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문제 정의
- 그러나 체외의 작용 기전에 대하여는 세포의 분화, 기질 형성, 세포 이동 등의 세포 작용에 긴밀히 작용하며, TGF-/9(Larson 등, 1992)와 더불어 세포외 기질의 steroid 생산(Sordoillet 등, 1992)과 침착 등에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으 므로(Baird와 Klagsbrun, 1991), 이는 난자 형성에 FGF의 역할이 크다는 것을 증명한다고 할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 FGF가 난포란의 체외 성숙에 미치는 영향과 동시에 체외 성숙된 난포란 의 체외 발달을 조사하기 위하여 실시하였다.
- 이에 따라 체외 성숙 및 체외 발달에 사용되는 배양액의 조성도 복합 배양액에서 단순 배양액으로 전환을 시도하고 있으며, 체내의 조건에 보다 더 접근하고자 하는 시도들이 수행되고 있다. 본 연구는 한우 난포란의 성숙시 FGF의 첨가가 체외 성숙율 및 체외 수정 후 배발달율에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. 한우 난포란의 체외 성숙시 FGF를 0.
제안 방법
- Caffein과 heparin이 함유된 BO 배양액으로 한우 동결 정액을 사용하여 체외 수정능 획득 반응을 유도하였다. 체외 수정 정자의 최종 농도는 IxlO6 cells/ml로 조정하였으며 체외 성숙된 난 포란을 이용한 체외 수정시간은 8시간 이상 실시하였다.
- 난포란의 배양을 위하여 0.1% PVA-HPM 199(Inst. of Functional peptide, Japan: IFP971) 배양액을 이용하였으며, 난포란의 체외 성숙을 위해서 FGF(Sig-ma, USA)를 0, 0.1, 1, 10 ng/ml의 농도로 HPM 199 배양액에 첨가하였다. 핵성숙도의 평가는 6, 12, 24시간 후에 관찰하였으며, Basic Fuchsin을 이용한 rapid staining 방법 (Byun 등, 1991)을 이용하여 핵상의 변화를 조사하였다.
- 도축 암소의 난소를 25 ℃ 의 생리 식염수에 침지하여 실험실로 운반하였고, 난소를 깨끗한 생리식염수로 3회 이상 세정한 후 70% 알코올을 사용하여 난소의 표면을 소독하였다. 난포란의 채취를 위
- 체외 수정 후 체외 발달율을 조사하기 위하여 50 “1 배양액 drop에 체외발달을 유도하였다. 또한 소난포란의 체외 발달율을 조사하기 위하여 FGF 로 체외 성숙된 난자를 체외 수정 후, 0.1% PVA-HPM 199, 10% FBS-HPM 199, 0.8% BSA-HPM 199 배 양액 과 IVMD(Inst. of Functional peptide, Japan), IVD(Inst. of Functional peptide, Japan)로 체외 배양을 실시하여 배발달율을 조사하였다.
- 소의 체외 수정에 있어서 단순 배양액의 이용은 10여년 전부터 성행하기 시작하였으며, 주로 단백질, 아미노산, 비타민 그리고 약간의 growth factor와 insulin 등을 첨가하거나 혹은 첨가하지 않은 배양액에서 수정란의 발달을 조사하였다. 여러 가지 종류의 growth factor들은 수정란의 발달 과정 중 수정란에서 혹은 자성 생식 기관에서 분비되는 것으로 알려져 있다.
- 체외 수정 정자의 최종 농도는 IxlO6 cells/ml로 조정하였으며 체외 성숙된 난 포란을 이용한 체외 수정시간은 8시간 이상 실시하였다. 체외 수정 후 체외 발달율을 조사하기 위하여 50 “1 배양액 drop에 체외발달을 유도하였다. 또한 소난포란의 체외 발달율을 조사하기 위하여 FGF 로 체외 성숙된 난자를 체외 수정 후, 0.
대상 데이터
- 해서 18 gauge 주사침이 부착된 10 ml 주사기로 직경 2~6 mm 난포의 난소 실질을 주사침으로 삽입하면서 난포를 찔러 난포액과 함께 흡입하여 채취하였으며, 채취된 난포액에서 난구 세포가 충만한 난포란 만을 선별하여 본 시험에 공시하였다.
데이터처리
- 발달율은 Statview 통계 program의 ANOVA test를 이용하여 통계 분석을 실시하였다.
이론/모형
- 1, 1, 10 ng/ml의 농도로 HPM 199 배양액에 첨가하였다. 핵성숙도의 평가는 6, 12, 24시간 후에 관찰하였으며, Basic Fuchsin을 이용한 rapid staining 방법 (Byun 등, 1991)을 이용하여 핵상의 변화를 조사하였다.
성능/효과
- Table 2와 같다. FGF 의 첨가 농도(0, 0.1, 1, 10 ng/ ml)에 따라 분할율은 56.8~85.7%로 유의적인 차이가 인정되지 않았으나(?>0.05), 배반포 발달율은각각 25.0, 9.5, 0, 2.9%를 나타내어 무첨가 대조군에 비해 FGF 첨가군에서 낮았다3<0.05).
- 05). FGF로 체외 성숙된 난 포란을 체외 수정 후 10% FBS-HPM 199, 0.8% BSA- HPM 199 및 0.1% PVA-HPM에 배양한 결과 12.4, 12.8, 8.5%의 배반포 발달율을 보였으며, 무 혈청배양액 인 IVMD, IVD에 배양한 결과 38.4 및 34.8%의 배반포 발달율로 유의적인 차이를 나타냈다 3<0.05). 결론적으로 FGF는 한우 난포란의 체외성숙 시 유용한 물질이나, 한우 난자의 체외 발달에는 단독의 효과를 기대할 수 없었으며, 다른 생리활성 인자들 간의 상호 관계에 대하여 더 많은 연구가 요구된다.
- 그러나 FGF 첨가 농도간에는 차이가 인정되지 않았다. FGF로 체외 성숙된 난포란의 체외 수정 후 배발달율은 0,0.1, 1, 10 ng/ml FGF 첨가군에서 각각 25.0, 9.5, 0, 2.9%를 보여, 무첨가 대조군에 비해'FGF 첨가 군에서 낮았다(p<0.05). FGF로 체외 성숙된 난 포란을 체외 수정 후 10% FBS-HPM 199, 0.
- Table 3과 같다. HPM 199를 기본 배양액으로 10% FBS, 0.8% BSA, 0.1% PVA를 첨가하였을 때의 수정율은 각각 86.7, 78.7, 84.9%를 나타내 었고, 무혈청 배양액인 IVMD와 IVD에서는 각각 92.9, 88.7%의 수정율을 나타내었다(次0.05). 그러나 배양액에 따른 배반포 형성율은 HPM 199에 10% FBS, 0.
- 그러나 체외 배양 결과 분할율은처리군 간에 차이가 없었으나, 배반포 발달율은 대조군에 비해 FGF 첨가군이 낮았다. TCM 199 base 의 배양액인 HPM 199에 혈청, BSA, PVA를 첨가한 것은 macromolecule의 효과를 기대할 수 있었으나, 체외 수정란의 생산은 거대 분자에만 의존되는 것이 아님을 보여주듯이 BSA를 위주로 한 IVMD와 IVD에서 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 이는 Yamashita 등(1999)이 배반포 생산에 동일 배양액을 이용한 결과와 유사한 결과를 나타내었다.
- 본 연구의 결과와 같이 FGF는 체외에서 세포의 분화와 난자 형성 등에 중요한 역할을 하는 것으로 Table 1과같이 알 수 있었으나, Sordoillet 등(1992)과 같이 steroid를 체외에서 생산함으로 난자의 분할에 영향을 미칠 것으로 기대하였으나, Leydig 세포의 배양 시 steroid를 분비하나 공배양 세포가 난구 세포인 경우는 FGF의 영향에 의해 steroid가 형성되지 않는 것으로 사료된다. 결론적으로 FGF는 한우 난포란의 체외성숙에 중요한 요소이나, 체외 수정란의 배발달에는 거의 역할을 하지 못하는 것으로 나타났다. 그러나 TGF-B 와 함께 steroid 형성을 유도한다고 함으로 공동배양을 통한 synergy 효과에 대하여 더욱 많은 연구가 요구되며, 이와 같은 생리 활성인자와의 autocrine/ paracrine 유형에 대한 난자의 핵성숙과 발달에 관한 연구가 더욱 더 요구된다고 하겠다.
- 05). 그러나 배양액에 따른 배반포 형성율은 HPM 199에 10% FBS, 0.8% BSA, 0.1% PVA를 첨가하였을 때, 각각 12.4, 12.8, 8.5%를 나타내었고, 무혈청 배양액인 IVMD와 IVD에서 각각 38.4, 34.8%의 배반포 발달율을 나타내어 유의적인 차이를 보였다3<0.05).
- 결과이었다. 그러나 체외 배양 결과 분할율은처리군 간에 차이가 없었으나, 배반포 발달율은 대조군에 비해 FGF 첨가군이 낮았다. TCM 199 base 의 배양액인 HPM 199에 혈청, BSA, PVA를 첨가한 것은 macromolecule의 효과를 기대할 수 있었으나, 체외 수정란의 생산은 거대 분자에만 의존되는 것이 아님을 보여주듯이 BSA를 위주로 한 IVMD와 IVD에서 좋은 결과를 얻을 수 있었다.
- 특히 난포 발달의 마지막 단계에 과립막세포와 협막세포(Skinner와 Coffey, 1988)의 기능을 향상시키는 autocrine/paracrine의 매 개물질로서 중요한 역할을 한다고 하였다(Philip과 Claire, 2003). 그리 하여 TGF-B 와 bFGF의 상승효과를 기대하여 공동첨가 하였을 때, 소 수정란의 in vitro blocke 극복할 수 있었으나, 배반포의 형 성은 극히 저조하였다. 이와 같이 TGF-B를 비롯한 growth factor들은 난포에서 난자의 성숙에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 각각 단 독 처리의 결과는 알 수가 없었다.
- Table 1과 같다. 난포란의 체외 성숙은 6시간째에 GV가 개시되었으며, 12시간째부터 Met I 의 형태를 보이기 시작하였고, 24시간째에는 Met II까지의 성숙율은 FGF 첨가군이 70.0~75.0%로서 무첨가 대조군의 37.5%에 비해 유의적으로 높았으며 3<0.05), FGF 처리 농도에 의한 성숙율의차이는 인정되지 않았다.
- 본 연구에서는 FGF가 난포의 과립막 세포의 분화를 촉진한다고 알려져 있으나, FGF를 이용한 난포란의 핵성숙에 대한 연구가 없어 실시한 결과 Table 1과 같이 FGF 첨가군이 무첨가 대조군에 비해 유의적으로 높은 성숙율을 보였으며, 첨가 농도에 따른 차이가 없이 체외 성숙이 개시됨을 나타내었으며, 이와 같은 결과는 Keefer 등(1994)과 같은 결과이었다. 그러나 체외 배양 결과 분할율은처리군 간에 차이가 없었으나, 배반포 발달율은 대조군에 비해 FGF 첨가군이 낮았다.
- 즉 생리 활성 물질이 수정란의 배발달에 중요한 역할을 하고 있음을 나타낸다고 할 수 있다(Heyner 등, 1993; Vaughan 등, 1992; Werb, 1990). 본 연구의 결과와 같이 FGF는 체외에서 세포의 분화와 난자 형성 등에 중요한 역할을 하는 것으로 Table 1과같이 알 수 있었으나, Sordoillet 등(1992)과 같이 steroid를 체외에서 생산함으로 난자의 분할에 영향을 미칠 것으로 기대하였으나, Leydig 세포의 배양 시 steroid를 분비하나 공배양 세포가 난구 세포인 경우는 FGF의 영향에 의해 steroid가 형성되지 않는 것으로 사료된다. 결론적으로 FGF는 한우 난포란의 체외성숙에 중요한 요소이나, 체외 수정란의 배발달에는 거의 역할을 하지 못하는 것으로 나타났다.
- 소난포란의 체외 성숙은 과립막 세포, 난자의 핵 성숙을 촉진하는 미지의 혈청내의 물질뿐만 아니라, 호르몬이나 생리 활성 인자 등에 의해 촉진됨이 밝혀졌다. 이에 따라 체외 성숙 및 체외 발달에 사용되는 배양액의 조성도 복합 배양액에서 단순 배양액으로 전환을 시도하고 있으며, 체내의 조건에 보다 더 접근하고자 하는 시도들이 수행되고 있다.
- 본 연구는 한우 난포란의 성숙시 FGF의 첨가가 체외 성숙율 및 체외 수정 후 배발달율에 미치는 영향에 대하여 조사하였다. 한우 난포란의 체외 성숙시 FGF를 0.1, 1, 10 ng/ml를 첨가하였을 때 24시간째에 Metaphase U 도달율은 각각 72.7, 70.0, 75.0%로서 무첨가 대조군의 37.5%에 유의 적으로 높은 성숙율을 보였다3<0.05). 그러나 FGF 첨가 농도간에는 차이가 인정되지 않았다.
후속연구
- 05). 결론적으로 FGF는 한우 난포란의 체외성숙 시 유용한 물질이나, 한우 난자의 체외 발달에는 단독의 효과를 기대할 수 없었으며, 다른 생리활성 인자들 간의 상호 관계에 대하여 더 많은 연구가 요구된다.
- 결론적으로 FGF는 한우 난포란의 체외성숙에 중요한 요소이나, 체외 수정란의 배발달에는 거의 역할을 하지 못하는 것으로 나타났다. 그러나 TGF-B 와 함께 steroid 형성을 유도한다고 함으로 공동배양을 통한 synergy 효과에 대하여 더욱 많은 연구가 요구되며, 이와 같은 생리 활성인자와의 autocrine/ paracrine 유형에 대한 난자의 핵성숙과 발달에 관한 연구가 더욱 더 요구된다고 하겠다.
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