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문제 정의
- 본 연구에서는 담수사육 감성돔을 대상으로 수온을 상승시켰을 때, 스트레스 반응의 세포적 수준을 파악하기 위해 HSP90, HSP70의 mRNA 발현을 조직별로 조사하였으며, 또한 혈중 cortisol 및 glucose 수준 등을 파악함으로써, 이들 스트레스 단백질과 cortisol의 관계를 고찰하고자 한다.
- , 1994). 본 연구에서는 수온상승에 따른 스트레스 반응으로 신경내분비적 및 세포적 반응을 조사하였으며, 그상호 작용을 고찰하였다.
제안 방법
- 스트레스 단백질은 스트레스로 인한 2차적 충격으로부터 세포를 보호하는데, 만약 이런 생리적 작용이 일어나지 않으면 스트레스를 받은 개체는 치사에 이르게 된다(Ciavarra and Simeone, 1990; Hightower, 1991). 본 연구에서는 수온을 20℃에서 30。(2로 상승시켰을 때, 열 충격 관련 스트레스 단백질인 HSPs mRNA의 발현 정도를 RT-PCR-g- 통해 조직 (뇌, 간, 생식소, 신장 및 장)별로 조사하였다. 감성돔의 적정사육 수온이 20-25 ℃(Min et al.
- -80 ℃에서 보관중인 뇌, 간, 신장, 생식소 및 장으로부터 Total RNA Extraction kit (Promega, US A)를 사용하여 total RNA를 추출하였다. PCR을 수행하기 위한 prime의 설계는 이미 알고 있는 타 종의 HSP90 및 HSP70 유전자의 염기서열을 참고로하여, 종내 .
- )로 측정하였다. Glucose는 Biochemistry Autoanalyzer (Hitach 7180, Hitach Co., Japan)로 분석하였다.
- HSP90 및 HSP70 mRNA의 조직내 특이적인 발현을 조사하기 위하여, RT-PCR을 실시하였다. Total RNA는 뇌, 간, 신장, 생식소 및 장으로부터 추출하였으며 , RT-PCR을 수행하기 위한 감성돔 HSP90 및 HSP70 primer는 Table 1에 나타내었다.
- PCR에 의하여 증폭된 HSP90 cDNA 단편(891 bp)의 아미노산 배열을 이용하여, 타 어종과의 상동성을 비교, 분석하였다. 감성돔의 HSP90은 참돔(Rjgrzw major, AY 190704) HSP90과 99%, 무지개송^(AB]96458) HSP90과 95%, 대서양 연어(Sa/mo salar, AF135117) HSP90과 94%, zebrafish (BC065359) HSP90과 94%로 높은 상동성을 나타내었다(Fig.
- PCR을 수행하기 위한 prime의 설계는 이미 알고 있는 타 종의 HSP90 및 HSP70 유전자의 염기서열을 참고로하여, 종내 .종간을 통해서 잘 보존되어져 있는 영역에서 primer 를 설계하였다(Table 1).
- Total RNA 1 昭을 사용한 RT-PCRe SuperScript™ reverse trasncrptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, US A)를 사용하여 42 ℃ 에서 50분간 역전사 반응 후, 열변성을 94℃에서 2분간, 94 T에서 1분간, 54 ℃ (HSP90) 및 60 ℃ (HSP70)에서 45초간, 72 ℃ 에서 45초간 총 35회 실시하고, 최종 신장 반응을 72P에서 5분간 실시하였다. 이후 증폭된 PCR 산물은 1.
- 6 g의 감성돔 40마리를 사용하였다. 감성돔의 담수순화를 위하여, 사육수조 내에 담수를 첨가하여 10%o 해수에서 3일간 유지시킨 후에 완전한 담수 사육수조로 이동시켜 35 일간 사육하였다. 실험 전 수온은 20±1。(:로, 광주기는 12L:12D 로 유지하였으며 , 상업용 사료를 매일 2회 공급하였다.
- 정제된 plasmid DNA의 염기배열은 ABI DNA sequencer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 결정하였다. 결정된 염기배열은 BLAST의 GenBank를 이용하여 , 본 cDNA와의 상동성을 검색하였다.
- 담수 순화된 감성돔을 자동 수온조절 시스템 (JS-MBP-170RP,Johnsam Co., Korea)이 부착된 40 L 순환여과 사각수조 2개에 각각 20마리씩 수용한 후 24시간 안정시켰다. 이후 사육수온을 20P에서 30。(2까지 매일 1℃ 씩 상승시켰으며, 수온상승 기간동안 사료는 공급하지 않았다.
- 본 연구에서는 담수사육 감성돔을 대상으로 수온을 상승시켰을 때, 세포적 스트레스 측면에서 HSP90 및 HSP70 mRNA 의 발현 정도를, 신경-내분비적 스트레스 측면에서 혈장 cortisol 및 glucose 농도를 조사하였다. RT-PCR법을 이용하여 생식소로부터 HSP90 (891 bp) 및 HSP70 (465 bp) cDNA 단편을 클로닝 하여, 타 종과 그 상동성을 비교해 본 결과, 감성돔 HSP90 은 참돔 HSP90과 99%, 무지개송어 HSP90과 95%, 대서양 연어 HSP90과 94%, zebrafish HSP90과 94%로 나타났으며, 감성돔 HSP70은 무지개송어 HSP70과 96%, silver seabream HSP70 과 95%, zebrafish HSP70과 95%의 상동성을 나타내었다.
- 실시하였다. 이후 증폭된 PCR 산물은 1.0% agarose gel로 전기영동한 다음, HSP90 및 HSP70 mRNA의 발현량은 Gelpro 3.1(KBT, Korea) 컴퓨터 프로그램을 사용하여 내부표준 유전자인 B-actin의 발현량에 대한 비율로 환산하여 정량하였다.
- 0% agarose gel로 전기영동한 후, 정제한 다음, pGEM-T Easy Vector (Promega, USA)에 삽입하여 이를 대장균 DH 5a에 형질전환하여 plasmid purification kit (NucleoGen, Seoul, Korea)에 의하여 plasmid DNA를 정제하였다. 정제된 plasmid DNA의 염기배열은 ABI DNA sequencer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 결정하였다. 결정된 염기배열은 BLAST의 GenBank를 이용하여 , 본 cDNA와의 상동성을 검색하였다.
- 1). 증폭된 PCR 산물은 1.0% agarose gel로 전기영동한 후, 정제한 다음, pGEM-T Easy Vector (Promega, USA)에 삽입하여 이를 대장균 DH 5a에 형질전환하여 plasmid purification kit (NucleoGen, Seoul, Korea)에 의하여 plasmid DNA를 정제하였다. 정제된 plasmid DNA의 염기배열은 ABI DNA sequencer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 결정하였다.
- 혈장 cortisol 농도는 cortisol RIA kit (DPC, Los Angeles, U.S.A.)로 항원과 표지항원이 항체에 경쟁적으로 반응하도록 유도한 다음, Hewlett Packard Gamma Counter (Cobra 5010,Packard Co., U.S.A.)로 측정하였다. Glucose는 Biochemistry Autoanalyzer (Hitach 7180, Hitach Co.
대상 데이터
- 수온이 20, 25 및 30。(2에 이르렀을 때 각각 2개의 수조에서 3마리씩(총 6마리)으로부터 혈액 및 조직을 채취 하였다. 채혈직전 실험어를 MS-222 (200 ppm)로 마취한 후, heparin sodium 처리 주사기(3 ml)를 사용하여 미부혈관으로부터 채취한 다음, 원심분리(4 ℃, 10000 rpm, 5분)하여 얻은 혈장은 호르몬 분석전까彳 -80。(2의 초저온 냉동고에 보관하였다.
- Multiple alignment of black porgy (Acanthopgrus schlegeli) HSP70 with several teleost. The HSP70 sequences used for alignment were black potgy HSP70 (bpHSP70, AY929160), rainbow trout HSP70 (rtHSP70, AB196461) silver seabream HSP70 (ssHSP70, AY436786) and zebrafish HSP70 (zfHSP70, BC045841). Identical amino acids are indicated by shaded box.
- Multiple alignment of black porgy (Acanthopgrus schlegeli) HSP90 with several teleost. The HSP90 sequences used for alignment were black porgy HSP90 (bpHSP90, AY929159), red seabream HSP90 (rsHSP90, AY190704), rainbow trout HSP90 (rtHSP90, AB196458) Atlantic salmon HSP90 (asHSP90, AF135117) and zebrafish HSP90 (zfHSP90, BC065359). Identical amino acids are indicated by shaded box.
- 해수 순환여과 시스템에서 사육중인 평균전장 14.4±0.2 cm, 체중 48.6±0.6 g의 감성돔 40마리를 사용하였다. 감성돔의 담수순화를 위하여, 사육수조 내에 담수를 첨가하여 10%o 해수에서 3일간 유지시킨 후에 완전한 담수 사육수조로 이동시켜 35 일간 사육하였다.
데이터처리
- 각 실험결과로부터 얻어진 자료 값 사이의 유의차 유무는 SPSS-통계패키지 (version 10.0)에 의한 t-test와 one way ANOVA 및 Tukey's multiple range test로 평균간의 유의성을 검정하였다 (P=0.05).
성능/효과
- HSP70 cDNA 단편(465 bp)의 아미노산 배열을 이용하여, 상동성을 비교한 결과, 무지개송어(AB 196461) HSP70과 96%, silver seabream (Spans sarba, AY436786) HSP70과 95%, zebrafish (BC045841) HSP70과 95%로 HSP90과 마찬가지로 높은 상동성을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- glucose 농도를 조사하였다. RT-PCR법을 이용하여 생식소로부터 HSP90 (891 bp) 및 HSP70 (465 bp) cDNA 단편을 클로닝 하여, 타 종과 그 상동성을 비교해 본 결과, 감성돔 HSP90 은 참돔 HSP90과 99%, 무지개송어 HSP90과 95%, 대서양 연어 HSP90과 94%, zebrafish HSP90과 94%로 나타났으며, 감성돔 HSP70은 무지개송어 HSP70과 96%, silver seabream HSP70 과 95%, zebrafish HSP70과 95%의 상동성을 나타내었다. 감성돔의 사육수온을 30 ℃S 상승시 켰을 때 , HSP90 mRNA는 모든 조직에서 그 발현 정도가 20℃ 실험구에 비하여 7~9배정도 높았으나, HSP70 mRNA는 생식소에서만 발현하는 것으로 나타났다.
- 분석하였다. 감성돔의 HSP90은 참돔(Rjgrzw major, AY 190704) HSP90과 99%, 무지개송^(AB]96458) HSP90과 95%, 대서양 연어(Sa/mo salar, AF135117) HSP90과 94%, zebrafish (BC065359) HSP90과 94%로 높은 상동성을 나타내었다(Fig. 1).
- RT-PCR법을 이용하여 생식소로부터 HSP90 (891 bp) 및 HSP70 (465 bp) cDNA 단편을 클로닝 하여, 타 종과 그 상동성을 비교해 본 결과, 감성돔 HSP90 은 참돔 HSP90과 99%, 무지개송어 HSP90과 95%, 대서양 연어 HSP90과 94%, zebrafish HSP90과 94%로 나타났으며, 감성돔 HSP70은 무지개송어 HSP70과 96%, silver seabream HSP70 과 95%, zebrafish HSP70과 95%의 상동성을 나타내었다. 감성돔의 사육수온을 30 ℃S 상승시 켰을 때 , HSP90 mRNA는 모든 조직에서 그 발현 정도가 20℃ 실험구에 비하여 7~9배정도 높았으나, HSP70 mRNA는 생식소에서만 발현하는 것으로 나타났다. 혈장 cortisol 및 glucose 농도는 20 ℃ 실험구에 비하여 30 ℃ 실험구에서 유의하게 증가한 것으로 나타났다.
- , 2003)인 점과 본 연구의 실험개시 수온인 20 ℃ 실험구에서 사육된 감성돔의 혈장 cortisol 농도가 평균 9 ng/ml 이라左 점으로 볼 때, 20。。실험구에서 사육된 감성돔은 스트레스를 받고 있지 않은 상태였음을 알 수 있다. 따라서 20 ℃ 실험구에서 사육된 감성돔의 모든 조직에서 HSP90 mRNA가 약하게 발현하였다는 사실로 볼 때, HSP90 mRNA는 스트레스와 관련 없는 다른 생리적 역할도 가지고 있는 것으로 해석된다. 또한, HSP90은 스트레스를 받지 않은 상태에서도 대부분의 조직 내의 세포 단백질 중의 1~2%를 차지하고 있다는 연구 보고(Lai et al.
- 이때 간에서 cortisol 수용체의 합성을 위해 HSP70 mRNA가 관여하게 된다. 따라서 본 연구에서는 30 K 실험구의 감성돔 간 조직에서 HSP70 mRNA가 발현될 것을 기대해 보았으나, 발현을 확인할 수 없었다. 그러나 Wegele et al.
- 즉, HSP90 mRNA는 cortisol 수용체의 활성과 친화력을 높여 cortisol의 세포학적 작용을 촉진하는 것으로 추측해볼 수 있다. 본 연구에서 수온 상승에 따른 HSP90 mRNA의 조직별 발현을 조사한 결과, 생식소, 간, 뇌에서 매우 높게 나타났다. 또한 돼지에 열 충격 (43 ℃, 30분) 을 주었을 때, HSP90이 뇌, 신장, 뇌하수체, 정소 및 간에서 높게 발현되었는데(Huang al, 1999), 이러한 결과들은 척추동물에서 스트레스 단백질이 스테로이드 호르몬에 민감한 조직에서 잘 발현된다는 Vamvakopoulos (1993)의 견해를 뒷받침해 주고 있다.
- , 1997, 2001). 본 연구에서도 수온 상승 스트레스와 관련하여 HSP70 mRNA는 생식소에서만 발현되었는데, 이것은 수온 스트레스로 인해 감성돔의 정소 내 생식세포에서 apoptosis가 발생 혹은 증가되었을 가능성을 주즉해 볼 수 있으며, 이와 같은 현상이 일어나는 것을 방지하기 위해 HSP70이 발현한 것으로 보여진다. HSP70은 생물체가 스트레스를 받았을 경우, glucocorticoid 수용체의 합성을 위해 HSP90 과 더불어 가장 잘 발현되는 스트레스 단백질로 알려져 있으며 (Hutchison et al, 1994), 앞서 기술한대로 스트레스를 받게 되면 생물체는 이를 극복하기 위해 당신생합성이 필요하게 되며, 이를 위해 cortis이의 상승이 나타나게 된다.
- 수온상승에 따른 HSP90 및 HSP70 mRNA의 조직별 발현정도를 조사한 결과, HSP90 mRNA는 수온 상승과 상관없이모든 조직에서 발현하는 것으로 나타났다. 그러나 수온을 30 ℃로 상승시켰을 때의 HSP90 mRNA의 발현 정도는 20℃ 실험구에 비하여 7~9배 정도 높게 나타났다(P<0.
- 역전사 반응을 포함한 RT-PCR을 AccuPower RT/PCR PreMix (Bioneer, Seoul, Korea)를 이용하여 실시한 결과, HSP90과 HSP70에서 각각 891 bp와 465 bp의 PCR 산물을 얻었다(Table 1). 증폭된 PCR 산물은 1.
후속연구
- 따라서 앞으로는 스트레스에 관련하여 cortisol-cortisol 수용체-HSP70의 관계뿐만 아니라 HSP90-HSP70과의 상호작용에관한 더 많은 연구가 필요한 것으로 사료된다.
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