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문제 정의
- 본 연구는 돼지 체외 수정란의 생산에 있어 고 품질 배반포 생산에 필요한 배양 체계를 확립하기 위하여 체외 성숙 시간이 돼지 미성숙 난자의 핵 성숙, 배 발생 및 배반포의 부화에 미치는 영향을 검토하였다.
- 본 연구는 돼지 체외 수정란의 생산에 있어서 체외성숙 시간이 핵성숙, 다정자 침입율 및 배 발 생과 배반포의 부화율 배반포의 부화에 미치는 효과를 검토하였다. 돼지 난포란의 핵성숙율이 체외성숙 36, 38, 40, 42 및 44 시간째에 각각 68.
제안 방법
- 5 〃g/ml hoechst 33342가 첨 가된 PBS 용액를 첨가하였다. Glycerol과 3:1로 혼합하여 형 광현미경에서 미성숙 난자의 핵상을 검토하였다.
- 난소의 표면을 생리 식염수로 2~3회 세척한 다음, 18-gauge가 부착된 10 ml 주 사기로 직경 3~6 mm 난포로부터 미성숙 난자를 채취하였다. 난구 세포가 치밀하게 부착되고 세포 질이 균일한 미성숙 난자를 선별하여 체외성숙에 공시하였다.
- 도축 돼지의 난소를 회수하여 25 〃g/ml genta- mycin(Sigma, G3632)。] 함유된 25~30℃의 생리 식염수가 담긴 보온병에 담아서 2~3시간 내에 실 험실로 운반하였다. 난소의 표면을 생리 식염수로 2~3회 세척한 다음, 18-gauge가 부착된 10 ml 주 사기로 직경 3~6 mm 난포로부터 미성숙 난자를 채취하였다. 난구 세포가 치밀하게 부착되고 세포 질이 균일한 미성숙 난자를 선별하여 체외성숙에 공시하였다.
- 체 외 수정까지 미성숙 난자는 35 mm petri dish에 mineral oil로 피복된 48 “I의 mTBM 용액 소적에 25 - 30개씩을 넣고 배양하였다. 미세 소적에 상기에서준비한 정자 2 “1(최종 DIO, spermatozoa/ml)씩 을 넣고 39℃, 5% CO2 배양기에서 6시간 동안 배 양함으로서 체외 수정을 유도하였다.
- I 센터 에서 제조한 희석 정액을 사용하였으며, 17℃에 보 관되어 5일 동안에 사용하였다. 정액을 2 ml 90% percoll 및 2 ml 45% percoll이 담겨져 있는 15 ml 원심 분리관(Falcon, 2097)의 상층에 조심스럽게 놓고 500><g에서 20분간 원심분리 후 하층부의 정 자괴만을 회수하였다. 회수한 정자괴를 1 mg/ml BSA(Sigma A6003), 100 jeg/ml penicillin(Sigma, P3032) 및 75 “g/ml streptomycin(Sigma, S9137)이 함유 된 D-PBS(Gibco.
- 체외 성숙 36, 38, 40, 42 및 44 시간째에 미성숙 난자를 회수하여 acetic acid : ethanol = 1: 3으로 혼합한 용액에 10 min 처리한 후 sodium azide 2.5 mg/ml 및 2.5 〃g/ml hoechst 33342가 첨 가된 PBS 용액를 첨가하였다. Glycerol과 3:1로 혼합하여 형 광현미경에서 미성숙 난자의 핵상을 검토하였다.
- 체외 성숙 36시간, 38시간, 40시간, 42시간 및 44시간 동안 체외 성숙된 돼지 미성숙 난자를 0.1% hyaluronidase가 함유된 TALP 용액에 넣어 연속적 으로 피펫팅을 하여 난구 세포를 제거하고, mTBM 배양액으로 3회 세정한 후 수정에 제공하였다. 체 외 수정까지 미성숙 난자는 35 mm petri dish에 mineral oil로 피복된 48 “I의 mTBM 용액 소적에 25 - 30개씩을 넣고 배양하였다.
- 체외 수정 후 10-12 시간이 지난 난자는 acetic acid와 ethanol을 1:3으로 혼합한 용액에 48시간이상 고정시킨 후 1% orcein과 45% acetic acid로 염색한 후 위상차현미경하에서 정자의 침입 및 웅성 전핵의 형성을 조사하였다.
- 체외 수정된 수정 란(배 양 0일)은 TALP 용액으 로 3회 세척하였고, PZM3 배양액으로 2~3회 다시 세척한 후 미리 준비한 50 “1의 PZM3 배양액 에 25~30개씩 넣어 39℃, 5% CO2 배 양기에서 배 양하였다.
- 선별된 미성숙 난자를 TALP 용액으로 2~3회 세척하였다. 체외성숙용 배지가 500 “1씩 분주된 4-well dish(Nunc, Denmark)에 50개의 미성숙 난자 를 넣고, 22시간 동안 배양시킨 후 PMSG와 hCG가 첨가되지 않은 체외 성숙 배지에서 다시 22시간 동안 39℃, 5% CO2 배양기에서 배양함으로써 체외 성숙을 유도하였다.
- 정액을 2 ml 90% percoll 및 2 ml 45% percoll이 담겨져 있는 15 ml 원심 분리관(Falcon, 2097)의 상층에 조심스럽게 놓고 500><g에서 20분간 원심분리 후 하층부의 정 자괴만을 회수하였다. 회수한 정자괴를 1 mg/ml BSA(Sigma A6003), 100 jeg/ml penicillin(Sigma, P3032) 및 75 “g/ml streptomycin(Sigma, S9137)이 함유 된 D-PBS(Gibco. Cat. No. 14287-080)에서 500xg로 5분간 원심분리를 2회하여 세척하였다. 세척 후 상층액을 제거하고 회수한 정자괴를 mTBM 용액 으로 최종 농도가 3><106 spermatozoa/ml°] 되도록 희석하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 돼지 정액은 다비 A . I 센터 에서 제조한 희석 정액을 사용하였으며, 17℃에 보 관되어 5일 동안에 사용하였다. 정액을 2 ml 90% percoll 및 2 ml 45% percoll이 담겨져 있는 15 ml 원심 분리관(Falcon, 2097)의 상층에 조심스럽게 놓고 500><g에서 20분간 원심분리 후 하층부의 정 자괴만을 회수하였다.
- 본 실험에 사용된 기초 배지로서 난소로부터 미 성숙 난자 회수용 배지는 25 mM HEPES와 3 mg/ ml bovine serum albumin(BSA, Sigma, A6003)가 첨 가된 TALP, 체외 성숙용 배지는 0.57 mM cysteine (Sigma, C7352), 10% porcine follicular fluid(pFF),2.5 mM -mercaptoethanol, lOng/ml epidermal growth factor(EGF), 10 lU/ml human chorionic gonadotro- pin(hCG), 10 lU/ml pregnant mare serum gonado- tropin(PMSG)을 첨가한 BSA-free NCSU23(North Carolina State University 23) 이다. 체외 수정용 배지 는 1 mg/ml BSA와 2.
- 본 실험에 사용된 돼지 정액은 다비 A . I 센터 에서 제조한 희석 정액을 사용하였으며, 17℃에 보 관되어 5일 동안에 사용하였다.
성능/효과
- 돼지 미성숙 난자의 체외 성숙 시간에 따른 배 발생과 배반포 부화율을 검토한 결과는 Table 3과 같다. 2세포기 발달율을 기준으로 수정 능력을 판 단하였을 때 체외 성숙 36시간군이 77.3%로서 가장 높았고, 이것은 체외 성숙 40 및 44시간의 70.6 및 70.3%와는 유의차가 인정되었다(p<0.05). 배반 포 발달율은 38시간군의 23.
- 05). 따라서 돼지 난포란의 44시간 체외 성숙이 배 발생에 비효과적이었다.
- 또한 제 2감수 분 열 중기의 방추사의 노화로 인해 방추사가 파괴되고 그에 따른 염색체의 손실도 발생한다고 보고하 였다(Austin, 1967). 따라서 본 연구 결과에서는 체 외 성숙 시간에 따른 다정자 침입율과 수정율의 차이가 나타나지 않았다. 그러므로 체외 성숙 시간을 36시간까지 단축하더라도 문제가 없을 것으로 사료된다.
- 따라서 돼지 미성숙 난자로부터 돼지 수 정 란의 체외 생산은 생산 효율과 결과의 재현성을 고려할 때 체외 수정 및 체외 배양법의 개발보다 는 체외 성숙 체계의 확립이 선행되어야 할 것이다. 따라서 본 연구의 결과에서 44시간 동안의 체 외 성숙은 돼지 미성숙 난자의 배반포 형성율에 비효과적인 것으로 사료된다.
- 05). 배반 포 발달율은 38시간군의 23.1%가 체외성숙 44시 간군의 15.6%보다 유의하게 높았다(p<0.05). 배반 포의 부화율은 체외성숙 38시간군이 16.
후속연구
- 그러나 위와 같은 연구에도 불구하고 돼지 미성숙 난자의 체외 발달 에 관한 연구 결과는 만족할 수준에 이르지 못하고 있다. 따라서 돼지 미성숙 난자로부터 돼지 수 정 란의 체외 생산은 생산 효율과 결과의 재현성을 고려할 때 체외 수정 및 체외 배양법의 개발보다 는 체외 성숙 체계의 확립이 선행되어야 할 것이다. 따라서 본 연구의 결과에서 44시간 동안의 체 외 성숙은 돼지 미성숙 난자의 배반포 형성율에 비효과적인 것으로 사료된다.
- 이와 같은 원인으로 돼지의 배반포는 대리모에 이식하여 산자를 생산하는 것이 다른 가축에 비해 아주 어렵다. 따라서 이식 후 산자 생산까지 보장할 수 있는 고품질 배반포를 생산할 수 있는 체계의 확립이 필요하며, 특히 단 순한 배 발생뿐만 아니라 배반포 부화율의 조사도 필요하다.
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