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문제 정의
- 따른 영향을 받을 것으로 예상하였다. 따라서 본연구에서는 투석온도 및 pH조건을 변화시켜서, 투석조건의 차이가 가용성 펩타이드의 생산 수율에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 먼저 투석실험에 사용한 완충액은 50 mM ac'4'tic acid-trisodium citric acid 완충액 (pH 4.
- 본 연구에서는 식물, 세균, 곰팡이로부터 유래하는 식품용프로티아제를 이용하여 가용성 실크펩타이드를 제조하는 효소 공학기술 및 전처리기술의 최적화를 수행하였고, 효소에 따른 실크펩타이드의 분자량 분포 등을 조사하였다.
- 실크용해를 위한 별도의 전처리 없이 실크를 직접 가수분해하는 방법의 타당성을 조사하였다. 먼저 , 50 mM sodium phosphate 완충액 10 ml (pH 7.
- 이상의 결과를 종합하여 상온 그리고 중성 pH조건에서 투석을 실시함으로써, 실크 가수분해에 미치는 영향을 최소화 하고자 하였다.
- 천연 단백질인 실크를 가수분해하여, 건강기능성 식품 등에 다양하게 활용될 수 있는 가용성 실크 펩타이드를 생산하는 효소공학적 연구를 수행하였다. 효소는 Bacillus, Aspergillus, 파파야, 파인애플 등으로부터 유래하는 10종의프로티아제를 사용하였으며, 가수분해 효율을 높이기 위하여 생 실크를 CaCE에탄올 공용액에 녹인 가용화된 실크를 제조하였고, 이를 상온 중성의 조건에서 50시간 동안 투석하여 효소반응을 위한 기질로 사용하였다.
제안 방법
- 프로티아제를 가하고 45。(2에서 2시간 동안 가수분해반응이 충분히 진행되도록 한 후, 반응액을 3000 rpm에서 20분 동안 원심 분리하여 불용성 침전물(insoluble aggregates) 의 량을 조사하였다(Fig. 1). 그 결과, Aspergillus 유래 프로티 아제 인 Promod 279P, Sumyzyme, Panazyme, Flavourzyme 그리고 Bacillus 유래 프로티아제인 Protamex의 경우에서는 전체 반응액 부피와 비슷한 5-6 ml 부피의 불용성 침전물이 생성되었다.
- 0)에 생 실크 2 g과 식물, 세균 및 곰팡이로부터 유래하는 10종의 프로티아제를 과량(0.5 g) 가하고, 효소이용 가수분해 반응을 45。(2에서 48시간 동안 진행한 후, 잔여물의 건조중량을 조사하였다. 그 결과, 효소 가수분해에 의한 중량감소는 단지 5-10%에 그쳐서 , 본 연구에서 사용한 10종의 호소는 생 실크 가수분해에 적합하지 않은 것으로 확인되었다.
- 따라서, 기질농도를 1%와 5%로 달리하면서 농도에 따른 실크의 가수분해율을 조사하였다. 효소 반응은 37。(:에서 4시간 동안 진행하였으며, 이후 20시간까지 냉장온도에 보관하면서 불용성 침전물의 형성 및 가수분해율을 조사하였다(Fig. 2).
- 투석이 완료된 실크는 부직포로 여과하여 불용성 고형물을 제거한 후 가수분해반응의 기질로 이용하였다. 가용화된 실크를 저온에 장시간 방치하는 경우에는 가수분해가 불가능한 젤리가 형성되므로, 되도록 빠른 시간에 투석을 완료하고자 하였고, 제조된 용액은 일주일 이내에 가수분해 반응에 사용하였다. 한편, 투석용액의 전기전도도를 측정하여 투석속도를 조사한 결과 상온 및 60也에서는 비슷하였으나, 4。(2에서는 2배 이상의 시간이 소요되는 것으로 확인되었다.
- 크게 달라진다. 따라서, 기질농도를 1%와 5%로 달리하면서 농도에 따른 실크의 가수분해율을 조사하였다. 효소 반응은 37。(:에서 4시간 동안 진행하였으며, 이후 20시간까지 냉장온도에 보관하면서 불용성 침전물의 형성 및 가수분해율을 조사하였다(Fig.
- 따라서 본연구에서는 투석온도 및 pH조건을 변화시켜서, 투석조건의 차이가 가용성 펩타이드의 생산 수율에 미치는 영향을 조사하고자 하였다. 먼저 투석실험에 사용한 완충액은 50 mM ac'4'tic acid-trisodium citric acid 완충액 (pH 4.0, 6.5)와 trisodium citric acid-sodium hydroxide 완충액 (pH 9.0)였으며, 투석온도는 각각 4°C, 25°C, 60°C로 설정하였다. 효소 이용 가수분해반응은 투석 후, 즉시 실시하였으며, 실크 농도를 1%로 조절하여 반응효율을 조사하였다(Table 2).
- 한편, 투석용액의 전기전도도를 측정하여 투석속도를 조사한 결과 상온 및 60也에서는 비슷하였으나, 4。(2에서는 2배 이상의 시간이 소요되는 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 상온에서 투석을 실시하였고, 전기전도도가 수돗물 수준에 도달하는 50시간 후에 투석을 종료하였다. 이와 같이 제조한 가용성 실크의 최종적인 피브로인 함량은 95。(3에서 24시간 건조시킨 후 건조중량을 측정하여 계산한 결과, 4.
- 분자량 분석을 실시하였다. 분자량 측정에는 Superose 12 HR(1.0 x 30 cm)을 장착한 FPLC(Amersham Pharmacia, Sweden)를 이용하였으며, 표준단백질로는 Gel filtration calibration kit(Amersham Pharmacia, Sweden)를사용하였다.
- 상용 실크분말(Mayuko, Japan), 투석직후의 실크용액, 및 bromelain, protamex, alcalase등에 의한 가수분해 실크 펩타이드들의 분자량 분석을 실시하였다. 분자량 측정에는 Superose 12 HR(1.
- 식물, 세균, 곰팡이로부터 유래하는 10종의 프로티아제를종류에 따라 0.01~1 mg/ml의 농도로 조절하여 0.6%(w/v) 카제인 및 0.5%(w/v) 가용성 실크를 분해하였고, 분해된 기질의 양을 BCA 방법으로 측정하여 카제인 및 실크에 대한 기질특이성을 조사하였다. 그 결과, Bacillus 유래의 Protamex 와 Alcalase, 그리고 파인애플 유래의 Bromelain은 실크를 가수분해하는 활성이 매우 높을 뿐만 아니라, 기질특이성에 있어서도 실크 가수분해에 가장 적합한 것으로 확인되었다 (Table 1).
- 그 결과, 효소 가수분해에 의한 중량감소는 단지 5-10%에 그쳐서 , 본 연구에서 사용한 10종의 호소는 생 실크 가수분해에 적합하지 않은 것으로 확인되었다. 이것은 실크를 구성하는 피브로인 단백질이 특이적인 섬유상 조직을 갖기 때문인 것으로 판단되었으며, 이하 본 연구는 생 실크를 완전히 용해시켜서 2 차 구조의 형성을 최소화 시킨 실크 용액을 먼저 제조한 다음에 효소를 처리하는 방법에 의하여 진행하였다.
- 이러한 결과로부터 프로티아제 활성 및 기질특이성이 우수하고, 불용성 침전물 형성이 적은 파인애플 유래의 Bromelain과 B. licheniformis 유래의 Alcalase를 실크 펩타이드 제조에 적합한 프로티아제로 1차선정하였으며, 불용성 침전 물을 형성하는 단점 이 있으나 실크 분해활성이 우수한 Protamex를 대조군으로 하여 이후의 연구를 수행하였다.
- 8)를 사용하여 실시하였다. 투석액은 약 30배 부피의 증류수를 1일 3회씩 총 8회 교체하는 방식으로 실시하였고, 용액의 전기전도도(conductivity)를 측정하여 투석완료 여부를 판단하였다. 투석이 완료된 실크는 부직포로 여과하여 불용성 고형물을 제거한 후 가수분해반응의 기질로 이용하였다.
- 투석은 실크 용해에 이용된 염 , 에탄올을 제거하기 위하여 가용화된 실크를 투석막(MWC0: 6000-8000, Spectrum, U.S.A.)에 주입하고, 1차 증류수(pH 6.5〜6.8)를 사용하여 실시하였다. 투석액은 약 30배 부피의 증류수를 1일 3회씩 총 8회 교체하는 방식으로 실시하였고, 용액의 전기전도도(conductivity)를 측정하여 투석완료 여부를 판단하였다.
- )법으로 분석하여, 가수분해된 카제인의 양을 측정하였다[13]. 한편 실크 가수분해활성의 측정에는 50 mM sodium phosphate 완충액 (pH 7.0)에 0.5%(w/v) 농도로 희석한 가용성 실크를 이용하였으며, 카제인의 경우와 동일한 방법으로 가수분해된 실크의 양을 측정하였다.
- 0)였으며, 투석온도는 각각 4°C, 25°C, 60°C로 설정하였다. 효소 이용 가수분해반응은 투석 후, 즉시 실시하였으며, 실크 농도를 1%로 조절하여 반응효율을 조사하였다(Table 2).
- 효소활성은 Hagihara[12]의 방법을 변형하여 측정하였다. 우선 분말 및 용액상태의 효소들을 50 mM sodium phosphate 완충액 (pH 7.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한 프로티아제들은 1蒔으로, Colkipuli과 Bromelain, Flavourzyme의 3종은 Gist-brocades(Netherlands)의 제품을, Promod 279P는 Biocatalysts(England), Sumyzyme 은신 일본 화학공업 (Japan), Panazyme은 Rhodia(NJ, U.S.A.), 그리고 Maxazyme LP와 Neutrase, Protamex, Alcalase등의 4종은 Novo Nordisk(Denmark)의 제품을 사용하였다.
- 효소공학적 연구를 수행하였다. 효소는 Bacillus, Aspergillus, 파파야, 파인애플 등으로부터 유래하는 10종의프로티아제를 사용하였으며, 가수분해 효율을 높이기 위하여 생 실크를 CaCE에탄올 공용액에 녹인 가용화된 실크를 제조하였고, 이를 상온 중성의 조건에서 50시간 동안 투석하여 효소반응을 위한 기질로 사용하였다. 효소반응은 37, pH 7.
이론/모형
- 6%(w/v) hammarstein 카제인 (Merck, Germany) 5 ml에 희석된 효소용액 1 ml를 가한 후 37°C에서 10분간 반응시 키고, 5 ml의 10% TCA (trichloroacetic acid)를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응액은 실온에서 10분간 방치시킨 다음 13, 000 rpm에서 10분간 원심분리하여 분해되지 않은 카제인을 제거한 후, 상등액을 BCA(Pierce, U.S.A.)법으로 분석하여, 가수분해된 카제인의 양을 측정하였다[13]. 한편 실크 가수분해활성의 측정에는 50 mM sodium phosphate 완충액 (pH 7.
성능/효과
- 본 연구에서는 상온에서 투석을 실시하였고, 전기전도도가 수돗물 수준에 도달하는 50시간 후에 투석을 종료하였다. 이와 같이 제조한 가용성 실크의 최종적인 피브로인 함량은 95。(3에서 24시간 건조시킨 후 건조중량을 측정하여 계산한 결과, 4.5〜5.6%(w/v)로 확인되었다.
- 1). 그 결과, Aspergillus 유래 프로티 아제 인 Promod 279P, Sumyzyme, Panazyme, Flavourzyme 그리고 Bacillus 유래 프로티아제인 Protamex의 경우에서는 전체 반응액 부피와 비슷한 5-6 ml 부피의 불용성 침전물이 생성되었다. 그 밖의 Bacillus 유래 단백질 분해효소인 Maxazyme LP, Neutrase, Alcalase등은 전체 반응액 의 30- 50%에 해당하는 2-3 ml 부피의 불용성 침전물이 형성되었다.
- 5%(w/v) 가용성 실크를 분해하였고, 분해된 기질의 양을 BCA 방법으로 측정하여 카제인 및 실크에 대한 기질특이성을 조사하였다. 그 결과, Bacillus 유래의 Protamex 와 Alcalase, 그리고 파인애플 유래의 Bromelain은 실크를 가수분해하는 활성이 매우 높을 뿐만 아니라, 기질특이성에 있어서도 실크 가수분해에 가장 적합한 것으로 확인되었다 (Table 1).
- 그 결과, Bromelain의 경우에서는 투석 조건의 변화와 관계없이 대부분 100%에 가까운 가수분해 수율이 관찰되었으나, 다량의 불용성 침전물을 형성하는 Protamex 및 Alcalase 는 모든 조건에서 가수분해반응의 수율이 대체로 낮았고, 특히 pH 4인 조건에서 투석을 진행호)는 경우, 소량의 불용성 침전 물이 형성되면서 생산 수율은 더욱 저하되었다. 이상의 결과를 종합하여 상온 그리고 중성 pH조건에서 투석을 실시함으로써, 실크 가수분해에 미치는 영향을 최소화 하고자 하였다.
- 5 g) 가하고, 효소이용 가수분해 반응을 45。(2에서 48시간 동안 진행한 후, 잔여물의 건조중량을 조사하였다. 그 결과, 효소 가수분해에 의한 중량감소는 단지 5-10%에 그쳐서 , 본 연구에서 사용한 10종의 호소는 생 실크 가수분해에 적합하지 않은 것으로 확인되었다. 이것은 실크를 구성하는 피브로인 단백질이 특이적인 섬유상 조직을 갖기 때문인 것으로 판단되었으며, 이하 본 연구는 생 실크를 완전히 용해시켜서 2 차 구조의 형성을 최소화 시킨 실크 용액을 먼저 제조한 다음에 효소를 처리하는 방법에 의하여 진행하였다.
- 2A). 그러나 Protamex의 경우에는 2시간 동안 효소반응을 시켰을 때 최대의 가수분해 반응을 보였으며, 그 이후에는 효소반응이 진행되더라도 오히려 감소하는 현상을 보였고, 이러한 반응효율의 감소는 실크의 농도를 5% (w/v)로 증가시킨 경우에 더욱 심하게 나타났다(Fig. 2B). Alcalase는 대략 1시간 정도 효소 반응을 시켰을 때 최대의 가수분해율을 보였으며, 마찬가지로 시간이 경과하면서 발생하는 불용성 침전물로 생산수율의 감소가 관찰되었다(Fig.
- 먼저 , Bromelain으로 가수분해반응을 수행한 경우에는 1% 와 5% 모두 가수분해반응의 수율이 안정적으로 증가되었으며, 불용성 침전물의 형성은 미미하였다(Fig. 2A). 그러나 Protamex의 경우에는 2시간 동안 효소반응을 시켰을 때 최대의 가수분해 반응을 보였으며, 그 이후에는 효소반응이 진행되더라도 오히려 감소하는 현상을 보였고, 이러한 반응효율의 감소는 실크의 농도를 5% (w/v)로 증가시킨 경우에 더욱 심하게 나타났다(Fig.
- 3D). 이상의 연구 결과를 종합하면, 가용화한 실크를 상온의 중성 조건에서 투석한 후 파인애플 유래의 프로티아제인 Bromelain을 처리함으로써 가용성이 높고 새로운 분자량 분포특성을 갖는 실크펩티드를 효율적으로 제조할 수 있었다.
- 0에서 수행하였으며, 파인애플 유래 프로티아제인 Bromelair과 Bac/〃“y유래 효소인 Alcalase가 실크의 가수분해에 적합한 것으로 확인되었다. 특히 파인애플 유래의 Bromelain은 가수분해 도중 불용성 침전물의 형성으로 인한 생산 수율의 감소가 가장 적어 가용성 실크 펩타이드의 제조에 적합하였고, 분자량 분포에 있어서도 보다 다양한 것으로 확인되었다.
- 3A)의 중간에서 검출되었고, 앞의 피크는 피브로인 사이의 号sheet 결합이 잔존하고 있는 거대분자의 검출에 따른 것으로 판단된다. 한편 상용 실크분말(Mayuko, Japan片 분자량을 분석결과 약 11.5 kDa 이하로 측정되었으며(Fig. 3C), 가용화된 실크를 Protamex 또는 Alcalase로 가수분해한 경우에서도 이와 비슷한 분자량분포가 확인되었다(Fig. 3E, 3F). 이에 비하여 Bromelain房로 가수분해한 실크는 가용성이 높으면서도 분자량이 상대적으로 높은 0.
- 효소는 Bacillus, Aspergillus, 파파야, 파인애플 등으로부터 유래하는 10종의프로티아제를 사용하였으며, 가수분해 효율을 높이기 위하여 생 실크를 CaCE에탄올 공용액에 녹인 가용화된 실크를 제조하였고, 이를 상온 중성의 조건에서 50시간 동안 투석하여 효소반응을 위한 기질로 사용하였다. 효소반응은 37, pH 7.0에서 수행하였으며, 파인애플 유래 프로티아제인 Bromelair과 Bac/〃“y유래 효소인 Alcalase가 실크의 가수분해에 적합한 것으로 확인되었다. 특히 파인애플 유래의 Bromelain은 가수분해 도중 불용성 침전물의 형성으로 인한 생산 수율의 감소가 가장 적어 가용성 실크 펩타이드의 제조에 적합하였고, 분자량 분포에 있어서도 보다 다양한 것으로 확인되었다.
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