[논문]The Expression and the Subcellular Localization of Regulatory Subunits of Class IA Phosphoinositide 3-Kinase in L6 Skeletal Muscle Cell

Woo Joo-Hong; Lim Jeong-Soon; Kim Hye-Sun

문제 정의

그러나 최근에는 이 효소가 핵에도 존재한다는 보고가 있어 핵에서의 이 단백질의 기능에 대한 관심이 집중되고 있다. 본 연구에서 PI3-kinase의 조절 단위체가 세포질뿐만 아니라 핵에도 존재하고, 핵과 세포질에 존재하는 조절 단위체가 다르며, 그것은 분화 과정과 menadione에 의한 산화 스트레스에 의해서 조절될 수 있음을 밝혔다. 그러므로 핵에 존재하는 PI3-kinase의 작용을 밝히는 연구가 계속 되어야 한다.
이 결과들은 menadione의 작용과 PI3-kinase가 밀접한 관련이 있음을 암시하는 것이다. 본 연구에서는 L6 배양 근원 세포에서 menadione에 의한 산화 스트레스와 이와 관련된 PI3- kinase의 작용을 연구하기 위하여 class IA PI3-kinase의 조절 단위체들의 발현 양상의 변화와 함께 세포 내의 분포에 대해 조사하였다.
앞서의 결과를 통하여 배양 근원 세포에서 PI3-kinase의 존재를 확인하였으므로 이번에는 L6 근원 세포의 분화 과정에서 이들 조절 단위체의 발현 및 세포 내 분포가 변화하는지를 조사하였다. 증식 배양액에서 3 일간 배양하여 분화 유도 직전의 근원 세포 (0 시간)와 분화 유도 후 48 시간, 96 시간 후의 세포를 각각 수확하여, 재료 및 방법에 기술한 대로 전체 세포 추출물 (total)을 얻었다.
이번에는 menadione의 작용에 의해서 PI3-kinase 조절 단위체들의 발현과 세포 내에서의 분포가 변화하는지를 조사하였다. 앞서 기술한 방법에 따라 핵 분획을 세포질 분획과 따로 분리하여 얻고 PI3-kinase 조절 단위체들의 양을 anti-PI3 kinase p85 항체를 이용하여 확인하였다 (Fig.
그러나 이렇게 이동한 p85가 핵에서 어떤 작용을 하는지는 아직 분명하게 밝혀지지 않고 있다. 이번에는 위 결과에서 밝힌 핵에 존재하는 PI3-kinase의 조절 단위체들의 기능이 위의 보고와 관련성이 있는지를 조사 하였다. 즉, L6 근원 세포에서도 산화 스트레스에 의해 이들 조절 단위체의 세포 내 분포에 영향을 주는지를 알아보았다.
이번에는 위 결과에서 밝힌 핵에 존재하는 PI3-kinase의 조절 단위체들의 기능이 위의 보고와 관련성이 있는지를 조사 하였다. 즉, L6 근원 세포에서도 산화 스트레스에 의해 이들 조절 단위체의 세포 내 분포에 영향을 주는지를 알아보았다. 본 연구에서는 menadione을 선택하였는데, 이미 menadionee 여러 종류의 세포들에서 산화 스트레스를 유발하여 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려진 물질이다 (Lamson and Plaza, 2003).

가설 설정

Bar indicates 10 μm. B. Equal amounts (20μg) of cytosolic (lane C) or nuclear (lane N) fraction were separated on a SDS-PAGE, transferred to PVDF membrane. The regulatoiy subunits of PI3-kinase were identified by using an anti-PI3 kinase p85 antibody.

제안 방법

커버 글라스 위에 배양한 L6 근원 세포를 -20℃의 methanol로 10 분간 고정하였다. 3% BSA와 10% 정상 염소 혈청을 섞어 만든 TBST 용액을 고정된 세포와 반응시켜 비 특이적인 항원의 결합을 막았다. Anti-PI3 kinase p85 항체를 3% BSA 용액과 1:100의 비율로 희석하여 1 시간 동안 상온에서 반응하였다.
TBST 용액으로 5 분씩 4 번 반복하여 씻어준 후 fluorescent isothiocyanate (FITC)가 결합된 항 토끼 면역 글로불린 항체를 1:100의 비율로 희석하여 40 분 동안 상온에서 반응시켰다. TBST 용액으로 5 분씩 4 번 반복하여 씻어 준 후 공촛점 현미경 (confocal laser scanning microscope)에서 관찰하였다.
융합 지수(fusion index)를 측정하기 위해 표시된 시간까지 배양한 세포를 PBS로 3 회 씻어 준 후, AFA (95% ethanol: 40% formaldehyde : acetic acid = 20 : 2: 1) 용액으로 5 분간 고정한다. 고정된 세포는 Erlich's hematoxylin 용액으로 30 분 동안 염색을 한 후 위상차 현미경으로 관찰하였다. 200 배의 배율에서 임의로 선택된 시야 안에 존재하는 전체의 핵 수 중에서 3개 이상의 핵이 포함된 근관 안에 존재하는 핵 수의 비율을 융합 지수로 나타내었다.
세포를 DMEM으로 2 번 씻어 준 다음 혈청이 포함되지 않은 DMEM으로 갈아주고 37℃, 5% CO₂의 조건에서 1 시간 동안 배양하였다. 그 다음 menadione의 용해에 사용된 0.05% DMSO와 5, 10, 15, 20, 50 μM menadione을 각각 처리한 후 24 시간 동안 동 일한 조건에서 배양한 후 MTT 시약을 각 well에 1 mg/ml의 농도로 처리하고 동일 조건에서 4 시간 더 배양하였다. 형성된 감청색의 formazan crystal DMSO로 용해하고 ELISA plate reader (Bio-Rad)를 이용하여 655 nm의 파장에서의 흡광도를 기준으로 하여 570 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다.
근원 세포에 존재하는 class IA PI3-kinase의 조절 단위체의 종류를 확인하기 위하여 분리된 핵 분획 (lane N)과 나머지 부분 (lane C; 편의상 이후에는 세포질 분획으로 명명함)을 따로 수확하여 단백질을 용해한 다음 전기 영동으로 전개하고 anti-PI3 kinase p85 항체를 이용하여 염색하였다. 핵 분획의 분리가 성공적인지의 여부는 핵의 표지 단백질인 histone H4의 존재로 확인하였다.
동량의 단백질을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel 전기 영동 (SDS-PAGE)으로 분리한 후, polyvinylidene difluoride (PVDF) 막으로 전기 이동 하였다. 단백질이 전이된 막은 5% 탈지 분유가 포함된 TBST 완충 용액 (10 mM Tris, pH 7.
또한 앞서의 방법과 마찬가지로 핵 분획 (nucleus)을 따로 얻고 세포질 분획 (cytosol)과 분리하였다. 동량의 단백질을 전기 영동으로 전개하고 각 추출물에 존재하는 PI3-kinase의 조절 단위체를 면역염색을 통하여 알아보았다 (Fig. 2B). 먼저 p85의 발현은 분화 초기부터 시작되었음을 보여주고 있으며, 전체 세포 추출물에 존재하는 p85의 양은 분화가 진행됨에 따라 약간 감소하였다.
본 연구에서는 menadione을 선택하였는데, 이미 menadionee 여러 종류의 세포들에서 산화 스트레스를 유발하여 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려진 물질이다 (Lamson and Plaza, 2003). 먼저 L6 근원 세포가 menadione에 의해 유발되는 산화 스트레스에 영향을 받는지 확인해 보기 위하여 세포의 생존율을 MTT assay를 통하여 조사해 보았다 (Fig. 3A). 그림에서 보는 바와 같이 저농도 (5~10 μM)의 menadione에서는 세포의 생존율이 오히려 10-20% 정도 증가하였다.
PI3-kinase는 골격근의 생장과 분화에 중요한 역할을 하는 효소이지만 class IA PI3-kinase의 조절 단위체의 기능에 대해서는 아직 정확하게 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 먼저 이들 조절 단위체의 세포 내 존재 위치를 조사하기 위하여 핵을 따로 분리하였다. 세포에서 핵을 분리하기 위하여 23-gauge 주사 바늘로 여러 번 세포를 이동시켜 세포막을 파괴하였다.
본 연구에서는 먼저 이들 조절 단위체의 세포 내 존재 위치를 조사하기 위하여 핵을 따로 분리하였다. 세포에서 핵을 분리하기 위하여 23-gauge 주사 바늘로 여러 번 세포를 이동시켜 세포막을 파괴하였다. 이 때 세포질이 깨끗하게 제거된 핵이 90% 이상 포함될 때까지 위상차 현미경으로 확인을 하면서 반복하였다.
이번에는 menadione의 작용에 의해서 PI3-kinase 조절 단위체들의 발현과 세포 내에서의 분포가 변화하는지를 조사하였다. 앞서 기술한 방법에 따라 핵 분획을 세포질 분획과 따로 분리하여 얻고 PI3-kinase 조절 단위체들의 양을 anti-PI3 kinase p85 항체를 이용하여 확인하였다 (Fig. 3B). 그림에서 보는 바와 같이 menadione의 처리 농도와 처리 시간이 증가할수록 세포질 분획에 존재하는 p85의 양은 다소 감소하였다.
한편 p55는 핵에서만 검출되었고, 15 μM menadionee 10 분 에, 5 μM menadionee 30 분 처리 시간에 p55의 양이 다소 증가하였음을 보여주고 있다. 역시 세포질과 핵의 분리를 확인하기 위하여 histone H4의 분포를 확인하였다. 특이한 점은 15 μM menadione이 10 분 동안 처리된 경우 세포질과 핵 어디에서도 histone H4가 검출되지 않았고, 30 분 처리에서는 핵에서 약간 회복되었다.
분화를 유도하기 위해서는 세포를 phosphate buffered saline (PBS)로 2 번 씻어 준 다음 5% HS이 포함된 DMEM (분화 배양액)으로 교환하여 동일 조건에서 표시된 시간까지 배양하였다. 융합 지수(fusion index)를 측정하기 위해 표시된 시간까지 배양한 세포를 PBS로 3 회 씻어 준 후, AFA (95% ethanol: 40% formaldehyde : acetic acid = 20 : 2: 1) 용액으로 5 분간 고정한다. 고정된 세포는 Erlich's hematoxylin 용액으로 30 분 동안 염색을 한 후 위상차 현미경으로 관찰하였다.
TBST 완충 용액으로 막을 5 분씩 3 번 씻어준 후 peroxidase가 결합된 2차 항체와 함께 1 시간 동안 4℃에서 천천히 교반하였다. 이 후 TBST 용액으로 5 분씩 3 번 씻어준 다음 enhanced chemiluminescence (ECL)법으로 항체가 결합한 단백질을 확인하였다.
이 결과는 L6 근원 세포의 핵 분획에 PI3-kinase 조절 단위체가 존재함을 분명히 보여주는 결과이며, 또한 핵 분획에는 세포질 분획과는 달리 P85 외에 p55와 p50의 조절 단위체가 존재함을 보여주는 것이다. 이번에는 anti-PI3 kinase p85 항체로 세포를 염색하고 공촛점 현미경으로 관찰함으로써 PI3-kinase 조절 단위체의 세포 내 분포를 알아보았다 (Fig. 1C). 그 결과, PI3-kinase 조절 단위체들은 근원 세포의 세포질 전체에 흩어져 있고 일부는 세포막 부분에 위치하고 있으며, 일부는 핵 주변에 분포되어 있음을 보여주었다.
앞서의 결과를 통하여 배양 근원 세포에서 PI3-kinase의 존재를 확인하였으므로 이번에는 L6 근원 세포의 분화 과정에서 이들 조절 단위체의 발현 및 세포 내 분포가 변화하는지를 조사하였다. 증식 배양액에서 3 일간 배양하여 분화 유도 직전의 근원 세포 (0 시간)와 분화 유도 후 48 시간, 96 시간 후의 세포를 각각 수확하여, 재료 및 방법에 기술한 대로 전체 세포 추출물 (total)을 얻었다. 또한 앞서의 방법과 마찬가지로 핵 분획 (nucleus)을 따로 얻고 세포질 분획 (cytosol)과 분리하였다.
1A의 좌측 사진은 위상차 현미경으로 세포막과 세포질 부분이 거의 제거된 핵을 관찰한 모습이다. 현미경으로 관찰된 것이 핵이 맞는지 확인하기 위하여 DNA와 결합하는 propidium iodide로 염색한 후 형광 현미경으로 관찰하였다 (Fig. 1A, 우측 사진). 그 결과 수확된 핵이 propidium iodide로 염색된 것과 일치함으로 핵이 순수하게 분리되었음을 확인하였다.
05% DMSO와 5, 10, 15, 20, 50 μM menadione을 각각 처리한 후 24 시간 동안 동 일한 조건에서 배양한 후 MTT 시약을 각 well에 1 mg/ml의 농도로 처리하고 동일 조건에서 4 시간 더 배양하였다. 형성된 감청색의 formazan crystal DMSO로 용해하고 ELISA plate reader (Bio-Rad)를 이용하여 655 nm의 파장에서의 흡광도를 기준으로 하여 570 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다.

대상 데이터

에서 구입하였다. Bradford 용액은 Bio-Rad에서 구입하였고, Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)과 menadione, 그 외의 별도로 명시하지 않은 시약들은 Sigma에서 구매하였다.
L6 골격근 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하였다. 태아 소의 혈청 (fetal bovine serum; FBS), 말혈청 (horse serum;HS), antibiotic-antimycotic solution 및 trypsine WelGENE Inc.

이론/모형

Menadione에 의한 세포의 생존율을 측정하기 위해서 MTT assay를 시행하였다. L6 근원 세포를 96-well 배양 용기 (flat bottom)에 한 well당 1,500 개의 세포를 seeding하고 37℃, 5% CO₂의 조건에서 72 시간 동안 배양하였다.
그리고 분리된 침전물을 초음파 분쇄기로 분쇄하여 그 추출물을 핵 분획이라고 명명하였다. 전체 세포 추출물을 비롯한 각 분획의 단백질 농도는 소의 혈청 알부민 (bovine serum albumin;BSA)을 표준 단백질로 하여 Bio-Rad 시약을 이용하는 Bradford법으로 정량하였다.

성능/효과

1A, 우측 사진). 그 결과 수확된 핵이 propidium iodide로 염색된 것과 일치함으로 핵이 순수하게 분리되었음을 확인하였다.
1C). 그 결과, PI3-kinase 조절 단위체들은 근원 세포의 세포질 전체에 흩어져 있고 일부는 세포막 부분에 위치하고 있으며, 일부는 핵 주변에 분포되어 있음을 보여주었다. 또한 핵 안에도 부분적으로 모여 있는 것을 볼 수 있다 (Fig.
1에서와 같이 p55는 핵 분획에서만 발견되었는데 분화가 진행됨에 따라 그 양은 다소 감소하였다. 그리고 전체 세포 추출물에서는 검출되지 않았던 p50 역시 핵 분획만을 따로 전기 영동 하였을 때 검출되었으며, 그 양은 분화가 진행됨에 따라 감소하였고 세포 융합이 거의 다 이루어진 96 시간에는 거의 검출되지 않았다. 특이할 만한 점은 48 시간의 핵에서만 약 60 kDa에 해당하는 단백질이 anti-PI3 kinase p85 항체에 의해서 검출되는데 이것이 근원 세포의 융합이 활발한 이 시기에만 발현하는 또 다른 PI3-kinase 조절 단위체인지 아니면 비 특이적 반응인지에 대해서는 더 확인이 필요하다.
1B). 또한 세포질에 존재한다고 알려져 있는 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)도 핵 분획에서 전혀 검줄되지 않아 본 연구에서 분리한 핵 분획에는 세포질 분획도 오염되어 있지 않음을 확인하였다 (data not shown).
핵 분획의 분리가 성공적인지의 여부는 핵의 표지 단백질인 histone H4의 존재로 확인하였다. 또한 핵 분획에 세포막 단백질이 오염되었는지의 여부는 세포막 단백질인 Na⁺/K⁺ ATPase의 존재로 확인하였다. 핵 분획에서 histone H4의 존재는 확인되었으나 Na⁺/K⁺ ATPase는 확인되지 않는 것으로 보아 핵 분획의 분리가 성공적인 것을 알 수 있다(Fig.
2B). 먼저 p85의 발현은 분화 초기부터 시작되었음을 보여주고 있으며, 전체 세포 추출물에 존재하는 p85의 양은 분화가 진행됨에 따라 약간 감소하였다. 그리고 p55의 발현양은 분화 과정에 따라 크게 감소하는 것으로 나타났으며, p50의 발현양은 극히 적어서 본 그림에서는 뚜렷이 확인하기 어렵다.
본 연구에서 사용한 anti-PI3 kinase p85 항체는 class IA의 PI3-kinase 조절 단위체들을 모두 인식하는 항체이다 (Inukai et al, 1996). 면역염색 결과, p85는 핵 분획 (lane N)과 세포질 분획 (lane C) 모두 검출되었으나 p55와 p50은 핵 분획에서만 확인되었다 (Fig. IB). 이 결과는 L6 근원 세포의 핵 분획에 PI3-kinase 조절 단위체가 존재함을 분명히 보여주는 결과이며, 또한 핵 분획에는 세포질 분획과는 달리 P85 외에 p55와 p50의 조절 단위체가 존재함을 보여주는 것이다.
성장 인자가 풍부하게 존재하는 증식 배양액에서 배양 중인 L6 근원 세포를 분화 배양액으로 바꾸어 주면 증식을 멈추고 서로 일렬로 배열하면서 길게 신장된다. 본 실험의 조건에서는 분화 유도 후 24-30 시간째부터 융합을 시작하여 96 시간에 이르면 약 80%의 세포가 융합하는 것으로 나타난다 (Fig. 2A). 한편 PI3-kinase의 활성은 골격근 세포의 분화에 반드시 필요하며, PI3-kinase의 활성을 억제하면 근특이 단백질인 myogenin의 발현이 저해될 뿐만 아니라 근원 세포의 융합도 억제되는 것으로 알려져 있다.
IB). 이 결과는 L6 근원 세포의 핵 분획에 PI3-kinase 조절 단위체가 존재함을 분명히 보여주는 결과이며, 또한 핵 분획에는 세포질 분획과는 달리 P85 외에 p55와 p50의 조절 단위체가 존재함을 보여주는 것이다. 이번에는 anti-PI3 kinase p85 항체로 세포를 염색하고 공촛점 현미경으로 관찰함으로써 PI3-kinase 조절 단위체의 세포 내 분포를 알아보았다 (Fig.
이 결과는 PI3-kinase 조절 단위체들이 알려진 바와 같이 L6 근원 세포의 세포막과 세포질에 존재하지만, 핵의 막 주변과 핵 안에도 존재한다는 것을 분명히 보여주는 것이다. L6 근원 세포의 핵에서도 p85, p55, 및 p50와 같은 PI3-kinase의 조절 단위체들이 발견된다는 것은 이들 조절 단위체가 핵에서 독자적으로 혹은 PI3-kinase의 작용을 통하여 어떤 기능을 하고 있음을 시사하는 것이다.
반면 핵에는 p85와 함께 다른 조절 단위체인 p55와 p50이 존재하며 이들의 양은 분화 초기에 많고 분화가 진행되면서는 감소하는 것으로 보아 이들의 작용은 본격적인 분화가 진행되기 전에 필요한 것으로 생각된다. 이상의 결과는 근원 세포의 분화 과정에서 class IA PI3-kinase의 조절 단위체의 종류와 발현양이 핵과 세포질 분획에서 다르게 나타나고 그것은 이 단백질의 기능이 분화 단계에 따라 다를 수 있음을 시사하는 것이다.

후속연구

그리고 전체 세포 추출물에서는 검출되지 않았던 p50 역시 핵 분획만을 따로 전기 영동 하였을 때 검출되었으며, 그 양은 분화가 진행됨에 따라 감소하였고 세포 융합이 거의 다 이루어진 96 시간에는 거의 검출되지 않았다. 특이할 만한 점은 48 시간의 핵에서만 약 60 kDa에 해당하는 단백질이 anti-PI3 kinase p85 항체에 의해서 검출되는데 이것이 근원 세포의 융합이 활발한 이 시기에만 발현하는 또 다른 PI3-kinase 조절 단위체인지 아니면 비 특이적 반응인지에 대해서는 더 확인이 필요하다.

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