Clavicorona pyxidata DGUM 29005의 균사 생육을 위한 최적 배양조건 및 효소 활성을 조사하였다. 균사 생육을 위한 최적 온도 및 pH는 각각 $24^{\circ}C$ 및 5.0이었다. 사용된 복합배지 중 malt extract medium (MEM)에서 가장 좋은 균사 생육을 나타내었다. 최소배지로 Czapek-Dox 한천배지를 사용하고 탄소원으로 trehalose, mannitol, sucrose 및 maltose 첨가시 균사생육이 우수하였다. 전반적으로 무기질소원이 유기질소원 보다 균사 생육을 더 촉진하였으며, 무기질소원으로 calcium nitrate를 사용하였을 때 균사 생육이 가장 우수하였다. 인산원으로 $Na_2HPO_4$를 사용했을 때 균사생육이 촉진되었으며, 가장 우수한 비타민원은 p-aminobenzoic acid이었다. MEM 액체배지를 사용하여 $24^{\circ}C$에서 20일간 C. pyxidata DGUM 29005를 배양하여 균사외 분비효소 및 균사내 효소의 활성도를 측정한 결과, 균사외 분비 효소 중 laccase의 활성도가 다른 효소에 비해 높았으며, ${\alpha}$-amylase, chitinase, lipase 및 pretense의 활성도는 낮거나 없었다.
Clavicorona pyxidata DGUM 29005의 균사 생육을 위한 최적 배양조건 및 효소 활성을 조사하였다. 균사 생육을 위한 최적 온도 및 pH는 각각 $24^{\circ}C$ 및 5.0이었다. 사용된 복합배지 중 malt extract medium (MEM)에서 가장 좋은 균사 생육을 나타내었다. 최소배지로 Czapek-Dox 한천배지를 사용하고 탄소원으로 trehalose, mannitol, sucrose 및 maltose 첨가시 균사생육이 우수하였다. 전반적으로 무기질소원이 유기질소원 보다 균사 생육을 더 촉진하였으며, 무기질소원으로 calcium nitrate를 사용하였을 때 균사 생육이 가장 우수하였다. 인산원으로 $Na_2HPO_4$를 사용했을 때 균사생육이 촉진되었으며, 가장 우수한 비타민원은 p-aminobenzoic acid이었다. MEM 액체배지를 사용하여 $24^{\circ}C$에서 20일간 C. pyxidata DGUM 29005를 배양하여 균사외 분비효소 및 균사내 효소의 활성도를 측정한 결과, 균사외 분비 효소 중 laccase의 활성도가 다른 효소에 비해 높았으며, ${\alpha}$-amylase, chitinase, lipase 및 pretense의 활성도는 낮거나 없었다.
The culture conditions for the enhanced mycelial of Clavicorona pyxidata DGUM 29005 were investigated. The optimal temperature and pH for the mycelial growth were $24^{\circ}C$ and 5.0, respectively. It was shown that trehalose was the best supplement of carbon sources in Czapek-Dox mediu...
The culture conditions for the enhanced mycelial of Clavicorona pyxidata DGUM 29005 were investigated. The optimal temperature and pH for the mycelial growth were $24^{\circ}C$ and 5.0, respectively. It was shown that trehalose was the best supplement of carbon sources in Czapek-Dox medium as a minimal medium for enhanced mycelial growth. In general, inorganic nitrogen sources were better than organic ones for mycelial growth. Calcium nitrate was the best out of the inorganic nitrogen test. The appropriate phosphorous and vitamin were $Na_2HPO_4$ and p-aminobenzoic acid, respectively. After the mycelial of C. pyxidata DGUM 29005 was cultivated at $24^{\circ}C$ for 20 days in MEM broth(pH 5.0), the specific activities of both exomycelial and endomycelial enzymes were determined. Among the exomycelial enzyme assayed, the specific activity of laccase was much higher than those of other enzymes. However, little or no enzyme activities of ${\alpha}$-amylase, chitinase, lipase and pretense were found.
The culture conditions for the enhanced mycelial of Clavicorona pyxidata DGUM 29005 were investigated. The optimal temperature and pH for the mycelial growth were $24^{\circ}C$ and 5.0, respectively. It was shown that trehalose was the best supplement of carbon sources in Czapek-Dox medium as a minimal medium for enhanced mycelial growth. In general, inorganic nitrogen sources were better than organic ones for mycelial growth. Calcium nitrate was the best out of the inorganic nitrogen test. The appropriate phosphorous and vitamin were $Na_2HPO_4$ and p-aminobenzoic acid, respectively. After the mycelial of C. pyxidata DGUM 29005 was cultivated at $24^{\circ}C$ for 20 days in MEM broth(pH 5.0), the specific activities of both exomycelial and endomycelial enzymes were determined. Among the exomycelial enzyme assayed, the specific activity of laccase was much higher than those of other enzymes. However, little or no enzyme activities of ${\alpha}$-amylase, chitinase, lipase and pretense were found.
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문제 정의
그러나, 좀나무싸 리버섯 균사체의 생리학적 및 배양학적 특성에 관한 연구는 미흡한 실정이다. 본 연구는 좀나무싸 리버섯의 자실체 대량생산 및 균사체를 이용한 식품 및 식품첨가제의 개발을 목적으로 균사체 배양을 위한 최적 배양조건의 규명 및 여러 효소의 활성을 측정하였다.
제안 방법
0-10 범위에서 최적 조건을 결정하였다. 각 영양원 첨가에 따른 균사생육의 영향을 알아보기 위해 Czapek-Dox 한천배지(CD: glucose 1.0%, NaNO3 0.3%, K2HPO4 0.1%, NaCl 0.05%, KCl 0.05%, FeSO4 0.001%, MgSO4 0.05%) 중에서 탄소원, 질소원 및 인산원의 종류를 변화시켜 사용하였다. 비타민은 최종 농도가 0.
외분비 효소의 특성을 알아보기 위해 MEM 액체배지에 접종한 다음, 24℃에서 20일간 진탕배양하였다(120 rpm). 배양 후 여과지(Whatman No. 2)를 이용하여 균사체와 배양액을 분리한 다음 배양여액을 조효소원으로 균사외 분비 a- amylase, p-glucosidase, xylanase, CMCase, exo-1, 4-p-D-glucanase, chitinase, lipase, protease 및 laccase의 효소 활성을 즉정하였다 (9).균사내 효소 측정을 위해서 여과된 균사체를 증류수로 세척한 다음 homogenizer를 사용하여 4℃에서 20초씩 10회 분쇄하였다 French press (Carver Inc.
YMG 한 천배지에서 전 배양된 균사를 cork borer (diameter, 7 mm)를 이용하여 떼어내어 한천배지상에 위치한 후, 24℃에서 15일간 배양하였다. 성장한 균사의 직경을 mm 단위까지 측정하고 밀도를 관찰하여 균사 생육도를 결정하였다. 실험은 3회 이상 반복 수행하여 균사직경의 평균 및 표준편차를 구하였다.
균사체내 . 외분비 효소의 특성을 알아보기 위해 MEM 액체배지에 접종한 다음, 24℃에서 20일간 진탕배양하였다(120 rpm). 배양 후 여과지(Whatman No.
최적균사생육 온도 및 pH의 규명을 위하여, YMG 한 천배지 (0.4% yeast extract, 1% malt extract, 0.4% glucose)를 이용하여 온도는 16~32℃ 범위로 조절된 항온기에 배양하였으며, pH는 초기 pH 4.0-10 범위에서 최적 조건을 결정하였다. 각 영양원 첨가에 따른 균사생육의 영향을 알아보기 위해 Czapek-Dox 한천배지(CD: glucose 1.
대상 데이터
YMG 한 천배지에서 전 배양된 균사를 cork borer (diameter, 7 mm)를 이용하여 떼어내어 한천배지상에 위치한 후, 24℃에서 15일간 배양하였다. 성장한 균사의 직경을 mm 단위까지 측정하고 밀도를 관찰하여 균사 생육도를 결정하였다.
1).균사체 배양용 배지는 Difbo사(Detroit, USA), 효소 활성 측정용 시약은 Sigma사 (St. Louis, USA)의 특급 및 일급 시약을 구입하여 사용하였다.
본 연구에 사용된 좀나무싸 리버섯 (C. pyxidata DGUM 29005, Genbank No. AY588248)은 동국대학교 미생물학 실험실에 보관 중인 균주를 계대 배양하여 사용하였다 (Fig. 1).균사체 배양용 배지는 Difbo사(Detroit, USA), 효소 활성 측정용 시약은 Sigma사 (St.
데이터처리
성장한 균사의 직경을 mm 단위까지 측정하고 밀도를 관찰하여 균사 생육도를 결정하였다. 실험은 3회 이상 반복 수행하여 균사직경의 평균 및 표준편차를 구하였다.
이론/모형
, USA)를 사용하여 15,000 psi 압력 하에서 완전히 파쇄시킨 후, 원심분리(5,000xg)한 다음 그 상 등액을 균사 내 효소 활성 측정을 위한 조효소액으로 사용하였다. 효소의 비활성도(specific activity) 측정을 위한 단백질 정량 은 Bradford 방법(1)을 사용하였고, 표준 곡선은 bovine serum albumin을 사용하여 작성하였다.
성능/효과
CD 한천배지에 각각의 인산원을 0.1% 첨가하여 실험한 결과, Na2HPO4 첨가시대 조군보다 증가된 가장 우수한 균사생육을 보여주었다. NHJePQ와 I&HPQ도 우수한 균사생육을 보여주었다(Table 3).
사용된 모든 복합배지에서의 균사생육은 차이를 보였으며, MEM을 사용하였을 경우 가장 우수한 균사생육을 보여주었다. DTM, YMM 및 MCM도 비교적 양호한 균사생육을 나타내었으나, ACM과 GPM에서의 균사 생육은 저조하였다(Table 1).
MEM 액체배지를 이용하여 24℃에서 20일간 배양된 좀나무싸 리버섯의 세포 외 분비효소 및 세포 내 효소의 비활성도를 측정한 결과, 13.88 U/mg protein으로 laccase의 효소 활성도가 가장 우수하였다. 이와 같은 결과는 Choi 등(2)이.
1% 첨가하여 실험한 결과, Na2HPO4 첨가시대 조군보다 증가된 가장 우수한 균사생육을 보여주었다. NHJePQ와 I&HPQ도 우수한 균사생육을 보여주었다(Table 3). 최적비타민원으로 p-aminobenzoic acid, riboflavin 및 folic acid를 첨가하였을 경우 균사 생육이 우수하였다(Table 3).
이러한 결과는 좀 나무싸 리버섯의 균사체 배양 및 자실체의 인공재배시 탄소원으로maltose의 사용이 좋을 것으로 사료된다. 무기질 소원 첨가에 따른 균사생육에 미치는 영향을 실험한 결과, calcium nitrate에서 가장 우수한 균사생장을 보였고, sodium nitrite# 첨가한 경우에는 균사생육이 매 우 저 조하였다(Table 2). Sodium nitrite가 아미노산을 탈아미노화하여 독성을 나타냈거나, 배지에 축적되어서 질소 요구성을 충족시킬 수 없었을 것으로 사료되며, 이는 다른 진균의 배양 형태와 유사한 경향을 나타내었다.
2). 배양 초기의 배지 pH 5.0에서 가장 좋은 균사생장을 나타내었으며, 약산성에서도 어느 정도 성장을 관찰할 수 있었으나 pH 6.0 이상에서의 균사 생육은 저조하였다 (Fig. 3).
사용된 모든 복합배지에서의 균사생육은 차이를 보였으며, MEM을 사용하였을 경우 가장 우수한 균사생육을 보여주었다. DTM, YMM 및 MCM도 비교적 양호한 균사생육을 나타내었으나, ACM과 GPM에서의 균사 생육은 저조하였다(Table 1).
보고한 황갈색 시루 뻔버섯(Inonotus mikadoi) 균사체 배양액에서 laccase의 효소 활성이 높은 결과와 유사하였다. 섬유소 분해효소인 P-glucosidase, CMCase, exo-l, 4-0-glucanase의 효소 활성도 우수하였다. a- Amylase, chitinase 및 lipase는 상대적으로 낮은 효소 활성을 나타내었으며, 측정한 세포 내 효소의 활성도가 세포 외 분비효소 활성도에 비해.
Sodium nitrite가 아미노산을 탈아미노화하여 독성을 나타냈거나, 배지에 축적되어서 질소 요구성을 충족시킬 수 없었을 것으로 사료되며, 이는 다른 진균의 배양 형태와 유사한 경향을 나타내었다. 유기질소원의 영향을 알아보기 위해 0.3%의 다양한 유기질소원을 첨가하여 실험한 결과, malt extract가 우수한 균사생육을 보여주었으나, 다른 종류의 유기질 소원 첨가시에는 비교적 저조하였다(Table 2).
James 등(6)은 fructose와 maltose의 첨가 시 좀나무싸 리버섯 자 실 체의 생산 수율이 증가함을 보고하였다. 이러한 결과는 좀 나무싸 리버섯의 균사체 배양 및 자실체의 인공재배시 탄소원으로maltose의 사용이 좋을 것으로 사료된다. 무기질 소원 첨가에 따른 균사생육에 미치는 영향을 실험한 결과, calcium nitrate에서 가장 우수한 균사생장을 보였고, sodium nitrite# 첨가한 경우에는 균사생육이 매 우 저 조하였다(Table 2).
a- Amylase, chitinase 및 lipase는 상대적으로 낮은 효소 활성을 나타내었으며, 측정한 세포 내 효소의 활성도가 세포 외 분비효소 활성도에 비해.전반적으로 높은 것으로 나타났다. 그러나 protease 의 활성은 없었다(Table 4).
좀나무싸 리버섯의 균사 생육에 영향을 미치는 탄소원을 결정하기 위해 CD 한천 배지에 각각의 탄소원을 1.0% 첨가하여 실험한 결과, 단 당류에서는 mannit이과 galactose에서 우수한 균사생 장을 나타내었고, 이당류에서는 trehalose가 가장 우수하였고, 다당류 중에서는 starch와 cellulose에서 가장 우수하였다(Table 2). James 등(6)은 fructose와 maltose의 첨가 시 좀나무싸 리버섯 자 실 체의 생산 수율이 증가함을 보고하였다.
참고문헌 (12)
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254
Choi, S.J., S.J. Kim, and Y.H. Han. 2004. Physiological characteristics and optimized culture conditions of the mycelia of Inonotus mikadoi. Kor. J. Microbiol. 40, 100-103
Erkel, G. and T. Anke. 1992. Clavicoronic acid, a novel inhibitor of reverse transcriptases from Clavicorona pyxidata (Pers.: Fr.) Doty. J. Anibiotics 45, 29-37
James, S.W. and D.J. McLaughlin. 1988. The influence of carbohydrate source and concentration and light on fruit body development in Clavicorona pyxidata. Mycologia 80, 89-98
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