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문제 정의
- 여기서 덱사메타손은 BMSCs의골분화에 매우 중요하게 작용하는 생리활성물질이다.3"4° 따라서 본 실험에서는 in vivo 상에서 골수 간엽 줄기세포와 골 유도물질인 덱사메타손의 존재 여부에 따라 골분 화의 가능성을 조사하였다. MPEG-PCL 다이블록 공중합체를 이용하여 새로운 솔-젤 상전이 거동을 보이는 온도 감응성 재료를 합성하였으며 NMR을 통해분자량을 분석하였다.
- 본 연구에서는 합성된 공중합체에 BMSCs를 파종시키고 덱사메타손을 투여하여 골조직 공학에 응용하고자 하였다. 저분자량 MPEG(Mn=750 g/mole)를 개시 제로 하여 lCL의 개환 중합을 통해 수용액 상에서 새로운 솔-젤-솔 상전이 거동을 보이는다이블럭 공중합체를 합성하였고 이를 수용 액상에서 3 ~20 wt% 로 용해시켜 실온에서 솔 상태를 유지하고, 31-53 ℃의 범위에서 젤을 형성하며, 53 ℃ 이상에서는 다시 솔 상태의 특성을 보임을 확인하였다.
제안 방법
- 또한, 체온 부근에서의 솔- 젤 전이를 확인하기 위하여 산화에틸렌 가스를 이용하여 450- 1000 mg/L의 농도로 3~7시간 멸균을 실시한 후 20 wt% 농도를 선택하여 실온에서 완전 용해시킨 후 피하 주사기를 사용하여 고분자 1 mL 용액을 쥐의 피하에 주사하였다. 30일 후 주사 부위를 절제하여 젤 형성을 확인하였다.
- MPEG-PCL 다이블록 공중합체를 이용하여 새로운 솔-젤 상전이 거동을 보이는 온도 감응성 재료를 합성하였으며 NMR을 통해분자량을 분석하였다. BMSCs는 마우스로부터 분리하여 배양하였으며, in vivo 환경에서 조직공학적 골 형성을 관찰하기 위하여 면역결핍 쥐로 실험하여 조직학적 염색을 실시하였다.
- 블록 고분자의 솔-젤 상전이 거동. Figures 3과 4는 합성된 고분자의 수용액상에서의 온도에 따른 상전이 거동을 확인하기 위하여 농도별로 고분자를 증류수에 용해시킨 후 일정 온도의 간격에서 바이알을 기울임으로써 바이알 내에서 흐름 특성을 통해 솔-젤 상변화를 확인하였다.
- vivo 환경에서의 골 형성 효과. In vivo 환경 에서의 조직공학적 골형성을 관찰하기 위해 쥐의 피하조직에 주입하고 서로 다른 함량의 덱사메타손을 함유한 젤과 BMSCs를 함께 이식하였다 (Table 1). 4주가 지난 후 다시 절개하여 형성된 젤을 10% 포르말린에 고정하였다.
- 3"4° 따라서 본 실험에서는 in vivo 상에서 골수 간엽 줄기세포와 골 유도물질인 덱사메타손의 존재 여부에 따라 골분 화의 가능성을 조사하였다. MPEG-PCL 다이블록 공중합체를 이용하여 새로운 솔-젤 상전이 거동을 보이는 온도 감응성 재료를 합성하였으며 NMR을 통해분자량을 분석하였다. BMSCs는 마우스로부터 분리하여 배양하였으며, in vivo 환경에서 조직공학적 골 형성을 관찰하기 위하여 면역결핍 쥐로 실험하여 조직학적 염색을 실시하였다.
- 개 시제와 합성 고분자의 몰 비에 대한 분자량은 내부 기준시료인 0.05 wt%의 테트라메틸 실란(TMS)을 포함한 CDCh (Merck, Germany)를 용매로 하여 ^-NMRCBruker 300, 500 MHz, USA)를 통하여 분석하였다. 또한 미셀임계농도(critical micelle concentration, CMC) 를 통해 MPEG-PCL 공중합체가 젤을 이루는 거동에 대해 분석하였다.
- 4주가 지난 후 다시 절개하여 형성된 젤을 10% 포르말린에 고정하였다. 고정된 지지체를 파라핀 블록으로 제작하여 3 皿 두께로 자른 후 슬라이드에 고정하고 조직학적 평가를 하기 위하여 H&E, 본쿠사 및 오스테오칼신 염색을 실시하였다.
- 05 wt%의 테트라메틸 실란(TMS)을 포함한 CDCh (Merck, Germany)를 용매로 하여 ^-NMRCBruker 300, 500 MHz, USA)를 통하여 분석하였다. 또한 미셀임계농도(critical micelle concentration, CMC) 를 통해 MPEG-PCL 공중합체가 젤을 이루는 거동에 대해 분석하였다.
- 1 wt%로 고정하여 37 ℃ 진동 항온조에 보관하여 젤의 분산 여부를 관찰하였다. 또한, 체온 부근에서의 솔- 젤 전이를 확인하기 위하여 산화에틸렌 가스를 이용하여 450- 1000 mg/L의 농도로 3~7시간 멸균을 실시한 후 20 wt% 농도를 선택하여 실온에서 완전 용해시킨 후 피하 주사기를 사용하여 고분자 1 mL 용액을 쥐의 피하에 주사하였다. 30일 후 주사 부위를 절제하여 젤 형성을 확인하였다.
- H&E, 본쿠사, 오스테오칼신 염색을 하였다. 먼저 골 형성을 확인하기 위하여 세포의 배열 및 형태학적 변화를 관찰하기 위해 모든 조직 절편을 핵과 세포질을 구분해서 볼 수 있는 H&E 염색을 하였다. Figure 7에서 보면 미분해된 젤을 관찰할 수 있었는데 이는 합성한 젤이 체내에서 분해가 완전히 이루어지지 않았음을 나타낸다.
- 모든 과정은 고순도 질소 하에서 실시하였다. 반응 후 미반응 단량체나 개 시제를 제거하기 위하여 800 mL의 헥산에 반응물을 서서히 떨어뜨리면서 침전시켜주었다. 침전물은 MC에 녹여 거름종이로 거른 후 회전 증발기를 통하여 용매를 제거하고 감압 하에서 건조시켰다.
- 젤의 안정성 및 동물 실험. 수용액 내에서의 젤의 안정성을 확인하기 위하여 바이알 내에서 20 wt%의 고분자를 실온에서 용해시킨 후 37 ℃에서 젤을 형성한 후 젤 위에 2 mL의 증류수를 넣어 전체 농도를 0.1 wt%로 고정하여 37 ℃ 진동 항온조에 보관하여 젤의 분산 여부를 관찰하였다. 또한, 체온 부근에서의 솔- 젤 전이를 확인하기 위하여 산화에틸렌 가스를 이용하여 450- 1000 mg/L의 농도로 3~7시간 멸균을 실시한 후 20 wt% 농도를 선택하여 실온에서 완전 용해시킨 후 피하 주사기를 사용하여 고분자 1 mL 용액을 쥐의 피하에 주사하였다.
- 블록 공중합체의 합성. 온도 감응성 약물 전달체를 준비하기 위하여 친수성의 MPEG 와 소수성의 PCL로 구성된 블록 공중합체를 합성하였다. MPEG(< =750 g/mole)을 고분자 개시 제로 하여 블록공중합체를 개환중합을 이용하여 98%의 정량적 수율로 합성하였으며 1.
- 이러한 덱사메타손을 함유한 젤을 이식한 지 4주가 지난 후 절개하여 형성된 젤을 분리하고 10% 포르말린 수용액으로 고정한 후 3 um로 절단하여 슬라이드에 고정시키고 골분화 정도를 확인하고자 H&E, 본쿠사, 오스테오칼신 염색을 하였다. 먼저 골 형성을 확인하기 위하여 세포의 배열 및 형태학적 변화를 관찰하기 위해 모든 조직 절편을 핵과 세포질을 구분해서 볼 수 있는 H&E 염색을 하였다.
- 저분자량 MPEG(Mn=750 g/mole)를 개시 제로 하여 lCL의 개환 중합을 통해 수용액 상에서 새로운 솔-젤-솔 상전이 거동을 보이는다이블럭 공중합체를 합성하였고 이를 수용 액상에서 3 ~20 wt% 로 용해시켜 실온에서 솔 상태를 유지하고, 31-53 ℃의 범위에서 젤을 형성하며, 53 ℃ 이상에서는 다시 솔 상태의 특성을 보임을 확인하였다. 이를 이용하여 합성된 공중합체에 BMSCs와함량별 덱사메타손을 파종하여 골 형성이 되었는지 조직학적 평가를 통해 알아보았다. H&E 염색 사진을 통해 덱사메타손의 함량이 높은 젤에서 더 많은 뼈세포가 유도되어 밀집되어 있음을 관찰할 수 있었다.
- 이에 일련의 전 연구에서는 생체적합 적이며 생분해성 특징을 갖는 온도감응성 수화 젤을 메톡시 폴리 (에틸렌 글라이콜) (MPEG)을개시제로 카프로락톤(CL) 의 개환중합을 통해 합성하여 솔-젤 상전이 현상의 특징을 갖는 것을 확인하게 되어 15-23 조직공학적 골 형성을 위해 수화젤, 골 형성 생리활성물질인 덱사메타손 그리고 골수 간엽 줄기세포(bone marrow stem cells, BMSCs)가 골 형성에 미치는 영향을 확인하려 하였다. 여기서 덱사메타손은 BMSCs의골분화에 매우 중요하게 작용하는 생리활성물질이다.
- In vivo 환경에서의 골 형성에 관한 조직학적 평가. 젤에 BMSCs와함량에 따른 덱사메타손을 파종하여 면역결핍 쥐의 피하를 절개한 후 주입하였다. 여기서 BMSCs를 뼈로 분화시키는데 작용하는 덱사메타손은 인체에 존재하는 부신피질호르몬 유사체로서 코르티코스테로이드에 속하는 약물로 항염증제 등으로 널리 사용되고 있는데 이의 약리작용 기전은 직접적인 # 흡수 억제작용에 의해 조골세포의 성장을 촉진하고, 골 형성 자극 활성을 갖는 특징이 있다.
- 조직에서 칼슘 형성을 본쿠사 염색을 통하여 알아보았다(Figure 8). 본쿠사 염색은 비탈 회 표본염색으로서 조골세포가 가지는 인산염이나 탄산염 형태로 존재하는 칼슘을 실버나이트레이트로 처리하면 칼슘과 은이 은염으로 치환되고 이것은 강한 빛 즉 환원제에 의해 흑색의 금속 은으로 치환되는 것이다.
- 29의 매우 좁은 분산도와 이론적 분자량과 거의 유사한 분자량을 갖고 있음을 1H-NMR을 통해 확인하였다. 중합된 MPEG-PCL 블록 공중합체의 특정 관능기에 대한 분자구조는 NMR을 통해서 분석하였다(Figure 2). MPEG의 반복되는 CH2의 프로톤은 3=3.
- 체온에서의 젤 형성 및 일정 기간 후의 젤의 보전을 확인하기 위하여 멸균된 MPEG-PCL# 증류수에 20 wt%로 희석하여 용해시킨 후 2 mg 용액을 쥐의 피하에 주사하고, 30일 후 주사 부위를 절제하여 젤 형성을 확인하였다(Figure 6). 피하에 주사한 솔은 주입 후 수초 이내에 젤이 형성됨을 확인할 수 있었고, 30 일 후에도 주사 부위를 절제하였을 때 젤이 분산 없이 잘 보전됨을 확인하였다.
- 젤의 안정성 및 동물실험. 형성된 젤의 무한 희석 용액 상에서의 젤의 안정성을 확인하기 위하여 MPEG-PCL 20 wt%를 37 ℃ 에서 젤을 형성 후 2 mL의 증류수를 첨가하여 최종 농도가 0.1 wt%가 되도록 하여 100 rpm, 37 ℃의 진동 항온 조에서 젤의 분산 여부를 확인하였다. Figure 5에서처럼 합성된 고분자 MPEG- PCLe 젤의 분산 없이 약 1달간 젤을 유지하고 있었다.
대상 데이터
- CL의 중합 촉매로서 HC1 . Et2O (Aldrich) 는 정제과정 없이 사용하였다. MPEG-PCL의 반응용매로서 사용된 메틸렌클로라이드(MC, Jin Chem.
- 시약 및 재료. 개 시 제로서 MPEG (Aldrich, Milwaukee, WI, USA) 는 평균분자량 750 g/mole를 사용하였고 반응 단량체로서 CL(Aldrich)은 칼슘하이드라이드(CaHa Aldrich)하에서 감압 정제하여 사용하였다. CL의 중합 촉매로서 HC1 .
- 골수 간엽 줄기세포의 배양 BMSCs는 10% 우태혈청 (FBS, Gibco BRL Grand Island, NY, USA) 과 1% 항생제 (100 units/mL 페니실린과 100 jig/mL 스트렙토마이신, Gibco BRL)를 첨가한 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM, Gibco BRL) 에 부유시킨 후 콜라겐을 코팅한 세포배양 플라스크에 분주하였다. 세포를 1 X 105 cells/cm2 의 농도로 37 ℃, 5%의 CO2 세포배양기에서 배양한 후 2일에 한 번씩 배양액을 교체해 주었다.
성능/효과
- 이를 이용하여 합성된 공중합체에 BMSCs와함량별 덱사메타손을 파종하여 골 형성이 되었는지 조직학적 평가를 통해 알아보았다. H&E 염색 사진을 통해 덱사메타손의 함량이 높은 젤에서 더 많은 뼈세포가 유도되어 밀집되어 있음을 관찰할 수 있었다. 이는 BMSCs를 뼈로 분화하는데 작용하는 덱사메타손의 영향 때문이라고 사료된다.
- 온도 감응성 약물 전달체를 준비하기 위하여 친수성의 MPEG 와 소수성의 PCL로 구성된 블록 공중합체를 합성하였다. MPEG(< =750 g/mole)을 고분자 개시 제로 하여 블록공중합체를 개환중합을 이용하여 98%의 정량적 수율로 합성하였으며 1.29의 매우 좁은 분산도와 이론적 분자량과 거의 유사한 분자량을 갖고 있음을 1H-NMR을 통해 확인하였다. 중합된 MPEG-PCL 블록 공중합체의 특정 관능기에 대한 분자구조는 NMR을 통해서 분석하였다(Figure 2).
- 결론적으로 합성된 공중합체를 통해 생체 내에서 새로운 골조직을 형성한다는 것을 다양한 염색법을 통해 확인하였다. 이는 BMSCs와 덱사메타손이 새로운 골조직의 형성에 매우 우수한 효과를 나타내는 것으로 사료된다.
- 골수 간엽 줄기세포의 배야 BMSCs* 4번 계대 배양한 후 세포를 관찰한 결과 전형적인 BMSCs의 형태로 나타났으며, 4주 배양하여 실험에 필요한 양의 세포를 얻을 수 있었다.
- 이는 BMSCs를 뼈로 분화하는데 작용하는 덱사메타손의 영향 때문이라고 사료된다. 또한 본쿠사 염색을 통해서 골세포가 가지는 칼슘 형성 정도를 확인할 수 있었는데 덱사메타손의 함량이 증가할수록 칼슘 침착 영역이 증가함을 확인할 수 있었다. 면역화학적 염색인 오스테오칼신 염색에서도 덱사메타손의 함량이 증가할수록 강한 오스테오칼신 염색영역을 보였다.
- 합성된 모든 블록 공중합체는 신호 b와 d 의 면적비가 정확히 3 : 2의 비율을 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과로부터 블록고분자는 MPEG를 개시 제로 사용하여 단량체의 개환중합으로 합성된 것을 확인할 수 있었다.01723
- 젤만 존재하는 것에서는 약간의 칼슘 영역을 확인할 수 있었지만 BMSCs와 덱사메타손의 함량이 증가할수록 칼슘 침착 영역이 증가하는 경향을 보였다. 이를 단위면적으로 나누어 정량하였는데 덱사메타손의 양이 1, 5, 10 mg이 첨가될수록 칼슘이 각각 7.6, 13.7, 19.4% 형성됨을 확인할 수 있었다. 면역학적 염색법인 오스테오칼신 염색은 뼈와 상아질에서 존재하는 비콜라겐성 단백질로 세포막 주위에 갈색으로 염색되는 방법이다.
- 저분자량 MPEG(Mn=750 g/mole)를 개시 제로 하여 lCL의 개환 중합을 통해 수용액 상에서 새로운 솔-젤-솔 상전이 거동을 보이는다이블럭 공중합체를 합성하였고 이를 수용 액상에서 3 ~20 wt% 로 용해시켜 실온에서 솔 상태를 유지하고, 31-53 ℃의 범위에서 젤을 형성하며, 53 ℃ 이상에서는 다시 솔 상태의 특성을 보임을 확인하였다. 이를 이용하여 합성된 공중합체에 BMSCs와함량별 덱사메타손을 파종하여 골 형성이 되었는지 조직학적 평가를 통해 알아보았다.
- 본쿠사 염색은 비탈 회 표본염색으로서 조골세포가 가지는 인산염이나 탄산염 형태로 존재하는 칼슘을 실버나이트레이트로 처리하면 칼슘과 은이 은염으로 치환되고 이것은 강한 빛 즉 환원제에 의해 흑색의 금속 은으로 치환되는 것이다. 젤만 존재하는 것에서는 약간의 칼슘 영역을 확인할 수 있었지만 BMSCs와 덱사메타손의 함량이 증가할수록 칼슘 침착 영역이 증가하는 경향을 보였다. 이를 단위면적으로 나누어 정량하였는데 덱사메타손의 양이 1, 5, 10 mg이 첨가될수록 칼슘이 각각 7.
- 또한 덱사메타손의 양이 증가할수록 매크로파지의 증가를 확인할 수 있었는데 이는 젤이 어느 정도의 염증반응을 일으키기 때문이라고 사료된다. 즉 골유도물질인 덱사메타손의 양이 많아질수록 더 많은 뼈세포가 유도되어 밀집되어 있음을 관찰할 수 있었다.
- 절제하여 젤 형성을 확인하였다(Figure 6). 피하에 주사한 솔은 주입 후 수초 이내에 젤이 형성됨을 확인할 수 있었고, 30 일 후에도 주사 부위를 절제하였을 때 젤이 분산 없이 잘 보전됨을 확인하였다.
- 70 ppm에서 관찰하였다. 합성된 모든 블록 공중합체는 신호 b와 d 의 면적비가 정확히 3 : 2의 비율을 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과로부터 블록고분자는 MPEG를 개시 제로 사용하여 단량체의 개환중합으로 합성된 것을 확인할 수 있었다.
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