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문제 정의
- 본 논문에서는 미토콘드리 아 cyt b 유전자의 부분 염기서열을 이용한 분자계통학적 분석을 통하여 한국산쥐노래미과에 속하는 소수 종들의 계통간 유연관계를 조사해 보았다. 분자 수준에서 쥐노래미과 어류들에 대한 진화관계를 재조명하고 한국산 쥐노래미과에 속하는 상위 그룹간의 좀 더 정확한 분자계통학적 위치를 규명하기 위해서는 차후, 목 또는 과내로 실험 종의 수를 증가 시켜 다양한 정보를 획득함이 필요하다.
제안 방법
- 증폭된 PCR 단편은 1.0% agarose gel (Q-BIOgene, USA)로 전기영동하여 증폭 band를 확인한 후, 증폭된 band를 적 출하여 gel purification kit (Qiagen)를 사용하여 정제한 뒤, per 2.1 TA cloning vector에 ligation시키고, E. co" XL-1 blue에 보편적 인 방법에 따라 transformation 시켰다.
- 0 jxL 10 x Taq polymerase (Gene Craft, Germany), 5 p.L 10 x PCR buffer, 1.0 卩1」dNTP (4 mM)와 멸균된 증류수 (40 皿)를 혼합한 후 총 50皿의 반응액을 조성하여 PCR 반응을 각각 40회 반복 (94°C로 4분 1회一>95°C로 1분 55°C로 1 분, 72°C로 b% 각 40회 一>72°C로 10분, 1 회) 하였다.
- cyt b 유전자가 제대로 per 2.1 vector^] 들어갔는지를 확인한 후, 확인된 plasmid DNA는 ABI autom가ed DNA sequencer로 T7과 M13 reverse primer-1- 이용하여 se quencing 하였다. 본 실험에서 얻어진 노래미와 쥐노래미의 염기서열과 쥐노래미속에 속한 다른 종들과의 분자 계통학적인 유연관계 분석을 위하여 GenBank로부터 H.
- 노래미 역시 쥐노래미 마취에서와 같은 동일한 방법을 적용하여 간 조직을 적출하였다. 각 종으로 부터 적출된 간조직에 냉장 원액 에탄올 첨가 후 간조직을 직경 2〜3mm의 조각들로 세절하였다. 이후 800rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 제거 후 새로운 냉장 원액 에탄올을 충분히 주입 후 냉동 상태로 고정 .
- 계통도는 PAUP을이용하여 Neighbor-Joining method와 Maximum parsi mony method에 의해 그려졌으며, 분지의 정확도는 100 회의 bootstrap method로서 구하였다. 또한 out group으로 쏨 뱅 이목의 조피볼락 Sebastes schlegeli을 사용하여 rooted tree로 만들었다. 그 결과 노래미과에 속하는 7종들은 크게 두개의 그룹으로 나뉘어졌다.
- agrammus^] cyt b DNA sequence를 인용하였다. 또한 outgroup으로 조피 볼락 sc/z/ege们의 cyt b DNA sequence를 사용하였다.
- 1 vector^] 들어갔는지를 확인한 후, 확인된 plasmid DNA는 ABI autom가ed DNA sequencer로 T7과 M13 reverse primer-1- 이용하여 se quencing 하였다. 본 실험에서 얻어진 노래미와 쥐노래미의 염기서열과 쥐노래미속에 속한 다른 종들과의 분자 계통학적인 유연관계 분석을 위하여 GenBank로부터 H. lagocephalus, H. superciliosus, H. decagrammus, H. otakii, H. agrammus^] cyt b DNA sequence를 인용하였다. 또한 outgroup으로 조피 볼락 sc/z/ege们의 cyt b DNA sequence를 사용하였다.
- 본 연구는 개방수계인 연안의 유사한 서식지와 동일한 생태 및 외형에서의 거의 유사함을 보이는 쥐노래미과 어류인 노래미와 쥐노래미를 대상으로 종간 계통 유연관계를 파악하기 위하며 미토콘드리 아 DNA 내 에 존재하는 cytochrome b (cyt b) 유전자 염기서 열을 비교 . 분석하였다.
- 본 연구는 쥐노래미과 (Hexagrammidae)에 속하고 양식산업에서 중요한 위치를 차지하고 있는 노래미, Hexagram mos otakii (Jordan et Starks)와 쥐 노래 미 , H. agrammus (Temminck et Schlegel)의 미 토콘드리 아 cytochrome b(cyt b) 유전자의 염기서열을 서로 비교 . 분석하였다.
- 우선 위의 7종의 어류의 cyt b DNA sequence를 Clustal X program (Ver. 1.8) (Thompson et al. 1997) A다 중정 렬 (multiple alignment)하여 alignment data matrix를 만들고, 이를 PAUP program을 사용하여 각 종들간의 진화 적거리 (evolutionary distance)를 분석하였다. Nucleotide substitution의 분석 은 Kimura 2-parameter distance model (Kimura 1980)을 사용하여 수행하였다.
- 쥐노래미와 노래미의 고정된 간조직을 genomic DNA 완충액 과 함께 homogenize하였다. Geno mic DNA는 phenol/chloroform 및 chloroform 순으류 추출하여 원심분리 후 상등액을 취한 뒤, 0.
대상 데이터
- agrammus를 2004년 12월에 부산광역시 영도구 동삼 1동 소재의 하리 포구 수족관에서 구입하였다. 구입한 각 어종을 한국해양대학교 수산유전육종학연구실 임해양식장으로 이동한 후 순화시켰다.
- 국내에서 구입한 쥐노래미과 어류 2종, 쥐노래미 Hexa응rammos otakii와 노래 미 H. agrammus^ 대상으로 하여 간조직으로부터 genomic DNA를 추출하여 cyt b 유전자를 PCR 방법에 의해 증폭하였다. 증폭된 DNA의 크기는 으扌 489 bp로서 cyt b 유전자의 N-terminal ATG의 宁 叩stream 쪽의 tRNA-Glu를 coding하고 있는 50 bp를 포함하는 것으로 sequencing 결과 확인되었다.
- 평균 체장과 평균 체중이 각각 22.3±1.5 cm, 157± 39.2g(〃=5)인 쥐노래미 Hexagrammos otakii^ 평균 체장과 평균 체중이 각각 19.7土 1.3 cm, 143.0土28.6 g (〃= 5)인 노래미 H. agrammus를 2004년 12월에 부산광역시 영도구 동삼 1동 소재의 하리 포구 수족관에서 구입하였다. 구입한 각 어종을 한국해양대학교 수산유전육종학연구실 임해양식장으로 이동한 후 순화시켰다.
이론/모형
- 1997) A다 중정 렬 (multiple alignment)하여 alignment data matrix를 만들고, 이를 PAUP program을 사용하여 각 종들간의 진화 적거리 (evolutionary distance)를 분석하였다. Nucleotide substitution의 분석 은 Kimura 2-parameter distance model (Kimura 1980)을 사용하여 수행하였다. 분석 결과를 이용한 phylogenetic tree는 Neighbor-Joining (NJ) method (Saitou and Nei 1987)와 Maximum parsimony (MP)를 사용하여 100회의 bootstrap method-1- 적용하여 구성하였다.
- C : Phylogenetic tree of the germs Hexagrammos inferred from the partial cytochrome b (392 bp) sequence of mitochondrial DNA. The tree was constructed by the MP method (bootstrap replication number 100). * Numbers indicate the bootstrap value.
- B : Phylogenetic tree of the genus Hexagrammos inferred from the partial cytochrome b (392 bp) sequence of mitochondrial DNA. The tree was constructed by the NJ method (bootstrap replication number 100) with Kimura 2-parameter after Chistal X analysis. C : Phylogenetic tree of the germs Hexagrammos inferred from the partial cytochrome b (392 bp) sequence of mitochondrial DNA.
- 2-B, C에 예시하였다. 계통도는 PAUP을이용하여 Neighbor-Joining method와 Maximum parsi mony method에 의해 그려졌으며, 분지의 정확도는 100 회의 bootstrap method로서 구하였다. 또한 out group으로 쏨 뱅 이목의 조피볼락 Sebastes schlegeli을 사용하여 rooted tree로 만들었다.
- 미토콘드리 아 cytochrome (cyt) b 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) (Bio-Rad iCycler, USA)으로 증폭하기 위해 먼저 Lee 등(1995)의 방법으로 genomic DNA를 추출하였다. 쥐노래미와 노래미의 고정된 간조직을 genomic DNA 완충액 과 함께 homogenize하였다.
- 기준에 의거 실시하였다. 박 등(2003)의 방법에 따라 18°C의 800 ppm 염산리도카인/1, 000 ppm NaHCO로 쥐노래미를 마취 후 간조직을 적출하였다. 노래미 역시 쥐노래미 마취에서와 같은 동일한 방법을 적용하여 간 조직을 적출하였다.
- Nucleotide substitution의 분석 은 Kimura 2-parameter distance model (Kimura 1980)을 사용하여 수행하였다. 분석 결과를 이용한 phylogenetic tree는 Neighbor-Joining (NJ) method (Saitou and Nei 1987)와 Maximum parsimony (MP)를 사용하여 100회의 bootstrap method-1- 적용하여 구성하였다.
- 쥐노래미과에 속한 7종들 과의 유연관계를 분석하기 위한 진화적 거리는 DNA 염기서열의 염기치환 정도를 Kimura 2-parameter distance model을 사용하여 계산하였다. 그 결과로 산출된 pairwise distance matrix는 Table 1 에 나타내었다.
- 쥐노래미와 노래미의 동정을 정 (1977)과 최 등(2002) 의 기준에 의거 실시하였다. 박 등(2003)의 방법에 따라 18°C의 800 ppm 염산리도카인/1, 000 ppm NaHCO로 쥐노래미를 마취 후 간조직을 적출하였다.
성능/효과
- 1에 나타내 었다. Sequence alignment 결과 노래미와 쥐노래미 사이의 염기서열 상동성은 97%를 나타내 었고, GenBank에 등록되 어 있는 H. otakii와 H. agram- 力必사이의 서열 상동성은 96%를 나타내어 다른 종들과 더 높은 유사성을 나타내는 것으로 확인되었다.
- lagoce- phalus가 포함된 그룹이다. 계통도에서도 확인할 수 있듯이 우리나라에서 수집된 노래미와 쥐노래미는 Gen- Bank에 등록된 동일종들과 같은 그룹으로 분류되어 나왔으며, 특히 우리나라에서 수집된 쥐노래미의 경우 노래미와 더 진화적 거리가 가까운 것으로 확인되었다.
- 그 결과로 산출된 pairwise distance matrix는 Table 1 에 나타내었다. 노래미와 쥐노래미 사이의 진화적 거리는 0.03342이고, H. otakiiS\- H. agrammus는 0.06531 으로 본 실험에서 확인된 노래미와 쥐노래미가 GenBank에 등록되어 있는 동일종들보다 더 근연관계에 있음을 확인할 수 있었다. 이는 국내에서 수집된 어종이 GenBank 에 등록되어 있는 어종과 차이를 나타낸다는 것을 의미하는데, 노래미와 H.
- 쥐노래미과가 포함된 쏨뱅이목 (Scorpaeniformes)에서는 약 19종의 어 류의 cyt b 유전자가 완전히 밝혀졌는데 모두 공통적으로 1, 141 bp를 coding하고 있다. 따라서 본 실험에서 확인된 국내산 쥐노래미 2종의 sequence는 전체 sequence 중에서 약 38.5%에 해당하는 것으로 추정할 수 있다.
- 따라서 계통지 리 학적 연구에 있어 좋은 모델이 될 수 있다. 본 논문에서 분석된 우리나라에서 수집된 쥐 노래 미 (H. ora屈)는 GenBank에등록된 일본에서 수집된 쥐노래미 (H. m3)와 비교시 진화적 거리에 있어 차이를 나타내어 노래미 (/% agranwTW/s) 와 더 가까운 것으로 나타나, 지역적 특성이 반영된 것으로 추정되 어진다. 그러나 Crow 등(2004)의 계통도, Shinohara(1994)에 의한 계통도들과 차이를 나타내고 있으며, 본 연구에서는 cyt b 유전자의 완전한 전체 염기서열을 이용하여 분석한 것이 아님을 고려하여 차후, 이에 대한 연속적 인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 본 연구에서와 마찬가지로, 현재까지 노래미와 쥐노래미를 대상으로 비교한 세포 유전학적 연구에서 노래미는 쥐노래미에 비하여 적혈구 세포와 핵의 크기가 컸으며 DNA 함량 또한 크게 나타났으나, 염색체 수나 핵형에서는 노래미와 쥐노래미가 동일하게 나타난 바 있다(심 등 2002). 심 등(2002) 의 결과와 본 연구 결과를 종합적으로 평가시, 노래미는 쥐노래미에 비해 염색체 수나 핵형에서의 변화는 없이 DNA 함량이 증가함과 동시에 cyt b 유전자 변화를 야기시키는 방향으로 진화되었음을 알 수 있다. 이와 더 불어 쥐노래미에 대하여 성장호르몬 cDNA 유전자의 염기서열 변이 및 발현 특성 이 남과 김 (2002)에 의하여 구명된 바 있다.
- agrammus^ 대상으로 하여 간조직으로부터 genomic DNA를 추출하여 cyt b 유전자를 PCR 방법에 의해 증폭하였다. 증폭된 DNA의 크기는 으扌 489 bp로서 cyt b 유전자의 N-terminal ATG의 宁 叩stream 쪽의 tRNA-Glu를 coding하고 있는 50 bp를 포함하는 것으로 sequencing 결과 확인되었다. 현재 Gen-Bank에 등록되 어 져 있는 노래 미 관련 어 종의 cyt b 유전자의 서 열정 보는 쥐 노래 미 과에 속한 4개 genus (Hexa- grammos, Ophiodon, Oxylebius, Pleurogrammus)에 약 11 개 어종에 대해서만 부분적으로 밝혀져 있다.
후속연구
- m3)와 비교시 진화적 거리에 있어 차이를 나타내어 노래미 (/% agranwTW/s) 와 더 가까운 것으로 나타나, 지역적 특성이 반영된 것으로 추정되 어진다. 그러나 Crow 등(2004)의 계통도, Shinohara(1994)에 의한 계통도들과 차이를 나타내고 있으며, 본 연구에서는 cyt b 유전자의 완전한 전체 염기서열을 이용하여 분석한 것이 아님을 고려하여 차후, 이에 대한 연속적 인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 본 연구 결과는 노래미와 쥐노래미의 분자 수준에서 접근한 연구로, 앞으로 두 종을 구분하는데 기본적 인 정보를 제공하게 될 것으로 사료된다. 본 연구에서와 마찬가지로, 현재까지 노래미와 쥐노래미를 대상으로 비교한 세포 유전학적 연구에서 노래미는 쥐노래미에 비하여 적혈구 세포와 핵의 크기가 컸으며 DNA 함량 또한 크게 나타났으나, 염색체 수나 핵형에서는 노래미와 쥐노래미가 동일하게 나타난 바 있다(심 등 2002).
- 보았다. 분자 수준에서 쥐노래미과 어류들에 대한 진화관계를 재조명하고 한국산 쥐노래미과에 속하는 상위 그룹간의 좀 더 정확한 분자계통학적 위치를 규명하기 위해서는 차후, 목 또는 과내로 실험 종의 수를 증가 시켜 다양한 정보를 획득함이 필요하다. 이와 동시에 cyt b 유전자의 전체 염기서열의 분석, 그리고 다른 연구들에서 처럼 진화의 속도가 빠른 다른 영역 이나 미토콘드리아 전체 염기서열과 같이 긴 염기서열을 분석하여 (Miya et al.
- 0342인 pairwise distance는 두 종이 분자계통유전학적으로 유사함을 시사한다. 이러한 연구 결과들은 쥐노래미 (Hexag rammos) 속을 대상으로 한 양식, 수산유전학 및 분자계통학 분야에 적용 가능할 것이다.
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