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문제 정의
- 환경조건의 최적화를 통한 미생물의 활성 증대로 오염물질을 효율적으로 제거하는 bioremediation은 크게 두 가지 방법으로 구분되는데, 서식하는 토착 미생물의 활성을 촉진시키기 위해 영양염, 전자수용체, 온도, pH 등을 조절하는 방법인 biostimulation과 자연계에서 분리한 오염물에 대한 분해능이 우수한 미생물이나 유전공학적으로 변형된 미생물을 첨가하는 방법인 bioaugmentation이 있다. 본 연구에서는 bioaugmentation을 이용한 처리를 목적으로 하여 디젤에 오염된 토양으로부터 디젤 분해능을 가진 균주를 분리동정하고, 분리 균주의 특성 및 최적 성장조건을 분석하였으며 또한 인위적으로 토양을 디젤로 오염시킨 microcosm에 분리 균주를 적용하여 미생물학적 유류오염 복원의 현장 적용 가능성을 확인하였다.
제안 방법
- SJD2 균주와 SJD4 균주를 LB 배지에 접종하여 20℃, 25℃, 30℃, 37℃에서 진탕 배양하면서 생장곡선을 작성하였다 [Fig. 1]. 두 균주 모두 25-37℃에서 안정적인 성장을 나타내었다.
- 디젤 분해능이 있는 균주를 분리하기 위해 디젤로 오염된 토양을 채취하여 시료로 사용하였으며, 유일 탄소원으로 디젤이 첨가된 디젤 분해 평판 배지(Bushnell-Haas Broth 3.27 g/l, 0.25% Tween80, 2% diesel oil, agar 18g/l)에 시료를 접종하고 37℃에서 5일간 배양한 후 배지에 colony를 형성한 균주를 선별하였다8).
- 디젤분석을 위한 Gas Chromatography(HP 6890, USA)는 HP-5 capillary column[30m× 0.32mm (φ) 0.25um(film thickness)]을 사용하여 injector temperature 280℃, detecter temperature 300℃, 초기온도 60℃에서 5분간 정치, 분당 10℃ 승온, hold time 280℃에서 5분으로 설정하였으며, carrier gas로 N2를 사용하였고 flow rate를 2.0㎖/min에 맞추어 최종적으로 FID(Flame Ionization Detecter)로 분석하였다. 시료는 autosampler를 이용하여 각 1㎕씩 주입하였다.
- 25% Tween80, 2% diesel oil) 10㎖을 넣고 LB 배지에서 전 배양한 균주를 200㎕ 접종한 후, 37℃, 150rpm에서 5일간 배양하였다. 배양후 배양액 내의 잔류 디젤량을 측정하기 위하여 배양액 10㎖에 20㎖의 dichloromethane(Sigma, USA)을 첨가하여 1분씩 3회 sonication하였으며, 이후 상층부의 수용성 배양액을 제거하고 여분의 수분을 무수황산나트륨을 첨가하여 제거한 후, Gas Chromatography를 이용하여 배양액내 잔류 디젤의 양을 분석하였다.
- 본 연구에서는 디젤이 유일한 탄소원으로 사용될 수 있도록 조성한 고체배지를 이용하여 디젤로 오염된 토양으로부터 최종적으로 2종의 디젤분해세균을 분리, 동정하고, 이들의 디젤분해특성 및 최적생장조건, 디젤 오염 모방 microcosm을 이용한 디젤분해능 등을 분석하였다. 분리된 두 균주, SJD2와 SJD4의 경우, 디젤유가 20,000ppm으로 조성된 액체배지에서 각각 29.
- 분리 균주의 유일 탄소원으로 이용되는 디젤의 최적 분해 농도를 확인하기 위하여 디젤의 농도를 0.1%, 1%, 2%, 5%로 조정한 디젤 액체 배지에 균주를 접종하여 5일간 배양시킨 후, 배양액 1 ㎖을 취하여 흡광도를 측정하였다[Fig. 3]. SJD2균주는 2%의 디젤 농도에서 가장 높은 생장 활성을 보였으나 5% 농도에서는 생장률이 다소 감소하였다.
- 분리 세균의 계통진화학적 분류를 위하여 세균으로부터 chromosomal DNA를 추출한 후, PCR을 통하여 16s-rDNA를 증폭하였다. 증폭을 위한 primer는 세균의 공통 primer인 9F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), 1542R (5'AGAAAGGAGGTGATCCAGCC3')를 사용하였다9).
- 분리균주의 디젤 분해능을 확인하기 위하여 우선 septum bottle에 디젤 액체 배지(Bushnell-Haas Broth 3.27g/l, 0.25% Tween80, 2% diesel oil) 10㎖을 넣고 LB 배지에서 전 배양한 균주를 200㎕ 접종한 후, 37℃, 150rpm에서 5일간 배양하였다. 배양후 배양액 내의 잔류 디젤량을 측정하기 위하여 배양액 10㎖에 20㎖의 dichloromethane(Sigma, USA)을 첨가하여 1분씩 3회 sonication하였으며, 이후 상층부의 수용성 배양액을 제거하고 여분의 수분을 무수황산나트륨을 첨가하여 제거한 후, Gas Chromatography를 이용하여 배양액내 잔류 디젤의 양을 분석하였다.
- 0㎖/min에 맞추어 최종적으로 FID(Flame Ionization Detecter)로 분석하였다. 시료는 autosampler를 이용하여 각 1㎕씩 주입하였다. 분해효율은 초기 디젤유의 양을 배양후 잔류 디젤유의 양으로 나눈 값의 백분율로 나타내었다.
- yeast extract는 영양배지에 첨가되어 미생물의 탄소원과 영양원으로 작용하며 미생물의 생장에 영향을 미치는 성분이 다량 함유되어 있기 때문에 미생물이 탄소원으로 디젤을 이용하지 않고 yeast extract를 이용했을 때에는 균주가 디젤을 분해한다고 보기 어려워진다. 이러한 이유로 본 연구에서는 균주의 유일 탄소원으로 디젤만이 이용될 수 있도록 디젤 분해 균주의 분리에 이용하는 배지의 조성에서 yeast extract를 제외하여 실험을 진행하였다.
- 증폭을 위한 primer는 세균의 공통 primer인 9F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), 1542R (5'AGAAAGGAGGTGATCCAGCC3')를 사용하였다9). 증폭된 DNA는 (주) 솔젠트에 의뢰하여 16s rDNA의 염기서열을 분석하였으며, 이후 NCBI(National Center for Biotechnology Intormation) BLAST 염기서열 분석을 통하여 동정하였다.
대상 데이터
- 분리 세균의 계통진화학적 분류를 위하여 세균으로부터 chromosomal DNA를 추출한 후, PCR을 통하여 16s-rDNA를 증폭하였다. 증폭을 위한 primer는 세균의 공통 primer인 9F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), 1542R (5'AGAAAGGAGGTGATCCAGCC3')를 사용하였다9). 증폭된 DNA는 (주) 솔젠트에 의뢰하여 16s rDNA의 염기서열을 분석하였으며, 이후 NCBI(National Center for Biotechnology Intormation) BLAST 염기서열 분석을 통하여 동정하였다.
이론/모형
- 이후 약 2주간 매 24시간마다 멸균한 M9용액을 10㎖씩 주입하고 공기 주입을 위해 토양을 섞어주었다. 멸균토양의 조성은 내경 2mm sieve를 이용하여 입자의 크기를 고르게 한 후 사용하였으며, 토양내 총유기물 함량, 수분 보유능 및 토양 pH를 토양오염공정시험법11)에 따라 측정하였다.
- 분리세균의 동정을 위하여 1차적으로 그람 염색을 실시하였으며, 세균의 생화학적 특성을 조사하기 위하여 API 20E Test Kit (Biomerieux, France)을 제조사의 manual에 따라 실행하였다.
성능/효과
- Microcosm의 실험에서 분리된 두 균주는 약 2주간의 배양후 SJD2와 SJD4가 각각 24.9%와 24.7%의 유사한 분해 효율로 다소 낮은 수치를 보여주었다. 이는 microcosm에 사용한 토양 시료의 수분 보유능이 1.
- 분리된 균주의 생화학적 특성은 [Table 2]와 같이 나타났다. SJD2 및 SJD4 균주 모두 catalase 양성 반응을 보였으며 glycerol과 N-acetyl-glucosamine을 탄소원으로 이용하였으나, 기타 영양원에 대해서는 SJD4 균주가 다양한 기질을 이용하고 있는 것으로 나타났다.
- 3]. SJD2균주는 2%의 디젤 농도에서 가장 높은 생장 활성을 보였으나 5% 농도에서는 생장률이 다소 감소하였다. 그러나 SJD4 균주의 경우, 1% 이상의 디젤 농도에서 농도의 증가에 관계없이 생장의 안정성을 보였다.
- SJD2의 집락형태는 고체배지상에서 엷은 분홍색을 띠고 점상(punctifurm)이며 비교적 평평하였으며, SJD4는 크림색의 부정형(irregular)의 집락 형태를 보였고, SJD2와 마찬가지로 평평한 모양이었다. 두 균주 모두 그람 양성이며 간균의 형태를 나타내었다.
- 분리된 2종의 디젤분해세균의 Chromosomal DNA로부터 증폭된 16s rDNA의 염기서열 분석 및 이를 이용한 BLAST search 결과, SJD2 균주의 9F Primer로부터의 염기서열은 Bacillus fusiformis의 염기서열과 99%(746/747)의 유사성을 나타내었으며, 1542R Primer로부터 얻은 염기서열의 비교 결과 Bacillus fusiformis의 염기서열과 99%(893/894)의 유사성을 보여 SJD2 균주는 Bacillus fusiformis strain으로 동정하였다. SJD4 균주의 경우 9F Primer로부터 얻은 염기서열의 비교 분석결과 Bacillus cereus의 염기와 99%(896/897)의 유사성을 나타내었으며, 1542R Primer로부터 얻은 염기서열의 비교 분석 결과 Bacillus cereus와는 100%(961/961)의 유사성을 보여 SJD4 균주는 Bacillus cereus로 동정되었다.
- 1배 높은 것으로 나타났다[Table 1]. SJD4보다 디젤분해능이 다소 높은 SJD2의 경우 디젤을 함유한 액체배양시 유화정도가 비교적 높게 나타났으며, 고체배양의 경우에도 빠른 생장을 보여주는 것으로 나타났다.
- microcosm에 적용된 토양의 총 유기물 함량은 0.82% 이었으며, 수분 보유능은 1.77%, 토양 pH는 6.3으로 약산성의 토양인 것으로 나타났다. 제작된 microcosm에서 14일간 균주의 분해능을 분석한 결과, SJD2는 24.
- 1]. 두 균주 모두 25-37℃에서 안정적인 성장을 나타내었다. 최적의 생장온도는 두 균주 모두 37℃였으며, SJD2 균주는 상대적으로 저온인 25℃에서 적응기가 30℃와 37℃에 비해 2-3시간 길었으나 이후 활발한 생장을 보였고 특히 9시간 이후에는 배양조건이 30℃ 및 37℃일 때와 같은 균체량을 보였다.
- 디젤에 오염된 토양으로부터 시료를 채취하여 이를 디젤분해 평판배지에 도말하여 배양한 결과, 총 6종의 디젤분해세균을 분리하였으며, 이들 중 비교적 우수한 생장능을 보인 2종을 각각 SJD2 및 SJD4로 명명하였다. 이들 두 균주의 디젤능을 Gas Chromatography로 분석한 결과 대조군에 의한 자연제거율이 9.
- 본 연구에서 분리된 두 종류의 디젤분해세균 SJD2와 SJD4를 대상으로 염기서열을 분석한 결과, SJD2는 Bacillus fusiformis로 판명되었으며, SJD4는 Bacillus cereus와 100% 일치하는 것으로 나타났다. Bacillus cereus 등의 균주는 기존의 디젤분해 세균으로 많이 알려져 있으나14), Bacillus fusiformis의 경우, 디젤 분해 활성을 보인 것은 본 연구에서 처음으로 보고된 것으로 알고 있으며, 본 세균이 Bacillus cereus보다 디젤분해능이 높은 것으로 밝혀져 오염현장에서 본 세균에 의한 디젤분해의 보다 나은 효과를 기대할 수 있을 것이다.
- 분리된 2종의 디젤분해세균의 Chromosomal DNA로부터 증폭된 16s rDNA의 염기서열 분석 및 이를 이용한 BLAST search 결과, SJD2 균주의 9F Primer로부터의 염기서열은 Bacillus fusiformis의 염기서열과 99%(746/747)의 유사성을 나타내었으며, 1542R Primer로부터 얻은 염기서열의 비교 결과 Bacillus fusiformis의 염기서열과 99%(893/894)의 유사성을 보여 SJD2 균주는 Bacillus fusiformis strain으로 동정하였다. SJD4 균주의 경우 9F Primer로부터 얻은 염기서열의 비교 분석결과 Bacillus cereus의 염기와 99%(896/897)의 유사성을 나타내었으며, 1542R Primer로부터 얻은 염기서열의 비교 분석 결과 Bacillus cereus와는 100%(961/961)의 유사성을 보여 SJD4 균주는 Bacillus cereus로 동정되었다.
- 분리한 디젤분해 균주의 배양을 위한 최적의 pH를 확인하기 위해 디젤 분해 액체배지의 pH를 pH4.0에서부터 pH 10.0으로 각각 조정한 후, 5일간 균주를 배양하여 흡광도를 측정한 결과, pH7.0~pH 8.0에서 균체량이 가장 많이 증가하는 것으로 미루어 이들의 디젤분해능력이 pH 7~pH 8의 범위에서 가장 활발할 것으로 사료된다 [Fig. 2].
- 7%의 유사한 분해 효율로 다소 낮은 수치를 보여주었다. 이는 microcosm에 사용한 토양 시료의 수분 보유능이 1.77%로서 미생물의 생장이 가장 활발하게 일어나는 토양의 수분 보유능이 60%인 것에 비해 매우 낮으며, 25℃ 이하의 상온에서 실험이 진행되는 등, 균주의 최적 생장조건과 다소의 거리가 있는 환경에 기인한 것이라 사료된다. 실제 토양에서는 균주의 처리기간이 더 길고 다른 환경과의 상호작용도 활발히 일어나므로 실험 수준에서보다 더 높은 효율을 보일 것으로 예상된다15).
- 디젤에 오염된 토양으로부터 시료를 채취하여 이를 디젤분해 평판배지에 도말하여 배양한 결과, 총 6종의 디젤분해세균을 분리하였으며, 이들 중 비교적 우수한 생장능을 보인 2종을 각각 SJD2 및 SJD4로 명명하였다. 이들 두 균주의 디젤능을 Gas Chromatography로 분석한 결과 대조군에 의한 자연제거율이 9.9%의 값을 나타낸 반면, SJD2 및 SJD4는 각각 29.3% 및 21.1%의 디젤 분해율을 나타내어 대조군에 비하여 제거효율이 각각 2.9배 및 2.1배 높은 것으로 나타났다[Table 1]. SJD4보다 디젤분해능이 다소 높은 SJD2의 경우 디젤을 함유한 액체배양시 유화정도가 비교적 높게 나타났으며, 고체배양의 경우에도 빠른 생장을 보여주는 것으로 나타났다.
- 3으로 약산성의 토양인 것으로 나타났다. 제작된 microcosm에서 14일간 균주의 분해능을 분석한 결과, SJD2는 24.9%, SJD4는 24.7%의 분해효율을 보여주었다[Fig. 4].
- 두 균주 모두 25-37℃에서 안정적인 성장을 나타내었다. 최적의 생장온도는 두 균주 모두 37℃였으며, SJD2 균주는 상대적으로 저온인 25℃에서 적응기가 30℃와 37℃에 비해 2-3시간 길었으나 이후 활발한 생장을 보였고 특히 9시간 이후에는 배양조건이 30℃ 및 37℃일 때와 같은 균체량을 보였다.
후속연구
- 본 연구에서 분리된 두 종류의 디젤분해세균 SJD2와 SJD4를 대상으로 염기서열을 분석한 결과, SJD2는 Bacillus fusiformis로 판명되었으며, SJD4는 Bacillus cereus와 100% 일치하는 것으로 나타났다. Bacillus cereus 등의 균주는 기존의 디젤분해 세균으로 많이 알려져 있으나14), Bacillus fusiformis의 경우, 디젤 분해 활성을 보인 것은 본 연구에서 처음으로 보고된 것으로 알고 있으며, 본 세균이 Bacillus cereus보다 디젤분해능이 높은 것으로 밝혀져 오염현장에서 본 세균에 의한 디젤분해의 보다 나은 효과를 기대할 수 있을 것이다.
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