- 이러한 결과는 40-60%의 농도에서 침전시킨 단백질에서 대부분의 수소생산 효소가 침전 되었다고 유추할 수 있었다. 그러나 40%의 농도에서 침전된 단백질도 40-60% 기준으로 약 16.48%에 해당하는 상당량의 수소생산 활성이 나타났기 때문에 수소생산 효소를 포함한 단백질을 좀더 많이 얻기 위해 (NHO2SO4 침전 농도 범위를 달리하여 실험2의 침전농도로 (NH4)2SO4 침전농도효과를 측정하였다.
- 0)로 희석하여 vivaspin 20(molecular cut-off 10, 000 dalton; Vivascience, London, UK) 에 넣어 원심분리(4, 000xg)하여 (NH4)2SO4를 제거시켰다. 단백질을 얻고 남은 상등액을 반으로 나누어 전술한 방법과 동일하게 20-40, 40-60, 60-100% 와 20-35, 35-60, 60-100%의 침전 농도에서 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질은 N2 치환해서 -70℃에서 보관하여 수소 생산 활성과 단백질 측정 시 사용했다.
- 0)로 하였고, 반응은 N2 가스로 치환한 후 혐기 조건하에서이루어졌다. 반응 시작 후 10분 간격으로 40분 동안 gas chromatograph를 측정하여 생성된 수소의 양을 측정하였다가 효소 활성 1 Unite 분당 1 印nol 의 수소가 생산되는 양으로 정하고, 효소 비활성도 는 U/mg-protein으로 정하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin을 표준 시료로 하여 Lowry method(Bio-rad protein assay) 를 이용하여 측정하였다.
- 본 연구에서는 60℃의 열처리 온도 조건에서 수소생산 활성을 극대화 시키면서 정제의 효율성을 높일 수 있는 열처리 시간을 알아보기 위해 0, 10, 20, 30, 60, 300분 동안 각각 열처리한 후 열에 의해 변성되어 가라앉은 단백질은 제거하고 상등액으로 수소생산 활성과 단백질을 측정하였다. 20분간 열처리한 후 단백질의 양은 0.
- 세포 파쇄액과 초 원심 분리한 세포질 분획, (NH4)2SO4 40-60%에서 침전 시켜 얻은 단백질 60℃에서 20분 동안 열처리한 단백질을 SDS 전기영동 하였다. SDS-polyacrylamide 젤 전기영동은 Laemmli와 Favre의 방법'”에 따라 ]0% acrylamide 젤을 조제하여 사용하였다.
- 전술한 방법으로 준비한 세포질 분획에 (NHj)2SO4 를 20% 넣고, 3시간 동안 4℃에 두어 단백질을 침전시킨 후 원심 분리 (5, 500xg, 20분)하여 침전된 단백질을 분리 하였다. 이 단백질에 침전 시 섞여 있는 (NHiXSQ는 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7.
- 준비한 세포질 분획을 60℃ water bath에서 각각 10, 20, 30, 60분 동안 열처리 후 얼음물에 담가 온도를 낮추고, N2 치환하였다. 4℃ 혐기 조건에서 원심분리 (28, 000xg, 20분)하여 변성되어 침전된 단백질은 제거하고 상등액만 취하여 수소 생산 활성과 단백질 측정 시 사용하고 -70℃에서 보관하였다.
- SDS-polyacrylamide 젤 전기영동은 Laemmli와 Favre의 방법'”에 따라 ]0% acrylamide 젤을 조제하여 사용하였다. 표준 단백질로 SDS 전기 영동(row range, M.W. 14, 000-100,000; Bio-rad, CA, USA)을 사용하였고, 전기영동은 stacking 젤까지는 18 mA로 행하였으며 이후에는 20 mA로 행하였다.
대상 데이터
- 하였다. SDS-polyacrylamide 젤 전기영동은 Laemmli와 Favre의 방법'”에 따라 ]0% acrylamide 젤을 조제하여 사용하였다. 표준 단백질로 SDS 전기 영동(row range, M.
- 본 실험에서 사용한 균주는 광합성 홍색 유황세균인 T roseopersicina NCIB 8347이다. 이 균주를 pfennig's 배지部에 접종하고 할로겐 램프를 8, 000 lux로 조사하면서 25℃에서 광합성 배양하였다.
이론/모형
- 반응 시작 후 10분 간격으로 40분 동안 gas chromatograph를 측정하여 생성된 수소의 양을 측정하였다가 효소 활성 1 Unite 분당 1 印nol 의 수소가 생산되는 양으로 정하고, 효소 비활성도 는 U/mg-protein으로 정하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin을 표준 시료로 하여 Lowry method(Bio-rad protein assay) 를 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- roseopersicina NCIB 8347에서 수소생산효소를 정제하는데 있어서 (NH4)2SO4 침전과 열처리하는 것이 효소의 활성과 정제에 미치는 영향을 연구하였다. (NH4)2SO4 침전 농도가 40-60%일 때 가장 많은 단백질을 침전시킬 수 있었고 수소생산 활성 효율 측면에서 가장 높은 활성을 가진 효소를 얻을 수 있었다. 또한 열처리 효과는 60℃에서 20분 동안 열처리하는 것이 내열성을 갖고 있는 수소생산 효소를 단백질의 변성을 최소화 하면서 수소생산 활성을 높여주는 최적의 조건인 것으로 나타났다.
- 100%에서 침전시킨 단백질은 (NH4)2SQ로 침전시키지 않았을 때와 비교하여 단백질의 양은 약 1.33배 증가하였으나 활성은 약 2.5배 감소하여 최대 수소생산 비활성 도의 약 0.39%에 불과한 수소생산 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 40-60%의 농도에서 침전시킨 단백질에서 대부분의 수소생산 효소가 침전 되었다고 유추할 수 있었다.
- 20분간 열처리한 후 단백질의 양은 0.45 mg/ml로 다른 시간 동안의 열처리 경우와 비교하였을 때 단백질의 양은 거의 동일 하였으나 효소의 역가가 높아서 수소생산 비활성 도가 0.78 U/m蛆-protein으로 가장 높았다. 열처리 30분 및 60분의 경우 20분에 비해 비활성도는 10% 정도 감소한 것으로 관찰되었다.
- 05배 낮아져 상대적으로 수소생산 비활성 도가 낮아졌기 때문이다(Table 1). 40-60, 35-60%의 농도에서 침전된 단백질에서는 수소생산 비활성도 비교 slope 에서 볼 수 있듯이 다른 농도들에서 침전된 단백질들에 비해 현격히 높은 수소생산 활성을 보였는데 이는 40-60, 35-60%의 농도에서 침전된 단백질에 수소생산효소가 다량 포함되어 있음을 나타낸다(Fig. 1). 전체 (NH4)2SO4 침전 농도별로 수소생산 활성도를 비교해 보았을 때도 실험2에서는 35-60%가 가장 높지만 실험 1과 2 전체를 비교해보았을 때 40-60%가 가장 수소생산 활성이 높았다(Fig.
- 결과 (皿)2$。4를 세포질 분획에 20% 첨가하였을 때 침전되는 단백질은 수소생산 비활성도가 0.27 U/mg-protein으로 첨가하지 않았을 때 보다 약 3.38배 높았으나 최대 수소생산 비활성도를 나타낸 40-60%(5.08 U/mg-protein)보다는 약 18.81 배 낮은 5.27%에 불과하였다. 실험1에서 나타난 것처럼 (NH4)2SO4 40%에서 침전한 단백질의 수소생산 비활성 도가 0.
- 22배 낮아서 수소생산 비활성도로 비교했을 때는 5시간 열처리한 경우가 높은 것으로 나타났다. 5시간 열처리 후 수소생산 비활성도가 열처리를 하지 않았을 때 보다 높기는 했지만 역가로 미루어 이미 단백질의 변성으로 수소생산에 저해를 받고 있음을 알 수 있다(Table 2), 60℃에서 단백질은 열처리를 하지 않았을 때보다 열처리를 했을 때 약 1.5배 정도 감소하였으나 50℃에서 10분 간격으로 40분 동안 측정한 수소양의 각 시간대별 비활성 도를 slope로 나타내어 비교 분석한 결과 20분 동안 열처리하였을 때가 가장 수소생산 활성이 좋았고 처리 시간이 5시간으로 길어짐에 따라 수소생산이 저해되어 활성이 낮아졌다(Fig. 3). 열처리 하지 않았을 때와 열처리한 경우의 전체적인 수소생산 비활성도를 비교해 보았을 때 60℃에서 20분 간 열처리 하였을 때 가장 높은 수소생산 활성을 나타냄을 알 수 있었다(Fig.
- 또한 열처리 효과는 60℃에서 20분 동안 열처리하는 것이 내열성을 갖고 있는 수소생산 효소를 단백질의 변성을 최소화 하면서 수소생산 활성을 높여주는 최적의 조건인 것으로 나타났다. Cell extract와 cytoplasmic fraction들의 단백질을 각각 sodium dodecyl sulfate 전기영동 한 결과에서는 정제 단계를 거치면서 수소생산 활성을 가진 단백질 이외의 다른 단백질들이 상당량 제거되었고 수소생산 활성을 가진 단백질은 농축된 것을 알 수 있었다.
- 2). 따라서 T. roseopersicina NCIB 8347 에서 (NH4)2SO4 침전 농도가 40-60% 이외의 농도에서도 약간의 수소생산 효소를 포함하는 할단백질을 분리 할 수는 있지만 이들 농도에서 침전된 단백질에는 수소생산효소 이외의 단백질이 다량 함유되어 있어 수소생산 활성은 매우 낮기 때문에 (NH4)2SO4 침전 농도 40-60%에서 단백질을 침전시키는 것이 가장 적합하다고 사료된다.
- (NH4)2SO4 침전 농도가 40-60%일 때 가장 많은 단백질을 침전시킬 수 있었고 수소생산 활성 효율 측면에서 가장 높은 활성을 가진 효소를 얻을 수 있었다. 또한 열처리 효과는 60℃에서 20분 동안 열처리하는 것이 내열성을 갖고 있는 수소생산 효소를 단백질의 변성을 최소화 하면서 수소생산 활성을 높여주는 최적의 조건인 것으로 나타났다. Cell extract와 cytoplasmic fraction들의 단백질을 각각 sodium dodecyl sulfate 전기영동 한 결과에서는 정제 단계를 거치면서 수소생산 활성을 가진 단백질 이외의 다른 단백질들이 상당량 제거되었고 수소생산 활성을 가진 단백질은 농축된 것을 알 수 있었다.
- 실험 2에서는 35%의 농도에서 침전된 단백질은 40%보다 약 1.72배 낮은 단백질과 약 1.62배 낮은 수소생산 비활성도를 얻었고, 35-60%에서 1.33 U/mg-protein으로 가장 높은 수소생산 비활성 도를 나타내었으나 이는 실험 1의 최대 수소생산 활성 농도인 40-60%의 농도에서 침전된 단백질과 비교하면 약 26.15%에 불과하다. 이 같은 결과는 (NH4)2SO4 침전 농도를 높여 40-60%에서 얻은 단백질 양 보다 35-60%일 때 약 1.
- 27%에 불과하였다. 실험1에서 나타난 것처럼 (NH4)2SO4 40%에서 침전한 단백질의 수소생산 비활성 도가 0.84 U/m吗-protein으로 최대 비 활성 도를 나타낸 40-60%의 침전물에 비해 약 6배 낮았다.
- 3). 열처리 하지 않았을 때와 열처리한 경우의 전체적인 수소생산 비활성도를 비교해 보았을 때 60℃에서 20분 간 열처리 하였을 때 가장 높은 수소생산 활성을 나타냄을 알 수 있었다(Fig. 4). T.
- 열처리 30분 및 60분의 경우 20분에 비해 비활성도는 10% 정도 감소한 것으로 관찰되었다. 열처리를 하지 않은 경우와 5시간 이상 열처리 하였을 경우를 비교해보면 단백질의 양은 열처리 하지 않았을 때가 5시간 열처리 한 경우보다 약 1.57배 많지만 역가는 5시간 열처리 했을 때가 약 1.22배 낮아서 수소생산 비활성도로 비교했을 때는 5시간 열처리한 경우가 높은 것으로 나타났다. 5시간 열처리 후 수소생산 비활성도가 열처리를 하지 않았을 때 보다 높기는 했지만 역가로 미루어 이미 단백질의 변성으로 수소생산에 저해를 받고 있음을 알 수 있다(Table 2), 60℃에서 단백질은 열처리를 하지 않았을 때보다 열처리를 했을 때 약 1.
- 1). 전체 (NH4)2SO4 침전 농도별로 수소생산 활성도를 비교해 보았을 때도 실험2에서는 35-60%가 가장 높지만 실험 1과 2 전체를 비교해보았을 때 40-60%가 가장 수소생산 활성이 높았다(Fig. 2). 따라서 T.
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