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문제 정의
- , 2002) 동일종간 웅성발생성 처녀 생식 조건(intraspecies androgenesis) 을 확립하고자 하였다. 그 첫번째 단계로서 미꾸라지 난의 유 전물질을 효과적으로 제거할 수 있는 최적의 불활성화 조건을 확립하고자 하였으며 또한 동일 종내 인공처녀생식의 분자유전 학적 표지로서 서로 다른 형질전환 유전자를 포함하는 배우자 (gamete)들을 이용하여 효과적인 웅성발생성 생식의 검증 효과 를 평가하고자 하였다.
- 동일 종내 미꾸라지 mizolepis) 웅성발생성 인공 처녀생식(intraspecific androgenesis) 기술을 개발하기 위해 미 꾸라지 난 유전물질의 불활성화와 이에 따른 웅성발생성 반수 체 유도 조건을 최적화하였다. 다양한 자외선(UV) 농도(0〜25, 650 ergs/mn?)를 이용하여 미꾸라지 난의 유전학적 불활성화를 시 도하였으며 수정률, 부화율 및 반수체 출현율을 평가한 결과 10, 800 ergs의 농도에서 가장 우수한 반수체 유도 효율을 보였 으며 최초 처리 난 중 50% 이상의 웅성발생성 반수체 수율을 확보할 수 있었다.
- 이에 본 연구에서는 우리나라 주요 담수 어종인 미꾸라지 (Misgurnus mizolepis、)를 어류 염색체 조작 모델로 개발하기 위 한 연구의 일환으로 그간 다른 종(잉 어, Cyprinus carpio)의 난 자를 이용한 미꾸라지 웅성발생성 유도에서 관찰된 낮은 배 발 생율과 수율(total output)을 극복하기 위해 (see Nam et al., 2002) 동일종간 웅성발생성 처녀 생식 조건(intraspecies androgenesis) 을 확립하고자 하였다. 그 첫번째 단계로서 미꾸라지 난의 유 전물질을 효과적으로 제거할 수 있는 최적의 불활성화 조건을 확립하고자 하였으며 또한 동일 종내 인공처녀생식의 분자유전 학적 표지로서 서로 다른 형질전환 유전자를 포함하는 배우자 (gamete)들을 이용하여 효과적인 웅성발생성 생식의 검증 효과 를 평가하고자 하였다.
제안 방법
- Proteinase K를 불활성화하기 위 해 95<, C에서 10분간 반응시켰으려 반응이 완료되면 원심분리 (14, 000 rpm; 3 min)후 상등액 2 卩1를 PCR template로 이용하 였다. CAT specific 유전자 증폭을 위해서 562 bp의 CAT transgene 단 편을 증폭할 수 있는 2 종의 primers (FVC-1: 5, -CTATAACCAG- ACCGITCAGC-3, 및 FVC-2: S'-CGCCCCGCCCTGCCACTCATCGC AG-3')를 이용하였고, GH-transgene (822 bp)의 증폭을 위해서 는 mipGH 2F 55-CCACGCGCTGAATCGGCGGC-3' (specific for beta-actin promoter) 및 mipGH 4R 5'-CTGAGGTAACA- GGCTGTCCTC-3' (specific for GH gene)을 이용하였다. Internal control 유전자인 미꾸라지 metallothionein (MT) gene (305 bp)의 증폭을 위해서는 mlMT-lF 5'-ATGGATCCTTGTGATTGCTC- 3, 및 mlMT-lR S-TGGGCAGCAAGAACAGCAAC-3, 을 이 용하였다.
- PCR 반응은 50 卩1로 수행하였다. Multiplex PCR을 수행하기 위해서 (CAT transgene/MT gene 또 는 CAT transgene/GH transgene) 각 forward 및 reverse primer 별로 각 2 pM의 농도로 PCR 반응에 첨가하였고 PCR 반응은 94°C 2분간 최초 변성 후 94°C 45초, 58°C 45초 및 72°C 1분 을 30회 순환 반응하였다. Automatic thermal cycler는 BioRad 사의 iCycler'w를 이용하였다.
- PCR 반응은 Takara ExTaq (Takara, Japan)를 이용하 였고 제조사의 10X buffer 및 dNTP mix를 이용하여 manual대 로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 50 卩1로 수행하였다. Multiplex PCR을 수행하기 위해서 (CAT transgene/MT gene 또 는 CAT transgene/GH transgene) 각 forward 및 reverse primer 별로 각 2 pM의 농도로 PCR 반응에 첨가하였고 PCR 반응은 94°C 2분간 최초 변성 후 94°C 45초, 58°C 45초 및 72°C 1분 을 30회 순환 반응하였다.
- Internal control 유전자인 미꾸라지 metallothionein (MT) gene (305 bp)의 증폭을 위해서는 mlMT-lF 5'-ATGGATCCTTGTGATTGCTC- 3, 및 mlMT-lR S-TGGGCAGCAAGAACAGCAAC-3, 을 이 용하였다. PCR 반응은 Takara ExTaq (Takara, Japan)를 이용하 였고 제조사의 10X buffer 및 dNTP mix를 이용하여 manual대 로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 50 卩1로 수행하였다.
- Automatic thermal cycler는 BioRad 사의 iCycler'w를 이용하였다. PCR 반응이 완료되면 PCR 산 물 6 卩 1를 1% agarose gel에 전기영동 후 ethidium bromide (Et- Br) staining을 통해 증폭 여부를 확인하였다.
- 웅성발생성 개체들의 반수체 DNA content를 확인하기 위해 서 전형적인 haploid syndrome을 보이는 개체들을 대상으로 20 마리씩 pooling하여 flow cytometry를 수행하였다. Pooling된 20마리 자어를 homogenization한 후 20 gm mesh로 단일 세포 들을 회수하였고 50 卩g/ml의 propidium iodide를 포함하는 염 색용액 (10 mM Tris-Cl, ImM EDTA, 50 mM NaCl, 0.01% NP-40) 에서 30분간 염색한 후 WinBryte HS flow cytometer (BioRad) 를 이용하여 분석하였다. 이때 대조군으로서 미꾸라지 2배체 혈 구 세포(2.
- 웅성 발생성 처녀생식 발생을 검증하기 위해서 UV 를 조사하지 않는 난과의 수정을 통해 대조군(2N)을 설정하였 다. Transgene-specific PCR을 이용하여 웅성발생성 반수체군 과 2배체 대조군(biparental)을 분석하였다. 각 반수체 자어로부 터 분리한 핵산 시료가 PCR 반응에 적합한지를 확인하기 위해 서 (fklse negative 효과를 방지하기 위해) 미꾸라지 metallothionein (MT) 유전자 일부를 증폭할 수 있는 internal control PCR을 함 께 수행하였다.
- Transgene-specific PCR을 이용하여 웅성발생성 반수체군 과 2배체 대조군(biparental)을 분석하였다. 각 반수체 자어로부 터 분리한 핵산 시료가 PCR 반응에 적합한지를 확인하기 위해 서 (fklse negative 효과를 방지하기 위해) 미꾸라지 metallothionein (MT) 유전자 일부를 증폭할 수 있는 internal control PCR을 함 께 수행하였다. 둘째, GH-transgene과 CAT-transgene을 중복 이 용하여 웅성발생성 발생을 검증하였다.
- 둘째, 상기 1차 실험에서 얻어진 결과를 바탕으로 상대적으 로 우수한 생존율과 반수체 유도율을 보이는 구간을 다시 선발 하여 10초 간격으로 구분 지어 상기와 동일하게 자외선 처리를 수행하고 부화율과 반수체 유도율을 재조사하였다. 각 처리구 당 3반복 실험을 수행하였다. 실험 결과를 바탕으로 각 처리구 별 웅성발생성 이배체 유도 수율(yield)을 처리된 전체 난의 수 에 대한 백분율로 환산하였으며 이때 각 처리군 평균간의 유의 차를 검정하기 위해 분산분석 (ANOVA)을 통해 P<0.
- 각각의 반수체 자어로부터 PCR 분석용 DNA를 확보하기 위 해서 다음의 방법을 이용하여 DNA 추출을 수행하였다. 반수 체 자어를 분해 용액(20 mM Tris-Cl, pH 8.
- 5。(2로 유지하였다. 동일한 실 험을 서로 다른 친어군의 알과 정자를 이용하여 4회 반복 조사 하였으며 각 실험구당 수정률(수정 후 1시간) 및 부화율(대조군 의 tail beating 시기; 수정 후 24시간)을 백분율로 조사하였으 며 부화된 자어들을 대상으로 종래 알려진 haploid syndrome을 기준으로 반수체 유도율을 구하였다. 수정률 및 부화율은 반복 구당 110개의 난을 대상으로 조사하였고 반수체율은 부화 자어 120마리를 대상으로 평가하였다.
- 둘째, GH-transgene과 CAT-transgene을 중복 이 용하여 웅성발생성 발생을 검증하였다. 동형접합성 CAT-transgenic 암컷으로부터 얻은 난을 대상으로 상기와 동일하게 UV 처리를 수행한 후 GH-transgene을 포함하는 정자와의 인공수정을 실 시하였다. 웅성발생성 발생을 검증하기 위해서 두 형질전환 유 전자에 각각 특이적인 PCR 반응을 통해 암컷 기원 형질전환 유전자의 미증폭과 수컷 기원 형질전환 유전자의 증폭을 확인 하였다.
- 각 반수체 자어로부 터 분리한 핵산 시료가 PCR 반응에 적합한지를 확인하기 위해 서 (fklse negative 효과를 방지하기 위해) 미꾸라지 metallothionein (MT) 유전자 일부를 증폭할 수 있는 internal control PCR을 함 께 수행하였다. 둘째, GH-transgene과 CAT-transgene을 중복 이 용하여 웅성발생성 발생을 검증하였다. 동형접합성 CAT-transgenic 암컷으로부터 얻은 난을 대상으로 상기와 동일하게 UV 처리를 수행한 후 GH-transgene을 포함하는 정자와의 인공수정을 실 시하였다.
- 둘째, 상기 1차 실험에서 얻어진 결과를 바탕으로 상대적으 로 우수한 생존율과 반수체 유도율을 보이는 구간을 다시 선발 하여 10초 간격으로 구분 지어 상기와 동일하게 자외선 처리를 수행하고 부화율과 반수체 유도율을 재조사하였다. 각 처리구 당 3반복 실험을 수행하였다.
- 수정률/부화율 및 반수체 출현률을 고려할 경우 상대적으로 우수한 유도 효율을 보이는 구간은 8, 000-14, 000 ergs 범위에 해당하는 UV 처리 구간으로 나타났다. 본 구간에 해당되는 처 리 시간 조건인 90초〜160초 처리 조건을 대상으로 다시 10초 간격으로 세분화하여 웅성발생성 반수체 유도를 위한 최적 구 간을 조사하였으며 3반복 실험에 의해 얻어진 평균 수율(yield) 을 Fig. 3에 나타내었다. Fig.
- 상기 실험 결과들을 바탕으로 가장 우수한 반수체 유도율을 보이는 처리 구간을 대상으로 형질전환 개체들을 이용하여 웅 성발생성 반수체 유도를 수행하였다. 실험에 사용한 형질전환 어류들은 chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter construct 들이 이식되어 있는 동형접합성(homozygous) 형질전환체로서 1~10 copies의 형질전환 유전자가 tandem concatemer 형태로 삽입되어 있는 계통들에서 선발된 개체들이었다.
- 수컷은 일반 미꾸라지 친어로부터 얻은 정자를 이용하였다. 웅성 발생성 처녀생식 발생을 검증하기 위해서 UV 를 조사하지 않는 난과의 수정을 통해 대조군(2N)을 설정하였 다. Transgene-specific PCR을 이용하여 웅성발생성 반수체군 과 2배체 대조군(biparental)을 분석하였다.
- 웅성발생성 개체들의 반수체 DNA content를 확인하기 위해 서 전형적인 haploid syndrome을 보이는 개체들을 대상으로 20 마리씩 pooling하여 flow cytometry를 수행하였다. Pooling된 20마리 자어를 homogenization한 후 20 gm mesh로 단일 세포 들을 회수하였고 50 卩g/ml의 propidium iodide를 포함하는 염 색용액 (10 mM Tris-Cl, ImM EDTA, 50 mM NaCl, 0.
- 동형접합성 CAT-transgenic 암컷으로부터 얻은 난을 대상으로 상기와 동일하게 UV 처리를 수행한 후 GH-transgene을 포함하는 정자와의 인공수정을 실 시하였다. 웅성발생성 발생을 검증하기 위해서 두 형질전환 유 전자에 각각 특이적인 PCR 반응을 통해 암컷 기원 형질전환 유전자의 미증폭과 수컷 기원 형질전환 유전자의 증폭을 확인 하였다.
- 채란된 난 1 ml (=1, 000 eggs) 당 0.5 ml 의 4°C 생리식염수를 첨가하여 잘 섞어 준 후 난을 한 층으로 잘 펼치고 회전판이 장착된 자외선 조사 장치를 이용하여 초당 90 ergs/mn?의 농도로 0에서 285초까지 15초 간격으로 자외선 (ultraviolet ray; UV) 조사를 수행하였다. 결과적으로 0에서 25, 650 ergs/mn?까지의 총 자외선 양이 처리되도록 하였다.
- 01% NP-40) 에서 30분간 염색한 후 WinBryte HS flow cytometer (BioRad) 를 이용하여 분석하였다. 이때 대조군으로서 미꾸라지 2배체 혈 구 세포(2.8 pg/cell>와 정세포(1.4 pg/cell)를 이용하였다.
- 첫째, 복부압박법으로 채정한 정자는 예비 실험 결과를 바탕 으로 생리식염수(0.85% NaCl)를 이용하여 1:30 비율로 희석한 후 실험에 사용하였다. 채란된 난 1 ml (=1, 000 eggs) 당 0.
- 최적화된 상기 조건을 대상으로 형질전환 표지를 이용한 웅 성발생성 반수체를 검증하였다. CAT-transgene을 포함한 난을 이용할 경우 대조군(2N)에서는 internal control로 이용한 MT 유전자 및 CAT-transgene 모두 multiplex PCR 증폭이 일어났 으나 반면 UV 처리된 웅성발생성 반수체 군의 경우 대부분 internal control 유전자의 증폭만 일어났을 뿐 모계 기원의 CAT transgene은 증폭되지 않음으로써 부계 특이적인(paternal exclusive) 처녀생식을 잘 입증하고 있다.
- 형질전환 표지를 이용한 웅성발생성 반수체 유도를 위해서 첫째, CAT-transgene을 갖는 동형접합성 암컷의 난을 이용하여 앞서 조사된 최적 구간들을 대상으로 웅성발생성 반수체 유도 를 시도하였다. 수컷은 일반 미꾸라지 친어로부터 얻은 정자를 이용하였다.
대상 데이터
- Multiplex PCR을 수행하기 위해서 (CAT transgene/MT gene 또 는 CAT transgene/GH transgene) 각 forward 및 reverse primer 별로 각 2 pM의 농도로 PCR 반응에 첨가하였고 PCR 반응은 94°C 2분간 최초 변성 후 94°C 45초, 58°C 45초 및 72°C 1분 을 30회 순환 반응하였다. Automatic thermal cycler는 BioRad 사의 iCycler'w를 이용하였다. PCR 반응이 완료되면 PCR 산 물 6 卩 1를 1% agarose gel에 전기영동 후 ethidium bromide (Et- Br) staining을 통해 증폭 여부를 확인하였다.
- 동일한 실 험을 서로 다른 친어군의 알과 정자를 이용하여 4회 반복 조사 하였으며 각 실험구당 수정률(수정 후 1시간) 및 부화율(대조군 의 tail beating 시기; 수정 후 24시간)을 백분율로 조사하였으 며 부화된 자어들을 대상으로 종래 알려진 haploid syndrome을 기준으로 반수체 유도율을 구하였다. 수정률 및 부화율은 반복 구당 110개의 난을 대상으로 조사하였고 반수체율은 부화 자어 120마리를 대상으로 평가하였다.
- 형질전환 표지를 이용한 웅성발생성 반수체 유도를 위해서 첫째, CAT-transgene을 갖는 동형접합성 암컷의 난을 이용하여 앞서 조사된 최적 구간들을 대상으로 웅성발생성 반수체 유도 를 시도하였다. 수컷은 일반 미꾸라지 친어로부터 얻은 정자를 이용하였다. 웅성 발생성 처녀생식 발생을 검증하기 위해서 UV 를 조사하지 않는 난과의 수정을 통해 대조군(2N)을 설정하였 다.
- 실험에 사용된 미꾸라지는 부경대학교 양식학과에서 유지하 던 5년산 실험어로서 평균 어체중(BW) 41±5 g의 암컷들과 16±2 g의 수컷 친어들이었다. 성숙된 친어들로부터 Kim et al.
- 상기 실험 결과들을 바탕으로 가장 우수한 반수체 유도율을 보이는 처리 구간을 대상으로 형질전환 개체들을 이용하여 웅 성발생성 반수체 유도를 수행하였다. 실험에 사용한 형질전환 어류들은 chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter construct 들이 이식되어 있는 동형접합성(homozygous) 형질전환체로서 1~10 copies의 형질전환 유전자가 tandem concatemer 형태로 삽입되어 있는 계통들에서 선발된 개체들이었다. 본 계통의 자 세한 유전학적 특성은 Nam et al.
- 암컷은 개체의 성숙도에 따라 6~10 IU HCG/g body weight (BW)로 그리고 수컷은 2 IU HCG/g BW 의 농도로 1회 주사 하였으며, 25。(3에서 12~13시간 경과 후부 터 복부 압박법에 의해 난자와 정자를 얻었다. 암컷의 경우 산 란 유도 실험별로 6~8마리의 개체로부터 인공산란을 유도한 후 상위 난질을 보이는 3마리 암컷의 난을 이용하였다.
데이터처리
- 각 처리구 당 3반복 실험을 수행하였다. 실험 결과를 바탕으로 각 처리구 별 웅성발생성 이배체 유도 수율(yield)을 처리된 전체 난의 수 에 대한 백분율로 환산하였으며 이때 각 처리군 평균간의 유의 차를 검정하기 위해 분산분석 (ANOVA)을 통해 P<0.05 수준에 서 유의성을 분석하였다.
이론/모형
- 실험에 사용된 미꾸라지는 부경대학교 양식학과에서 유지하 던 5년산 실험어로서 평균 어체중(BW) 41±5 g의 암컷들과 16±2 g의 수컷 친어들이었다. 성숙된 친어들로부터 Kim et al. (1994)의 방법에 따라 태반성 성선자극 호르몬(HCG)를 이용하 여 산란유도를 수행하였다. 암컷은 개체의 성숙도에 따라 6~10 IU HCG/g body weight (BW)로 그리고 수컷은 2 IU HCG/g BW 의 농도로 1회 주사 하였으며, 25。(3에서 12~13시간 경과 후부 터 복부 압박법에 의해 난자와 정자를 얻었다.
성능/효과
- 최적화된 상기 조건을 대상으로 형질전환 표지를 이용한 웅 성발생성 반수체를 검증하였다. CAT-transgene을 포함한 난을 이용할 경우 대조군(2N)에서는 internal control로 이용한 MT 유전자 및 CAT-transgene 모두 multiplex PCR 증폭이 일어났 으나 반면 UV 처리된 웅성발생성 반수체 군의 경우 대부분 internal control 유전자의 증폭만 일어났을 뿐 모계 기원의 CAT transgene은 증폭되지 않음으로써 부계 특이적인(paternal exclusive) 처녀생식을 잘 입증하고 있다. 그러나 분석한 총 36 마리 중 4마리(11.
- 3에 나타내었다. Fig. 3에서 보듯이 각 구간별 부화율 및 반수체 유도율은 상기 실험과 유사한 경향을 보였으며 최초 처리된 난의 수를 기준으로 계산된 수율을 고려 시 미꾸라지 난 불활성화의 최적 UV 처리 구간은 120초(10, 800 ergs)로 나 타났고 통계적 유의차를 고려할 경우 100〜130초 (9, 000〜11, 700 ergs) 처리 구간 역시 우수한 성적을 나타내었다. 최적 조건에 서 얻어진 웅성발생성 반수체의 최대 수율은 50% 이상으로 관 찰되었다.
- , 2002). Flow cytoemetry를 이용하여 전형적인 haploid syndrome 형태의 개 체들을 분석한 결과 분석한 시료들의 95% 이상이 미꾸라지 정 세포의 DNA 함량(1.4 pg/cell)과 정확히 일치하는 haploid genome size를 나타냄으로써 이전의 미꾸라지 처녀 생식 결과 와도 잘 일치하였다(Nam et al, 2001b) (Fig. 4).
- UV 처리 농도가 증가할수록 수정률의 감소가 비 례적으로 관 찰되었다. UV 조사(irradiation)를 받지 않은 난을 이용해 만들 어진 대조군의 수정률은 평균 98% 이상으로 나타나 실험에 사 용한 암, 수 양친 배우자(난자 및 정자) 모두 우수한 양질의 상 태를 나타내었다. 반면 UV 처리군의 경우 자외선 조사가 1, 350 ergs/mrr?부터 25, 650 ergs/mnf까지 증가되면서 수정률의 급격 한 감소가 관찰되어 최소 농도의 UV가 조사된 군의 경우 91.
- UV 처리 농도가 증가할수록 수정률의 감소가 비 례적으로 관 찰되었다. UV 조사(irradiation)를 받지 않은 난을 이용해 만들 어진 대조군의 수정률은 평균 98% 이상으로 나타나 실험에 사 용한 암, 수 양친 배우자(난자 및 정자) 모두 우수한 양질의 상 태를 나타내었다.
- 5 ml 의 4°C 생리식염수를 첨가하여 잘 섞어 준 후 난을 한 층으로 잘 펼치고 회전판이 장착된 자외선 조사 장치를 이용하여 초당 90 ergs/mn?의 농도로 0에서 285초까지 15초 간격으로 자외선 (ultraviolet ray; UV) 조사를 수행하였다. 결과적으로 0에서 25, 650 ergs/mn?까지의 총 자외선 양이 처리되도록 하였다. 자외 선 처리가 끝나면 준비된 정자와의 인공 수정을 통해 발생을 유도하였으며 이때 온도는 25±0.
- 이 후 농도에서부터 지속적인 증가 양상을 보임으로써 10, 800 ergs 에서(120초 처리군) 최대치인 89%를 기록하였고 이러한 고 빈 도의 출현은 13, 500 ergs까지 지속되었다. 그러나 더 이상의 UV 농도에서는 점차 그 출현율이 감소하기 시작하였고 18, 900 ergs 보다 높은 UV 농도에서는 10% 내외의 빈도를, 그리고 23, 400 ergs 이상에서는 전형적인 haploid syndrome을 보이는 개체들 이 관찰되지 않았다. Group-Ill (underdeveloped cell mass)은 최소 농도에서는 관찰되지 않았으며 역시 UV 농도가 증가할수 록 증가되는 경향을 보였다.
- CAT-transgene을 포함한 난을 이용할 경우 대조군(2N)에서는 internal control로 이용한 MT 유전자 및 CAT-transgene 모두 multiplex PCR 증폭이 일어났 으나 반면 UV 처리된 웅성발생성 반수체 군의 경우 대부분 internal control 유전자의 증폭만 일어났을 뿐 모계 기원의 CAT transgene은 증폭되지 않음으로써 부계 특이적인(paternal exclusive) 처녀생식을 잘 입증하고 있다. 그러나 분석한 총 36 마리 중 4마리(11.1%)에서 haploid syndrome의 형질을 표현하 고 있음에도 불구하고 모계의 transgene이 PCR로 검출되어 예 상과 다른 결과가 관찰되었다(Fig. 5a). 두 번째 검증 실험에서 도 역시 대부분 모계 transgene인 CAT 유전자의 증폭 없이 부 계 transgene (GH-transgene) 만이 효과적으로 증폭되었으나 그 빈도가 100%를 충족시키지는 못하였고 분석한 36마리 중 3마 리(8.
- 동일 종내 미꾸라지 mizolepis) 웅성발생성 인공 처녀생식(intraspecific androgenesis) 기술을 개발하기 위해 미 꾸라지 난 유전물질의 불활성화와 이에 따른 웅성발생성 반수 체 유도 조건을 최적화하였다. 다양한 자외선(UV) 농도(0〜25, 650 ergs/mn?)를 이용하여 미꾸라지 난의 유전학적 불활성화를 시 도하였으며 수정률, 부화율 및 반수체 출현율을 평가한 결과 10, 800 ergs의 농도에서 가장 우수한 반수체 유도 효율을 보였 으며 최초 처리 난 중 50% 이상의 웅성발생성 반수체 수율을 확보할 수 있었다. 웅성발생성 개체는 전형적인 haploid syndrome 의 특징을 나타내었고 flow cytometry 분석 결과 정확히 미꾸 라지 반수체 (1.
- 5a). 두 번째 검증 실험에서 도 역시 대부분 모계 transgene인 CAT 유전자의 증폭 없이 부 계 transgene (GH-transgene) 만이 효과적으로 증폭되었으나 그 빈도가 100%를 충족시키지는 못하였고 분석한 36마리 중 3마 리(8.3%)의 개체에서 모계 형질전환 표지가 검출되었다(Fig. 5b). 이는 모계 genome내 tandem array로 존재하던 transgene unit 중 일부 소량의 transgene fragment가 UV 조사에 의해 완전히 inactivation되지 못하고 웅성발생성 반수체 genome에 잔류하였 을 가능성 또는 group-【V에 속한 개체를 잘못 선발하였을 가능 성 등이 추정된다.
- 부화율 역시 수정률과 유사한 경 향을 나타내었다. 무처리 대조군의 평균 부화율은 90% 이상을 나타내었으나 난에 처리된 자외선의 농도가 증가할수록 부화율 은 감소하여 1, 350 et^s/mm2 (15초 처리군)부터 10, 800 ergs/mm2 (120초 처리군)까지 90.5%에서 51.2% 범위로 감소하였다. 이 후 더 높은 UV 농도가 처리될 경우 지속적인 부화율의 감소가 관찰되었으며 특히 18, 900 ergs/mm2(210초) 이후에는 부화개 체의 빈도가 극히 낮아 졌고 24, 300 crgs/mn? 이후에서는 모든 반복군에서 부화 개체가 관찰되지 않았다(Fig.
- UV 조사(irradiation)를 받지 않은 난을 이용해 만들 어진 대조군의 수정률은 평균 98% 이상으로 나타나 실험에 사 용한 암, 수 양친 배우자(난자 및 정자) 모두 우수한 양질의 상 태를 나타내었다. 반면 UV 처리군의 경우 자외선 조사가 1, 350 ergs/mrr?부터 25, 650 ergs/mnf까지 증가되면서 수정률의 급격 한 감소가 관찰되어 최소 농도의 UV가 조사된 군의 경우 91.5% 의 수정률을 보였으나 UV 농도가 증가될수록 2, 700 ei^s (30초 처 리)에서는 82%를, 8, 100 ergs (90초 처리)에서 69%, 13, 500 ergs (150초 처리)에서 62%, 그리고 18, 900 ergs (210초 처리) 에서는 35%를 나타내었으며 이후 최고 농도인 25, 650 ergs가 처리된 그룹의 경우에는 전체 처리된 1%의 수정란 만이 인공 수정 후 발생을 개시하였다. 부화율 역시 수정률과 유사한 경 향을 나타내었다.
- 수정률/부화율 및 반수체 출현률을 고려할 경우 상대적으로 우수한 유도 효율을 보이는 구간은 8, 000-14, 000 ergs 범위에 해당하는 UV 처리 구간으로 나타났다. 본 구간에 해당되는 처 리 시간 조건인 90초〜160초 처리 조건을 대상으로 다시 10초 간격으로 세분화하여 웅성발생성 반수체 유도를 위한 최적 구 간을 조사하였으며 3반복 실험에 의해 얻어진 평균 수율(yield) 을 Fig.
- 다양한 자외선(UV) 농도(0〜25, 650 ergs/mn?)를 이용하여 미꾸라지 난의 유전학적 불활성화를 시 도하였으며 수정률, 부화율 및 반수체 출현율을 평가한 결과 10, 800 ergs의 농도에서 가장 우수한 반수체 유도 효율을 보였 으며 최초 처리 난 중 50% 이상의 웅성발생성 반수체 수율을 확보할 수 있었다. 웅성발생성 개체는 전형적인 haploid syndrome 의 특징을 나타내었고 flow cytometry 분석 결과 정확히 미꾸 라지 반수체 (1.4 pg/cell)의 DNA 함량을 보유하는 것으로 나타 났다. 인위적으로 삽입된 형질전환 유전자 표지를 이용하여 부 계 특이적인 인공처녀생식 여부를 확인하였으나 일부 반수체 자어들에서(8〜11%)모계 유전물질의 잔류가 검출되었다.
- 2%를 보였으나 차상위 농도인 2, 700 ergs부터 (30초 처리군) 29%로 크게 증가하였다. 이 후 농도에서부터 지속적인 증가 양상을 보임으로써 10, 800 ergs 에서(120초 처리군) 최대치인 89%를 기록하였고 이러한 고 빈 도의 출현은 13, 500 ergs까지 지속되었다. 그러나 더 이상의 UV 농도에서는 점차 그 출현율이 감소하기 시작하였고 18, 900 ergs 보다 높은 UV 농도에서는 10% 내외의 빈도를, 그리고 23, 400 ergs 이상에서는 전형적인 haploid syndrome을 보이는 개체들 이 관찰되지 않았다.
- 이상의 UV 처리된 난 발생 특징을 분석한 결과 작은 크기의 난경과 투명한(transparent) 난을 갖는 미꾸라지의 경우 투과도 가 높지 않는 UV 만을 이용하여도 손쉽게 난 유전물질의 불활 성화(genetic inactivation)가 가능한 것으루 나타났다. Group-1 의 출현율에서 보듯이 비교적 저 농도의 UV 처리 농도에서도 정상 2배체 빈도는 급감하는 것으로 나타났으며 미꾸라지 난이 UV 처리에 매우 민감함을 잘 시사하고 있고 이전의 UV를 이 용한 웅성발생성 개체 유도와 유사한 결과를 나타내었다 (Maremgpmo and Onoue, 1998; Ungar et al.
- 이상의 연구 결과 미꾸라지 난 유전물질의 불활성화 및 웅성 발생성 처녀 생식은 X-ray 및 Cobalt등 방사능의 사용 없이 비 교적 간단한 UV 처리만으로도 성공적으로 얻어질 수 있으며 flow cytometry 및 인위적으로 도입된 형질전환 유전자 표지를 이용하여 효과적이고 신속한 웅성발생성 반수체 genome을 동 정할 수 있었다. 본 연구를 바탕으로 genetic masking이 없는 반수체 모델의 이용, 그리고 genome restoration을 통한 생존력 있는 동일 종 내 diploid androgenesis가 용이하게 실현될 수 있 으리라 판단되며, 종래 미꾸라지 웅성발생성 이배체 유도 시 문 제시 되던 nuclear cytoplasmic barrier의 취약점 극복에 기여할 수 있으리라 기대된다.
- 이와 대조적으로 저 농도의 UV 처리 구간에서는 group-IV (abnormally deformed)의 출현이 유의적으로 관찰되었는데 본 그룹에 속한 개체들은 외견상 반수체와 유사하였으나 전형적 인 haploid syndrome의 특징을 나타내지는 않았고 그 기형의 정도 는 개체 별로 매우 다양하게 나타났다. 본 개체들은 tail beating 을 원활히 수행하지 못하였으며 부화 후에도 더 이상 초기 분 화(즉, 착색, 턱 발달 및 난황 흡수 등)가 잘 일어나지 못하며.
- 수정에 성공하여 발생을 개시한 자외선 처리군은 수정 24시 간째 형태적인 구분에 의해 크게 다음의 4종류의 발생 그룹으 로 나눌 수 있었다. 첫째, 무처리 대조군과 동일한 발생 양상을 나타내며 부화한 개체 역시 정상 2배체 자어의 형태와 동일한 그룹(group-1); 둘째, 기존에 알려져 있는 전형적인 haploid syndrome 을 보이는 반수체 그룹(group-II); 셋째, 정상적인 배 발생을 보 이지 못하고 blastula 이후에 마치 세포 덩어리처럼 보이는 'underdeveloped cell mass, 그룹(group-III); 그리고 넷째, 정확 한 2배체 또는 전형적인 반수체 형태를 띄지 못하는 abnormal 형태의 그룹(group-IV)으로 대별되었다(photograph not shown). Group-T (typical 2N)은 UV 처리 농도가 소폭 증가하여도 급 격히 감소하기 시작하여 제일 낮은 UV 농도에서도 57%로 감 소하였으며, 2, 70。ergs 및 5, 400 ergs에서는 14~29%로 나타났 고, 그 이상의 농도에서는 1〜3%로 나타났다.
- Group-IV (abnormally deformed)는 저 농도의 UV 조사 조건 에서 특이적으로 관찰되는 그룹이었다. 최소 농도인 1, 350 ergs 부터 6, 750 ergs의 농도까지 14.7〜38.0%의 빈도로 가장 높게 관찰되 었으며 이후 고농도에서는 유의적으로 그 출현율이 감소 하였고(1〜6%), 18, 900 ergs 이상에서는 더 이상 관찰되지 않았다 (Fig. 2).
- 3에서 보듯이 각 구간별 부화율 및 반수체 유도율은 상기 실험과 유사한 경향을 보였으며 최초 처리된 난의 수를 기준으로 계산된 수율을 고려 시 미꾸라지 난 불활성화의 최적 UV 처리 구간은 120초(10, 800 ergs)로 나 타났고 통계적 유의차를 고려할 경우 100〜130초 (9, 000〜11, 700 ergs) 처리 구간 역시 우수한 성적을 나타내었다. 최적 조건에 서 얻어진 웅성발생성 반수체의 최대 수율은 50% 이상으로 관 찰되었다. 본 연구 의 수율은 종래의 여타 어종에서 보고된 동 일 종내 웅성발생성 반수체 유도 수율은 물론 잉어난을 이용한 본 어종의 웅성발생성 반수체 유도와 비교시에도 우수한 성적 으로 나타났다(Bongers et al.
후속연구
- 이는 모계 genome내 tandem array로 존재하던 transgene unit 중 일부 소량의 transgene fragment가 UV 조사에 의해 완전히 inactivation되지 못하고 웅성발생성 반수체 genome에 잔류하였 을 가능성 또는 group-【V에 속한 개체를 잘못 선발하였을 가능 성 등이 추정된다. 그러나 차후 보다 자세한 분석이 필요한 상 태로서 아직 본 개체들의 genome내 모계 잔여 유전물질의 오 염 정도 및 정량화는 정확히 평가할 수 없다. 웅성발생성 무지 개 송어를 대상으로 한 microsatellite 분석 시 일부 개체들(약 8%)에서 이형접합성(heterozygosity)의 잔존 상태가 보고된 바 있고, 이 역시 UV inactivation 과정 중 모계 유전물질의 불완 전한 불활성화에 기인하는 것으로 추정되어 본 연구결과와 유 사하였다(Tanck et aL, 2001).
- 그러나 비록 낮은 빈도이기는 하나 전 형적인 haploid syndrome을 보이는 개체들에서도 일부 partial gene transfer가 일어날 수 있다는 점등은 향후 해결해야 될 기 술적 과제들로 남아 있으며 flow cytometry를 통해 차후 웅성 발생성 이배체가 확인되더라도 다양한 genome 영역에 대한 homozygosity 분석의 필요성을 시사하고 있다. 본 연구를 바탕 으로 동일 종내 이배체 복원 기술의 정밀 조작 연구가 뒤따라 야 할 것이다.
- 이상의 연구 결과 미꾸라지 난 유전물질의 불활성화 및 웅성 발생성 처녀 생식은 X-ray 및 Cobalt등 방사능의 사용 없이 비 교적 간단한 UV 처리만으로도 성공적으로 얻어질 수 있으며 flow cytometry 및 인위적으로 도입된 형질전환 유전자 표지를 이용하여 효과적이고 신속한 웅성발생성 반수체 genome을 동 정할 수 있었다. 본 연구를 바탕으로 genetic masking이 없는 반수체 모델의 이용, 그리고 genome restoration을 통한 생존력 있는 동일 종 내 diploid androgenesis가 용이하게 실현될 수 있 으리라 판단되며, 종래 미꾸라지 웅성발생성 이배체 유도 시 문 제시 되던 nuclear cytoplasmic barrier의 취약점 극복에 기여할 수 있으리라 기대된다. 그러나 비록 낮은 빈도이기는 하나 전 형적인 haploid syndrome을 보이는 개체들에서도 일부 partial gene transfer가 일어날 수 있다는 점등은 향후 해결해야 될 기 술적 과제들로 남아 있으며 flow cytometry를 통해 차후 웅성 발생성 이배체가 확인되더라도 다양한 genome 영역에 대한 homozygosity 분석의 필요성을 시사하고 있다.
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