산왕거미 (Araneus ventricosus) 혈구의 유형을 세포화학적 및 percoll 밀도구배를 이용한 물리화학적 특성에 따라 구분하고, 각각의 미세구조를 고배율의 전자현미경으로 비교 관찰하였다. 혈구는 세포질에 함유된 과립의 유무에 따라 과립혈구와 무과립혈구로 구분되었으며. 과립혈구는 과립의 특성에 따라 다시 산호성 과립혈구와 염기호성 과립혈구, 그리고 헤모시아닌 과립을 함유한 혈색소혈구의 세 가지 유형으로 세분되었다. 산호성 과립혈구는 전체 혈구유형중 약 5%정도를 차지하였으며, 염기호성 과립혈구는 산호성 과립혈구에 비해 과립의 크기가 크고 구형이었다. 한편 무과립혈구는 혈구중 가장 크기가 작은 투명혈구와 심관의 내강에 주로 분포하는 편도혈구, 그리고 탈피 시에만 출현하는 대형의 탈피혈구로 다시 세분되었다.
산왕거미 (Araneus ventricosus) 혈구의 유형을 세포화학적 및 percoll 밀도구배를 이용한 물리화학적 특성에 따라 구분하고, 각각의 미세구조를 고배율의 전자현미경으로 비교 관찰하였다. 혈구는 세포질에 함유된 과립의 유무에 따라 과립혈구와 무과립혈구로 구분되었으며. 과립혈구는 과립의 특성에 따라 다시 산호성 과립혈구와 염기호성 과립혈구, 그리고 헤모시아닌 과립을 함유한 혈색소혈구의 세 가지 유형으로 세분되었다. 산호성 과립혈구는 전체 혈구유형중 약 5%정도를 차지하였으며, 염기호성 과립혈구는 산호성 과립혈구에 비해 과립의 크기가 크고 구형이었다. 한편 무과립혈구는 혈구중 가장 크기가 작은 투명혈구와 심관의 내강에 주로 분포하는 편도혈구, 그리고 탈피 시에만 출현하는 대형의 탈피혈구로 다시 세분되었다.
Hemocytes of the spider Araneus ventricosus were investigated with histochemistry, density analysis of percoll gradient, and fine structural examinations using transmission electron microscope. The hemocytes of this spider were classified into two major groups: granulocytes and non-granulocytes. The...
Hemocytes of the spider Araneus ventricosus were investigated with histochemistry, density analysis of percoll gradient, and fine structural examinations using transmission electron microscope. The hemocytes of this spider were classified into two major groups: granulocytes and non-granulocytes. The granular hemocytes were subdivided into three subtypes according to their histochemical properties which are eosinophilic granuloctes(EGs), basophilic granulocytes(BGs) and cyanocytes. The EGs, which have small granules within the cytoplasm comprise about 5% of the total henocytes. However the granules of BGs are larger than those of HGs. The cyanocytes were characterized to contain hemocyanin granules in their cytoplasm. On the other hand, the non-granulocytes were divided into three subtypes; hyaline leucocytes, oenocytoids, and molting homocytes. The hyaline leucocytes are the most abundant and the smallest hemocyte type in this spider. The oenocytoids that have $10{\sim}15{\mu}m$ in diameter are mostly found at the marginal region of the myocardium in the heart tube. The molting hemocytes, which only appeared during the molting period, contains plenty of glycogen particles in their cytoplasm.
Hemocytes of the spider Araneus ventricosus were investigated with histochemistry, density analysis of percoll gradient, and fine structural examinations using transmission electron microscope. The hemocytes of this spider were classified into two major groups: granulocytes and non-granulocytes. The granular hemocytes were subdivided into three subtypes according to their histochemical properties which are eosinophilic granuloctes(EGs), basophilic granulocytes(BGs) and cyanocytes. The EGs, which have small granules within the cytoplasm comprise about 5% of the total henocytes. However the granules of BGs are larger than those of HGs. The cyanocytes were characterized to contain hemocyanin granules in their cytoplasm. On the other hand, the non-granulocytes were divided into three subtypes; hyaline leucocytes, oenocytoids, and molting homocytes. The hyaline leucocytes are the most abundant and the smallest hemocyte type in this spider. The oenocytoids that have $10{\sim}15{\mu}m$ in diameter are mostly found at the marginal region of the myocardium in the heart tube. The molting hemocytes, which only appeared during the molting period, contains plenty of glycogen particles in their cytoplasm.
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문제 정의
따라서 본 연구는 국내에 서식하는 왕거미종류 중에서 가장 몸체가 커서 대형의 곤충류를 포식하는 대표적 정주성거미인 산왕거미 (Araneus ventricosus)를 실험재료로 하여 미세구조적 및 세포화학적 특성을 기준으로 혈구의 구분을 시도하였다. 특히 percoll 밀도구배를 이용하여 객관적인 혈구의 구분을 시도하였으며, 탈피를 전후하여 혈구의 변화가 극심한 거미류의 생리특성을 고려하여 인공 사육을 통해 탈피시기의 거미를 확보하고, 이를 비탈피 시기의 혈구와 비교분석도 병행하였다.
제안 방법
Percoll gradients를 제조하기 위해 멸균 후 6 M urea (pH 2)로 수세한 polycarbonate 원심분리튜브와 20마리의 거미로부터 채취된 200μL의 혈림프를 분석시료로 사용하였다. 전체 7 mL의 60% percoll gradients를 제조하기 위해 원심분리 튜브 내에 3.
각 혈구의 운동성 및 접착성을 비교 관찰하기 위하여 산왕거미를 이산화탄소로 마취시킨 후, 부속지의 기부를 절단하고 10~20 μL 모세관 튜브를 이용하여 혈림프를 채취하였다. 채취된 혈림프의 일부를 슬라이드 글라스 위에 도말하여 Wright-Giemsa 염색을 실시한 후, 고배율의 광학현미경으로 관찰하였다.
채집한 거미들은 양면이 유리로 된 40×40 ×10cm 크기의 목재 사육조에 옮기고 안정화시킨 후, 갈색거저리(Tenebrio molitor) 유충을 먹이로 사육하였다. 거미줄을 만드는 행동 습성과 먹이에 대한 거부반응 등을 토대로 탈피시기에 접어든 개체들을 선별하였으며, 이들을 발생단계별로 구분하여 실험에 사용하였다.
채취된 혈림프의 일부를 슬라이드 글라스 위에 도말하여 Wright-Giemsa 염색을 실시한 후, 고배율의 광학현미경으로 관찰하였다. 또한 순환 혈구에 대한 세포화학적 특성을 확인하기 위하여 0.01% gentian violet, Wright-Giemsa, Periodic acid Schiff(PAS),Sudan black B 등의 특이적 염색도 병행하여 실시하였다.
분리된 혈구 분획의 일부는 슬라이드 글라스에 도말한 후, methanol로 고정하고 Wright-Giemsa로 염색하여 각 밴드에서 나타난 혈구의 유형을 구분하였으며 일부는 투과전자현미경 시료로 제작하였다. 투과전자현미경 관찰을 위한 시료는 채취된 혈림프를 원심분리한 후, 2.
원심분리후에 나타난 혈구의 밴드는 마이크로 팁을 이용하여 추출하였으며, percoll의 침전물을 제거하기위해 거미생리식염용액 (Groomeetal, 1991)과 항응고제의 혼합액이 담겨져 있는 튜브에 옮겨 담은 후, 2,000rpm으로 원심분리하여 순수한 혈구 분획을 추출하였다. 분리된 혈구 분획의 일부는 슬라이드 글라스에 도말한 후, methanol로 고정하고 Wright-Giemsa로 염색하여 각 밴드에서 나타난 혈구의 유형을 구분하였으며 일부는 투과전자현미경 시료로 제작하였다.
관찰하였다. 이어서 60~80 nm 두께의 초박절편을 제작하여 copper grid에 부착시킨 다음, uranyl acetate와 lead citrate로 이 중 염색하여 JEOL 100 CX-ll형 (Japan) 투과전자현미경으로 80kV에서 관찰하였다.
6 mL의 EGTA를 넣어 22,000g (2℃)로 20분간 18° 각도의 A100S-10 로터에서 Supra 25K 고속원심분리기를 이용하여 원심분리시켰다. 제조된 60% percoll 혼합액에 곧바로 준비된 혈림프 시료를 주입하고 750g(2℃)에서 20분간 동일한 방법으로 원심분리를 시행하였다.
채취하였다. 채취된 혈림프의 일부를 슬라이드 글라스 위에 도말하여 Wright-Giemsa 염색을 실시한 후, 고배율의 광학현미경으로 관찰하였다. 또한 순환 혈구에 대한 세포화학적 특성을 확인하기 위하여 0.
분리된 혈구 분획의 일부는 슬라이드 글라스에 도말한 후, methanol로 고정하고 Wright-Giemsa로 염색하여 각 밴드에서 나타난 혈구의 유형을 구분하였으며 일부는 투과전자현미경 시료로 제작하였다. 투과전자현미경 관찰을 위한 시료는 채취된 혈림프를 원심분리한 후, 2.5% paraformaldehyde-glutaralde- hyde (4℃, 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4, Kamovsky, 1965)와 1% OsO4 (4℃, 0.1 M phosphate buffer, pH7.4)로 전 및 후고정하였다. 고정이 끝난 재료는 완충용액 (4℃, 0.
혈구의 구분을 시도하였다. 특히 percoll 밀도구배를 이용하여 객관적인 혈구의 구분을 시도하였으며, 탈피를 전후하여 혈구의 변화가 극심한 거미류의 생리특성을 고려하여 인공 사육을 통해 탈피시기의 거미를 확보하고, 이를 비탈피 시기의 혈구와 비교분석도 병행하였다.
포매된 조직은 먼저 ultramicrotome(LKB-2088)으로 준초박절편(semi-thin section)을 제작한 다음, 1% toluidine blue로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 이어서 60~80 nm 두께의 초박절편을 제작하여 copper grid에 부착시킨 다음, uranyl acetate와 lead citrate로 이 중 염색하여 JEOL 100 CX-ll형 (Japan) 투과전자현미경으로 80kV에서 관찰하였다.
한편, 혈림프내 혈구의 유형을 보다 객관적으로 구분하기 위하여 percoll의 밀도구배를 이용하여 혈구를 분리하였다. Percoll gradients를 제조하기 위해 멸균 후 6 M urea (pH 2)로 수세한 polycarbonate 원심분리튜브와 20마리의 거미로부터 채취된 200μL의 혈림프를 분석시료로 사용하였다.
대상 데이터
7, 8월 중 충남 천안시 안서동 소재 단국대학교 천안캠퍼스 주변에서 채집한 왕거미과의 산왕거미 (Araneus ventricosus)를 실험재료로 사용하였다. 채집한 거미들은 양면이 유리로 된 40×40 ×10cm 크기의 목재 사육조에 옮기고 안정화시킨 후, 갈색거저리(Tenebrio molitor) 유충을 먹이로 사육하였다.
성능/효과
함유한 혈구로 추정된다. 고배율의 전자현미경상에서 세포질에 전형적인 단백질의 결정구조를 가진물질들이 다수 함유되어 있음이 관찰되었는데, 이미보고된 바 있는 헤모시아닌 결정체의 미세구조적 특성과 일치하는 것으로 확인되었다. Fahrenbach (1970)는 절지동물인 투구게 종류에서 푸른색을 띠는 혈색소 단백질을 함유한 혈구를 보고하였는데, 곤충의 편도혈구에 함유된 물질과 유사한 헤모시아닌 결정체인것으로 밝혀졌다(Paul, 1992).
본 실험에서 산왕거미의 혈구를 percoll의 밀도구배 원리를 이용하여 각 혈구의 집단을 분리하고, 보고된 혈구의 세포화학적(Fenoglio et al., 1993; Hernandez et al., 1999) 및 미세구조적 특성(Brehelin et al., 1978; Chang & Yoe, 1995)을 비교 분석한 결과, 세포질에 함유된 과립의 유무에 따라(Joshi & Lambdin, 1996) 과립혈구와 무과립혈구의 두 가지 유형으로 대별할 수 있었다. 과립혈구는 함유된 과립의 세포화학적 특성에따라 다시 산호성 과립혈구(eosinophilic granulocytes), 염기호성 과립혈구(basophilic granulocytes), 혈색소혈구(cyanocytes)의 세 가지 유형으로 구분되었으며, 무과립혈구는 투명혈구(hyaline leucocytes)와 편도혈구 (oenocytoids), 그리고 특이하게 탈피시에만 나타나는 탈피혈구(molting hemocytes)의 세 유형으로 세분되었다.
보고하였다. 본 실험에서도 유사한 결과가 나왔는데, 비탈피 시기에 전체 약 70~80%로 존재하는 투명혈구의 수가 탈피시기중 약 10% 미만까지 감소하였으나, 탈피혈구를 제외한 다른 혈구들의 수는 그다지 큰 변화를 보이지 않았다.
산호성 과립혈구는 전체 혈구의 약 5~10%를 차지하는데, 구형 또는 난형으로 직경은 약 10~16μm 정도로 관찰되었다. 핵은 한쪽으로 치우쳐져 있고 세포질 전역에 산재해 있는 과립들은 직경이 0.
, 2000; Lowenberger, 2001). 산호성 과립혈구는 조직화학반응의 결과, PAS염색에 약한 양성반응을 보이는 과립들이 함유되어 있었고, 전자현미경 관찰에서 이차 라이소좀과 식세포작용을 짐작케 하는 식포가 세포질에 다수 형성되어 있었다. 반면, 염기호성 과립혈구는 탈피 시에 과립의 전자밀도가 매우 낮은 상태로 변하였으며, 혈구의 수도 탈피후 1일부터 7일까지 점진적으로 증가되었다.
산호성 과립혈구에 함유된 세포질의 과립들은 구형 또는 타원형으로, 과립의 크기가 염기호성 과립혈구에 비해 작고 전자밀도는 높게 관찰되었다. 반면 염기호성 과립혈구에 함유된 대형의 과립들은 비교적 전자밀도가 낮았고, 보고된 바와 마찬가지로(Ravindranath, 1977), 혈구에 따라 밀도의 차이가 있는 것으로 확인되었다.
이들의 크기는 단축, 장축이 각각 12,24μm로 순환혈구 중 가장 큰 혈구인 것으로 확인되었다. 세포질에는 세포소기관의 발달이 미약하였고, 다양한 크기의 소포들과 다량의 헤모시아닌 결정체들이 다발을 이루고 있음이 확인되었다(Fig. 3B). 이들은 종단 단면에서 명대와 암대가 교대로 배열된 형태로 관찰되었으며, 횡단 단면에서는 직경이 약 150nm이고 두께가 약 80nm에 달하는 육각형 의 격자구조로 관찰되 었다 (Fig.
탈피혈구의 수는 탈피가 일어나기 약 3일전부터 출현하기 시작하여 탈피시에 최고도에 도달하게 되며, 탈피 후 5일경부터 그 수가 급격히 감소하였다. 세포화학반응의 결과, 탈피 후 7일경 탈피 혈구의 세포질 일부에서 PAS 양성반응이 관찰되었는데, 전자현미경 관찰에서 이 시기의 탈피혈구에 글리코겐 과립들이 액포의 가장자리에서 축적되어 있음이 확인되었다 (Fig. 4H).
염기호성 과립혈구는 전체 혈구의 약 15~20%를 차지하였고, 세포질에 함유된 과립의 직경이 산호성 과립혈구에 비해 대형이며, Wright-Giemsa 염색에 푸른색으로 흐리게 염색되었다. 염기호성 과립혈구는 전자현미경 관찰에서 방추형, 또는 타원형으로 구분되는데, 방추형의 경우 장축의 길이는 최고 25 μm에 달하며, 핵은 난형 또는 타원형으로 세포의 중앙에 위치하였다(Fig.
3μm인 비교적 소형의 구형과립들로 Wright-Giemsa 염색에 붉은색으로 강하게 염색되었다. 전자현미경 관찰에서 산호성 과립혈구는 염기호성 과립혈구의 과립에 비해 상대적으로 전자밀도가 높았으며 세포질 내에 유리 리보솜이 산재되어 있음이 관찰되었다(Fig. 2A,B).
핵이 전체 세포의 대부분을 차지할 정도로 세포질에 대한 핵의 비율이 높은 특징을 지니고 있었고, 세포질에는 특이 소견의 과립성분이 함유되어 있지 않아서 광학현미경하에서 세포질이 투명하게 관찰되었다. 전자현미경을 이용한 미세구조의 관찰에서 세포질 전역에 걸쳐 조면 소포체와 유리 리보솜이 산재되어 있음이 확인되었고 세포의 가장자리를 따라 동심원상으로 배열된 미세소관(marginal microtubules)도 관찰되었다 (Fig. 3E, F).
상층은 혈구들의 응고물질이 걸려있는 층으로 전체 혈구의 80~90%가 과립혈구들로 이루어져 있었으며, 하층에서는 무과립혈구들이 70~80%를 차지하고 있었다. 즉, 과립혈구는 무과립혈구에 비해 상대적으로 밀도가 낮았으며, 밴드의 두께로 볼 때 전체 혈구에서 무과립혈구가 차지하는 비율이 높음을 확인할 수 있었다.
한편, 탈피혈구는 거미의 탈피를 전후한 시기에만 특징적으로 출현하는 대형의 구형 혈구로서 핵은 다른 혈구와 비슷한 크기 (5μm)이지만, 세포의 직경은 15~18μm에 달하는 대형의 세포임이 확인되었다(Fig. 4A,B). 광학현미경하에서 세포질은 투명하게 관찰되었는데, 전자현미경을 이용한 미세구조 관찰에서핵막과 원형질막 주위에 분포된 일부의 미토콘드리아만이 관찰될 뿐, 다른 세포소기관의 발달은 미약하였다 (Fig.
핵은 세포의 중앙부에 위치하였다. 핵이 전체 세포의 대부분을 차지할 정도로 세포질에 대한 핵의 비율이 높은 특징을 지니고 있었고, 세포질에는 특이 소견의 과립성분이 함유되어 있지 않아서 광학현미경하에서 세포질이 투명하게 관찰되었다. 전자현미경을 이용한 미세구조의 관찰에서 세포질 전역에 걸쳐 조면 소포체와 유리 리보솜이 산재되어 있음이 확인되었고 세포의 가장자리를 따라 동심원상으로 배열된 미세소관(marginal microtubules)도 관찰되었다 (Fig.
혈구의 유형을 파악하기 위해 항응고 처리된 혈림프를 미리 제조된 60% percoll gradient를 통해 원심분리한 결과, 밀도구배에 의해서 모두 3개의 밴드가관찰되었다 (Fig. 1A). 분리된 혈구밴드로부터 percoll의 성분을 제거하고 혈구들만을 추출하여 WrightGiemsa 염색으로 관찰한 결과, 상층은 혈장 성분과 항응고제의 황색 침전물로 어떤 종류의 혈구도 관찰되지 않았다.
후속연구
Fahrenbach (1970)는 절지동물인 투구게 종류에서 푸른색을 띠는 혈색소 단백질을 함유한 혈구를 보고하였는데, 곤충의 편도혈구에 함유된 물질과 유사한 헤모시아닌 결정체인것으로 밝혀졌다(Paul, 1992). 거미의 혈색소혈구는 결정체가 과립의 형태로 세포질 속에 함유되어 있다는 특성으로 미루어 과립혈구의한 종류로 구분되었으나, Gupta(1979)는 곤충의 혈색소혈구를 편도혈구의 발달된 형태로 추정한 바 있기 때문에 편도혈구와 혈색소혈구의 유연관계에 대한 해석은 좀 더 면밀한 검토가 필요할 것으로 생각된다.
본 연구에서도 역시 탈피시기중의염기호성 과립혈구의 수가 증가함이 관찰되었는데, 염기호성 과립혈구는 세포질에 이차 라이소좀과 식포가 다수 형성되어 식세포 능력을 가진 면역혈구의한 종류임 이 확인되 었다 (Anggraeni & Ratcliffe, 1991; Lowenberger, 2001; Lavine & Strand, 2002). 또한, 탈피시기동안 과립의 전자밀도가 낮아지는 점으로 미루어탈피시 새로운 큐티클의 생성과정에도 관여할 것으로사료된다.
이 종류의 혈구들은 식균작용을 하지 않으며, 가장 큰 유형의 혈구이지만,in vitro 상에서 쉽게 용해되기 때문에 관찰하기 힘들다고 보고되었다(Gupta, 1979). 산왕거미에서 관찰된 편도혈구의 수는 비탈피시기의 순환혈구에서 곤충과 유사하게 전체 약 1% 미만을 차지하고 있었지만, 심장의 내강에 분포된 근육층을 따라밀집되어 있다는 최근의 보고(Choi & Moon, 2003)로 미루어 또 다른 기능이 있을 것으로 추정되며, 이에대한 보다 정밀한 분석이 필요할 것으로 사료된다.
특히 거미류는 곤충류 다음으로 많은 종을 보유하고 있고, 농작물의 주된 해충인 곤충류에 대한 강한 천적으로서 그 활용가치가 매우 높기 때문에 (Foelix, 1996) 이들의 생리특성에 관한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
참고문헌 (33)
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