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문제 정의
- NF-kB의 활성화에 의존한다涧. YHJST의 사이토카인 발현억제 작용이 NF-kB를 경유하는지를 알아보기 위하여 NF-kB promoter 활성에 관한 효과를 측정하였다. PMA를 처리한 결과 NF-kB promote!활성화에 의한 luciferase 활성이 PMA를 처리하지 않은 군에 비해 4배 증가하였으며, 이때 YHJST(10z 100, 200 姻/ n粉를 동시에 처리한 결과 luciferase 활성이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
- 構成 藥物 중 知母8), 黃苓9), 生地黃찌 牧丹皮町, 苦蔘I? 事前草 功는 이미 抗炎症 및 抗酸化 作用이 實驗的으로 糾明된 바가 있어, 이들로 構成된 凉血除濕湯 역시 有意性있는 結果가 期待된다. 이에 本 實驗에서는 現在 臨床에서 皮膚 瘙痒症에 活用되고 있는 凉血除濕湯을 試料로 PMA와 A23187에 의하여 활성화된 비만세포의 염증성 매개 물질의 분비를 억제 작용과 염증성 사이토카인 억제 작용 및 NF-kB 활성에 관한 효과를 조사하였다.
제안 방법
- 48well plate에 RBL-2H3 cell을 5 x 105 cell/戒로 18시간 배양한 뒤 FBS와 antibiotics를 제거한 배양액으로 바꿔준 후, NF-k B 부위가 3 copy 로 되어있는 NF-kB-Luc vector 와 b-galactosidase assay틀 통해 형질전환의 비율을 측정할 수 있도록 pCMV-p-Luc vector# 4시간 형질전환 시켰다. 세포에 FBS와 antibiotics가 함유된 배양액으로 바꿔준 후 시료와 양성대조군인 PMA를 18시간 처리하고 lysis buffer를 이용하여 세포를 lysis 시켰다, 3차례의 급속 냉동-해동을 거쳐 세포를 파괴하고, 12, 000 xg, 5분간 원심분리하여 세포 추출물을 얻어 luciferase substrate 와 반응시켜 NF-kB promoter 활성을 측정하였다.
- HMC-1 (Human mast cell line; J. H. Butterfield/ Mato Clinic, Rochester, MN) 2.0 x 106/세포를 DMEM {containing collagenase A (5 mg/ m£z BMZ Indianapoilisz INZ USA)와 DNase type I (0.15 mg/me Sigma), antibiotics (penicillinm 104 U/m£z streptomycin 10 mg/ amphotericin B 25 陽/口粉}과 4M 2-mercaptoethanol을 넣고 37℃ CO2 배양기에서 3일간 배양하였다.
- HMC-1 세포를 24 well plate에 5 x 104 세포토 각 w시]에 분주하고, 여기에 추출물 (200 100, 10 個/威)과, 양성대조군으로 CsA (10 俸/祝)를 처리하고 1시간 후 PMA (50 ng/戒) 와 A23187 (0.5 11M)를 각각의 w이1에 첨가하여 CO2 배양기에 24시간에 배양한 후, 각 항체 anti-IgE 를 coating 완충용액에 희석하여 microwell에 coating한 후 4 ℃ 에서 30분 방치한 후, ELISA reader 450 run에서 흡광도를 측정하였다.
- HMC-1 세포를 24 w이1 plate에 5 x 104 세포로 각 well에 분주하고, 여기에 주출물 (200, 100, 10 陽/戒)과, 양S대조군으로 CsA (10 臨/i汹)를 처리하고 1시간 후 PMA (50 ng/j関와 A23187 (0.511M) 를 각각의 well에 첨가하여 CO2 배양기에 24시간에 배양한 후 2,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 여기에 RNAzolB 500 或를 넣고 용해될 때까지 혼합하였다.
- 現在 臨床에서 皮膚 瘙痒症에 活用되고 있는 凉血除濕湯을 試 料로 PMA와 A23187에 의하여 활성화된 비만세포의 염증성 매개물질의 분비 억제 작용과 염증성 사이토카인 억제 작용 및 NF-kB 활성에 관한 효과를 검색하였던바 다음과 같은 결론을 얻었다. YHJST는 생쥐 폐의 fibroblast에 대하여 250 俸/诚 이하의눙도에서 세포독성을 나타내지 않았다.
- 1). 그러므로 본 연구에서는 200 姻/成이하의 농도를 사용하여 실험을 진행하였다.
- 0 X KF개 세포로 96 well plate에 분주한 후 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 2시간 배양하였다. 배양 후 SFR (최종 농도 1000 俸/m幻 500 傩/双, 250 您/砒, 125俸/mb 62.5您/i昭31.2陽/戒15.6您/】汹, 7.8陽/戒) 을 48시간 동안 처리하였다. 배양 종료 후에 배양액을 버리고 인산 완충용액 (PBS)로 2회 세척하고, 각 well에 50% TCA (trichloroacetic acid)를 50 成를 가하여 1시간 동안 4C에 방치하였다.
- 세포독성 측정은 SRB assay법을 약간 변형하여 사용하였다. hFCs 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 자란 것을 trysin-EDTA 용액으로 단일 세포들이 되도록 떼어낸 후, 2.
- pCMV-p-Luc vector# 4시간 형질전환 시켰다. 세포에 FBS와 antibiotics가 함유된 배양액으로 바꿔준 후 시료와 양성대조군인 PMA를 18시간 처리하고 lysis buffer를 이용하여 세포를 lysis 시켰다, 3차례의 급속 냉동-해동을 거쳐 세포를 파괴하고, 12, 000 xg, 5분간 원심분리하여 세포 추출물을 얻어 luciferase substrate 와 반응시켜 NF-kB promoter 활성을 측정하였다.
- 6 mM glucose)로 배양액을 바꿔주었다. 시료를 농도별로 1시간 전처리하고 양성대조군으로 10 11M의 A23187을 처리한 15분 뒤 상층을 얻었다. 얻은 상층액 50 成와 0.
- 양혈제습탕 (YHJST)의 2첩 분량에 각각 증류수 2,000 戒을가하여 열탕 추출기에서 3시간 추출하였다. 이를 다시 흡입 여과하여 감압 증류징치 (Rotary evaporator, BUCHI B-480, Switzerland) 로 농축한 후 동결 건조기 (Freeze dryer, EYELA FDU-540, Japan)를 이용하여 완전 건조하였다.
- A), antibiotics (penicillinm 104 U/mZ, streptomycin 10 mg/amphotericin B 25 μg/i现)}를 넣고 37℃ CO2 배양기에서 hFCs를 2 시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5% trypsin-0.2% EDTA를 첨가하여 30 분간 배양하고, 인산 완충 생리식염수 (PBS) 로 약 2희 1,500 rpm 에서 원심분리한 후 DMEM-10% FBS로 1주일 동안 배양하였다. 이를 다시 0.
- 역전사 (reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3 μg을 DNase I (10 U//z£) 2U/fube를 37℃ heating block에서 30 분간 반응한 후 75笆에서 10분 동안 변성시키고, 여기에 2.5 成 10 mM dNTPs mix, 1 或 random sequence hexanucleotides (25 pmole/ 25 成), RNA inhibitor로서 1 成 RNase inhibitor (20 U/ 以), 1 成 100 mM DTT, 4.5 成 %RT buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KC1, 15 mM MHCL)를 가한 후' 1 以의 M-MLV RT (200 U/成)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 依가 되도록 하였다.
- 이 혼합 부유액에 chloroform (CHCh) 50 说 를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15 분간 방치한 후 13, 000 年이에서 원심 분리한 후 약 200 成의 상층 액을 회수하여 2-propanol 200 成와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15 분간 방치하였다. 이를 다시 13, 000 rpm에서 원심 분리한 후 80% EQH로 수세하고 3분간 vaccum pump에서 건조하여 RNA를 추출하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 기기는 열탕추출기 (대웅, Korea), microwave oven (LG, Korea), rotary vacuum evaporator, vaccum pump (Biichi B-480, Switzerland), freeze dryer (EYELA FDU-540, Co., Japan), CO2 incubator (Forma scientific Co.z U.S.A.), clean bench (Vision scientific Co., Korea), autoclave (Sanyo, Co., Japan), micro-pipet (Gilson, Co., France)z water bath (Vision scientific Co.z Korea), plate shaker (Lab-Line, Co., U.S.A), vortex mixer, heating block (Vision scientific. Co., Korea), spectrophotometer (Shimazue, Co., Japan), centrifuge (한일. Korea), deep-freezer (Sanyo, Co” Japan), plate shaker (Lab-Line, U.S.A), ice-maker (Vision scientific Co.z Korea), ELISA reader (Molecular Devices, Co., U.S.A.), 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Co.z U.S.A>flow cytometer (Becton Dickinson, U.S.A) 등을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 양혈제습탕 (YHJST)의 구성 약재들은 대전대학교 부속한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하였고, 그 내용과 분량은 다음과 같다.
데이터처리
- 다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean 士 standard error로 기록하였고, 유의성 검증은 Student's T-test 분석법을 이용하여 결정하였다.
이론/모형
- Mouse lung fibroblast cells (mLFCs) were cultured with various concentration of YHJST extract for 48 hr and the cell viability was measured by SRB method. The results were presented by the mean ± S.
- 있다U). PMA와 A23187로 활성화된 HMC-1에서 TNF-a mRNA 유전자 발현을 real-time PCR 방법에 의하여 정량적으로 비교하였다. 대조군의 RQ값이 1 일때, CsA는 0.
- 기술된 것에 따라 Real-Time PCRe Applied (Applied Biosystems, USA) 을 사용하면서 수행되었다. probes 는 6-carboxy也uorescein으로 라벨을 붙이고, beta-actin cDNA는 모든 cDNA과 같은 양을 포함한 각 cDAN 표본을 AmpliTaq Gold DNA Polymerase® 포함시켜 TaqMan Universal PCR로 증폭시켰다.
성능/효과
- 의해서 비만세포에서 분비된다. HMC-1에서 분비되는 히스타민 양을 측정한 결과, 정상군은 5.2 ± 0.8 (nmol)로 나타난 반면, 대조군 79.7 ± 4.9 (nmol)로 나타나 큰 폭으로 증가하였다. 반면 비교대조군인 CsA 투여군은 23.
- -6) 및 키모카인 (IL-8)의 mRNA 발현을 유의적으로 억제하였다. YHJST는 PMA와 A23187에 의하여 활성화된 비만 세포에서 NF-kB 프로모터활성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 200 陽/ m« 농도에서는 유의성 있는 억제 효과를 나타내었다.
- YHJST의 세포독성을 측정한 결과, 1000, 500, 250 , 125, 62.5, 31.2, 15.6, 7.8 娼/戒 농도에서 생존율이 각각 100 土, 5.2, 70.4 + 0.4, 85.9 + 04 99.4 ± 0.2, 100.0 + 0.3, 1027 ± 0.6, 105.5 + 0.4, 95.7 ± 0.0 %로 나타나, 250 陽/皿 이하 농도에서는 유의성 있는 감소는 나타나지 않았다 (Fig. 1). 그러므로 본 연구에서는 200 姻/成이하의 농도를 사용하여 실험을 진행하였다.
- 3). 이러한 결과는 YHJST가 TNF-a의 발현 억제를 통하여 비만세포의 염증성 반응을 억제함을 보여주고 있다.
- 1 (nmol)로 나.타나 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었고, YHJST 100, 50, 10您/M 농도 투여군에서는 각각 36.9±1.5, 42.0±9.4, 78.3+0.4 (nmol)로 나타나 이 역시 대조군에 비하여 50 娼/i戒 이상의 농도에서 유의성 있게 (***p<0.001) 감소되었다 (Fig. 2). 이러한 결과는 YHJST가 활성화된 비만세포의 히스타민 분비 억제능이 있음을 보여주고 있다.
- YHJST의 사이토카인 발현억제 작용이 NF-kB를 경유하는지를 알아보기 위하여 NF-kB promoter 활성에 관한 효과를 측정하였다. PMA를 처리한 결과 NF-kB promote!활성화에 의한 luciferase 활성이 PMA를 처리하지 않은 군에 비해 4배 증가하였으며, 이때 YHJST(10z 100, 200 姻/ n粉를 동시에 처리한 결과 luciferase 활성이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. YHJST 100 娼/i戒 농도에서 대조군에 비하여 약 50% 정도, 200 傩/戒 농도에서 약 70% 정도 유의성 있게 (*p<0.
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