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문제 정의
- 낙엽송층버섯의 항염활성을 규명하고자 NO생성에 미치는 작용을 측정하고 그 활성성분을 분리한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 7 세포를 20시간 동안 완전히 활성화시킨 후에 배양액 중의 LPS를 완전히 제거한 후에 새로운 배지로 교환하고 분리된 화합물을 처리하였다. 20시간 후에 배양액 중에 생성된 nitrite량을 Griess 반응으로 측정하여 세포내에 존재하는 iNOS 에 대한 NO생성저해를 조사하였다. 양성대조구로 L-arginine과 의 기질경쟁에 의해 iNOS에 대해 저해활성을 나타내는 L-NMMA 을 사용하였다.
- NO 합성의 지표로 nitrite(NOp 생성량을 측정하였다. 96 well 에 세포배양한 배지 상등액 100 况를 넣고 Griess reagent A 75 ul, B 75u昭을 첨가하여 37℃에서 5분간 배양 시킨 후 570nm에서 microplate reader로 흡광도를 측정한다.
- 3) . NO생성 저해효과를 보이는 화합물을 단리하기 위하여 헥산 분획으로부터 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 화합물 1■을 분리하였다(Fig. 1). EI-MS와 *C-NMR로부터 화합물 1은 C28H40O(M+: 392.
- O 생성 저해 기작을 알아보기 위해 먼저 효소에 대한 분리된 화합물의 영향을 알아보았다. LPS로 활성화된 iNOS는 수간에서 수일 동안 활성을 유지한다.
- 각 분획(lOug/m/)의 단독 투여와 LPS와 병용 투여에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포의 배양액 중에 존재하는 nitrite(NO兌의 양을 Griess 시약을 사용하여 측정하였다. 각 분획을 단독 처리했을 때의 nitrite(NC0의 양은 물분획에서 유의성 있는 증가를 보였으며 다른 분획에서는 변화가 없거나 배양액과 유사한 정도의 변화를 나타내었다.
- 96 well 에 세포배양한 배지 상등액 100 况를 넣고 Griess reagent A 75 ul, B 75u昭을 첨가하여 37℃에서 5분간 배양 시킨 후 570nm에서 microplate reader로 흡광도를 측정한다. 검량선 작성을 위해 sodium nitrite(NaNC)2)를 표준품으로 하여 비교하였다.
- 농축된 액을 동결 건조하여 메탄올 추출물 297 g을 얻었다. 그 후 메탄올 추출물을 열수에 녹여 물 가용부분 70 g과 물 불용부분 220 &으로 나누었다. 물 불용부분은 다시 헥산으로 추출하여 헥산 분 획 24.
- LPS로 활성화된 iNOS는 수간에서 수일 동안 활성을 유지한다. 그러므로 LPSQ U以m/)로 RAW 264.7 세포를 20시간 동안 완전히 활성화시킨 후에 배양액 중의 LPS를 완전히 제거한 후에 새로운 배지로 교환하고 분리된 화합물을 처리하였다. 20시간 후에 배양액 중에 생성된 nitrite량을 Griess 반응으로 측정하여 세포내에 존재하는 iNOS 에 대한 NO생성저해를 조사하였다.
- 7 세포로부터 NO생성 저해활성에 미치는 작용을 실험한 결과, 메탄올 추출물이 30 u以m/의 농도에서 75%의 저해활성을 보였다. 메탄올 추출물에 대하여 용매 분획을 실시하고, 메탄올 주줄물과 각 분획을 lOug/m起의 농도에서 NO 생성저해효과를 측정하였다. 비극성인 헥산분획이 NO생성을 저해하는 효과가 가장 우수하였고, 극성인 물 분획은 반대로 NO생성을 촉진하는 결과를 얻었다(Fig.
- 5 对俱 cells/m/ 로 하여 48 well plate에 분주하여 24시간 동안 부착시키고 새로운 1% FBS DMEM으로 교환한 다음 LPS를 1 ug/mZ이 되도록 가하였다. 시료는 최종농도 0.1% DMSO 용액이 되도록 LPS와 동시에 배양액에 0~30 ug/nH의 농도로 가한 다음 37℃, 5% CO2 배양기에서 1S시간 배양하여 각 well의 배양액으로 유리된 NO 의 생성 정도를 측정하였다. 기질저해를 평가하기 위하여 위와 같은 방법으로 LPS를 1 ug/m梏을 넣고 20시간 배양한 후에 상등액을 제거하고 PBSS.
- 세척한 후에 DMEM으로 교환하였다. 시료를 0~40 ug/mZ의 농도로 가하고 20시간 배양하여 유리된 NO 의 생성 정도를 측정하였다.
- 낙엽송층버섯의 NO 생성 저해작용을 확인한 결과, 헥산분획 물로부터 농도 의존적인 저해 활성이 관찰되었다. 이 활성분획으로부터 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 에르고스테롤 유도체인, ergosta-4, 6, 8 (14), 22 -tetraen-3-one을 단리하였다. 이 화합물은 iNOS의 활성화를 억제하며, K為 값은 29.
대상 데이터
- 5554), 컬럼크로마토그래피용 담체로는 Kieselgel 60(70-230 mesh, Merck)을 사용하였다. NMR spectrume Bruker, Advance 500 spectrometer, GC-MS는 JEOL, JMS- AX505WA, HP5890 Series II를 사용하여 측정하였다.
- 낙엽송층버섯은 2003년 12월 서울시 소재 백제건재약업사에서 구입하였고 표본(SMP0505)은 숙명여자대학교 생약표본실에 보관하였다.
- 박 층크로마토그래피는 pre-coated TLC plate silicagel 60F254 (Merck. Art. 5554), 컬럼크로마토그래피용 담체로는 Kieselgel 60(70-230 mesh, Merck)을 사용하였다. NMR spectrume Bruker, Advance 500 spectrometer, GC-MS는 JEOL, JMS- AX505WA, HP5890 Series II를 사용하여 측정하였다.
- 20시간 후에 배양액 중에 생성된 nitrite량을 Griess 반응으로 측정하여 세포내에 존재하는 iNOS 에 대한 NO생성저해를 조사하였다. 양성대조구로 L-arginine과 의 기질경쟁에 의해 iNOS에 대해 저해활성을 나타내는 L-NMMA 을 사용하였다. 동일하게 처리한 양성대조구 L-NMMA 10ug/m/에서 43%의 저해활성을 나타내었고, 화합물 1은 iNOS의 유도가 완료된 후에 NO생성을 유의성있게 저해하였으며 30uM 이상의 농도에서 L-NMMA 10ug/mZ과 유사한 정도의 저해활성을 보였다(Fig.
데이터처리
- of three experiments. Significantly different from LPS control (*; p<0.01) as determined by the Student's t-test.
- of three experiments. Significantly different from LPS control (*; pvO.Ol, **; p<0.001) as determined by the Student's t-test.
- 모든 실험결과는 mean土S.D로 나타내었으며 자료분석은 Student's t-test를 이용하여 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- 각 분획을 단독 처리했을 때의 nitrite(NC0의 양은 물분획에서 유의성 있는 증가를 보였으며 다른 분획에서는 변화가 없거나 배양액과 유사한 정도의 변화를 나타내었다. 각 분획과 LPS를 동시에 처리했을 때, 물분 획을 제외한 모든 분획에서 저해활성을 나타냈으며 헥산분획에서 가장 강한 저해활성이 관찰되었다(Fig. 2).
- 낙엽송층버섯의 NO 생성 저해작용을 확인한 결과, 헥산분획 물로부터 농도 의존적인 저해 활성이 관찰되었다. 이 활성분획으로부터 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 에르고스테롤 유도체인, ergosta-4, 6, 8 (14), 22 -tetraen-3-one을 단리하였다.
- 낙엽송층버섯이 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포로부터 NO생성 저해활성에 미치는 작용을 실험한 결과, 메탄올 추출물이 30 u以m/의 농도에서 75%의 저해활성을 보였다. 메탄올 추출물에 대하여 용매 분획을 실시하고, 메탄올 주줄물과 각 분획을 lOug/m起의 농도에서 NO 생성저해효과를 측정하였다.
- 양성대조구로 L-arginine과 의 기질경쟁에 의해 iNOS에 대해 저해활성을 나타내는 L-NMMA 을 사용하였다. 동일하게 처리한 양성대조구 L-NMMA 10ug/m/에서 43%의 저해활성을 나타내었고, 화합물 1은 iNOS의 유도가 완료된 후에 NO생성을 유의성있게 저해하였으며 30uM 이상의 농도에서 L-NMMA 10ug/mZ과 유사한 정도의 저해활성을 보였다(Fig. 6). 따라서 낙엽송층버섯으로부터 분리한 화합물 1은 iNOS 유도 전후 단계에서 모두 NO생성 저해효과를 나타내었다.
- 6). 따라서 낙엽송층버섯으로부터 분리한 화합물 1은 iNOS 유도 전후 단계에서 모두 NO생성 저해효과를 나타내었다.
- 메탄올 추출물에 대하여 용매 분획을 실시하고, 메탄올 주줄물과 각 분획을 lOug/m起의 농도에서 NO 생성저해효과를 측정하였다. 비극성인 헥산분획이 NO생성을 저해하는 효과가 가장 우수하였고, 극성인 물 분획은 반대로 NO생성을 촉진하는 결과를 얻었다(Fig. 3) . NO생성 저해효과를 보이는 화합물을 단리하기 위하여 헥산 분획으로부터 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 화합물 1■을 분리하였다(Fig.
- 헥산분획에서 분리된 화합물 1은 단독 투여에 의한 NO생성은 대조군에 비해 차이가- 없었으나, LPS와 동시에 처리했을 때는 농도 의존적인 저해 활성이 관찰되었으며 화합물 1의 IC50 값은 29.7 uM로 나타났다(Fig. 3). 또한 이들은 대조구에 비해 세포의 생존율에 큰 차이를 보이지 않았으므로 세포의 생존에는 영향을 미치지 않고 N。생성을 저해함을 알 수 있었다(Fig.
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