목 적: 본 연구는 생쥐 전핵시기 배아를 완만동결법과 유리화동결법으로 동결-융해 후 배아의 생존율과 성장률을 비교하고자 시행하였다. 연구방법: 과배란을 유도한 생쥐로부터 전핵시기 배아를 획득하여 10% SSS가 첨가된 HTF 배양액으로 약 1시간 동안 배양한 후 두 개의 전핵이 관찰되는 정상적인 형태의 배아만 선별하여 동결하였다. 동결방법으로는 1.5 M PROH에 0.1 M sucrose가 함유된 완만동결법과 40% ethylene glycol, 18% Ficoll, 0.5 M sucrose가 혼합된 EFS40 용액과 EM grid를 이용하여 이용한 유리화동결법을 실시하였다. 동결-융해 후 전핵시기 배아의 회수율, 생존을 및 부화 포배기로의 성장률과 부화율을 비교하였다. 결 과: 각각의 방법으로 동결-융해 후 24시간 동안 배양하였을 때 2-세포기까지의 성장률은 완만동결군이 59.1%이었고 유리화동결군이 77.0%로 두 군간에 유의한 차이를 보였고 (p<0.003), 48시간 동안의 배양에서도 완만동결군이 53.3%이고 유리동결군이 72.6%로 유의하게 유리화동결군에서 높은 수세포기까지의 성장률을 보였으며 (p<0.003), 72시간 배양하였을 때의 상실배로의 성장률 역시 완만동결군이 46.7%이고 유리화동결군이 67.3%로 유리화동결군에서 유의하게 높은 성장률을 보였다 (p<0.001). 융해 후 144시간 동안 배양하였을 때의 부화포배기로의 성장률은 완만동결군이 26.3%이고 유리화동결군이 43.4%로 유리화동결군에서 유의하게 높은 성장률을 보였다 (p<0.005). 결 론: 생쥐 전핵시기 배아의 동결보존에서 유리화동결법은 완만동결법 보다 시간이 단축되고 비싼 장비가 필요없어 경제적이고 간단했을 뿐 아니라 동결-응해 후 전반적으로 높은 생존율과 성장률을 나타내었다.
목 적: 본 연구는 생쥐 전핵시기 배아를 완만동결법과 유리화동결법으로 동결-융해 후 배아의 생존율과 성장률을 비교하고자 시행하였다. 연구방법: 과배란을 유도한 생쥐로부터 전핵시기 배아를 획득하여 10% SSS가 첨가된 HTF 배양액으로 약 1시간 동안 배양한 후 두 개의 전핵이 관찰되는 정상적인 형태의 배아만 선별하여 동결하였다. 동결방법으로는 1.5 M PROH에 0.1 M sucrose가 함유된 완만동결법과 40% ethylene glycol, 18% Ficoll, 0.5 M sucrose가 혼합된 EFS40 용액과 EM grid를 이용하여 이용한 유리화동결법을 실시하였다. 동결-융해 후 전핵시기 배아의 회수율, 생존을 및 부화 포배기로의 성장률과 부화율을 비교하였다. 결 과: 각각의 방법으로 동결-융해 후 24시간 동안 배양하였을 때 2-세포기까지의 성장률은 완만동결군이 59.1%이었고 유리화동결군이 77.0%로 두 군간에 유의한 차이를 보였고 (p<0.003), 48시간 동안의 배양에서도 완만동결군이 53.3%이고 유리동결군이 72.6%로 유의하게 유리화동결군에서 높은 수세포기까지의 성장률을 보였으며 (p<0.003), 72시간 배양하였을 때의 상실배로의 성장률 역시 완만동결군이 46.7%이고 유리화동결군이 67.3%로 유리화동결군에서 유의하게 높은 성장률을 보였다 (p<0.001). 융해 후 144시간 동안 배양하였을 때의 부화포배기로의 성장률은 완만동결군이 26.3%이고 유리화동결군이 43.4%로 유리화동결군에서 유의하게 높은 성장률을 보였다 (p<0.005). 결 론: 생쥐 전핵시기 배아의 동결보존에서 유리화동결법은 완만동결법 보다 시간이 단축되고 비싼 장비가 필요없어 경제적이고 간단했을 뿐 아니라 동결-응해 후 전반적으로 높은 생존율과 성장률을 나타내었다.
Objective: The aim of this study was to compare the efficacy of slow freezing with vitrification method for cryopreservation of mouse pronuclear stage embryos. Methods: Mouse pronuclear embryos obtained from superovulated mice and classified into 2 groups of slow freezing and vitrification. Slow fre...
Objective: The aim of this study was to compare the efficacy of slow freezing with vitrification method for cryopreservation of mouse pronuclear stage embryos. Methods: Mouse pronuclear embryos obtained from superovulated mice and classified into 2 groups of slow freezing and vitrification. Slow freezing solution consisted of 1.5 M PROH, 0.1 M sucrose, while vitrification solution consisted of 40% ethylene glycol, 18% Ficoll and 0.5 M sucrose diluted in Dulbecco's phosphate-buffered saline supplemented with 10% SSS. Recovery and survival rates after thawing and development rates to hatching balstocyst stage were compared between two groups. Results: After freezing and thawing, recovery rate of slow freezing group was 93.8%, whereas vitrification group was 66.5% (p<0.01). Survival rate of recovered embryos were similar between two groups as 83.2% in slow freezing and 87.6% in vitrification. Embryo development rates to 2-cell stage after 24 hrs (77.0% vs 59.1%), 4-cell after 48 hrs (72.6% vs 53.3%), blastocyst after 96 hrs (53.1% vs 40.1%) of thawing were significantly higher in vitrification group than those of slow freezing group, respectively. Conclusion: The vitrification method may provide better developmental competence of frozen-thawed embryos than that of slow freezing method for cryopreservation of mouse pronuclear stage embryos.
Objective: The aim of this study was to compare the efficacy of slow freezing with vitrification method for cryopreservation of mouse pronuclear stage embryos. Methods: Mouse pronuclear embryos obtained from superovulated mice and classified into 2 groups of slow freezing and vitrification. Slow freezing solution consisted of 1.5 M PROH, 0.1 M sucrose, while vitrification solution consisted of 40% ethylene glycol, 18% Ficoll and 0.5 M sucrose diluted in Dulbecco's phosphate-buffered saline supplemented with 10% SSS. Recovery and survival rates after thawing and development rates to hatching balstocyst stage were compared between two groups. Results: After freezing and thawing, recovery rate of slow freezing group was 93.8%, whereas vitrification group was 66.5% (p<0.01). Survival rate of recovered embryos were similar between two groups as 83.2% in slow freezing and 87.6% in vitrification. Embryo development rates to 2-cell stage after 24 hrs (77.0% vs 59.1%), 4-cell after 48 hrs (72.6% vs 53.3%), blastocyst after 96 hrs (53.1% vs 40.1%) of thawing were significantly higher in vitrification group than those of slow freezing group, respectively. Conclusion: The vitrification method may provide better developmental competence of frozen-thawed embryos than that of slow freezing method for cryopreservation of mouse pronuclear stage embryos.
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문제 정의
'9 그러나, 최근에는 전핵시기 배아에서 유리화동결법의 효용성이 보고되고 있다.2 따라서, 본 연구에서는 인간 전핵시기 배아의 동결 시에 효과적인 방법을 확립하기 위해 생쥐 전핵시 기 배 아를 이용하여 PROH 동결보호제와 straw를 이용한 완만동결법과 EFS40 동결보호제와 EM grid를 이용한 유리화동결 법을 시행하여 동결-융해 후 생존율 및 배아발달 률을 비교하여 각각의 동결법의 효용성을 알아보고자 하였다.
본 연구에서는 배아 동결보존술에서 가장 보편적으로 사용되고 있는 완만동결법과 새롭게 기대되고 있는 유리화동결법을 비교하여 생쥐 전핵시 기 배아의 동결보존을 위해 어느 방법이 최적의 동결방법인지 알고자 시도되었다. 먼저 완만동결과 유리화동결 후 융해한 전핵기 배아의 회수율에서 는 완만동결군이 93.
본 연구에서는 인간 전핵시기 배아의 동결에 최적의 동결방법을 적용하기 위해 생쥐 전핵시기 배아를 이용하여 완만동결법과 유리화동결법의 효용성을 비교하였다. 그 결과 ethylene glycol을 기본 동결보존액으로 사용한 유리화동결법 은 완만동결 법 보다 시간이 단축되고 비싼 장비가 필요 없어 경제적이고 간단했을 뿐 아니라 동결-융해 후 전반적으로 높은 생존율과 성장률을 나타내었다.
제안 방법
HCG 주사 후 18~22시간에 난관팽대부로부터 난구세포에 싸여있는 전핵시기 수정란을 회수하였다. 회수된 수정란을 67 IU/ml 농도의 hyaluronidase (Sigma, USA)로 처리하여 난구세포를 제거하고 DPBS 용액에서 두 번 세척하였다.
4 M sucrose가 첨가된 기본용액으로 옮겨 1분 30초 동안 처리하였다. 그 후 0.3 M, 0.2 M, 0.1 M, 0 M의 sucrose가 첨가된 기본용액에 단계별로 옮겨주고, 각 단계는 1분 30초씩 처리하였다. 융해가 끝난 배아는 완만동결군과 동일한 조건에서 배양하였다.
회수된 수정란을 67 IU/ml 농도의 hyaluronidase (Sigma, USA)로 처리하여 난구세포를 제거하고 DPBS 용액에서 두 번 세척하였다. 그 후 37℃, 5% CO2의 조건으로 조절된 배양기에서 10% Serum Substitute Supplement (SSS; Irvine Scientific, USA)가 첨가된 HTF 배양액에 넣어 약 1시간 동안 배양한 후 정상적인 형태의 두 개의 전핵이 관찰되는 수정란만을 실험에 사용하였다. 회수된 배아를 유리화 동결군과 완만동결군으로 나누어 동결하였고 사용된 배아의 수는 평균 15개였고 동결실험은 각각 12회에 걸쳐 시행하였다.
하루 이상 액체질소 안에 보관되어 있던 배아의 융해는 동결된 straw를 액체질소통에서 대기중으 로 옮겨 20초간 노출시킨 후 straw 표면의 물기를 제거한 다음 알코올을 묻힌 거즈로 닦아 소독하였다 Straw내의 배아와 동결보존액을 배양접시에 흘려내고 해부현미경하에서 배아의 수를 확인하였다. 기본융해액으로는 10% SSS가 첨가된 DPBS를 사용하였으며, 첫 단계에서는 1.0 M PROH와 0.2 M sucrose가 함유된 용액에서 5분간, 두 번째 단계에 서는 0.5 M PROH와 0.2 M sucrose 용액에서 5분간, 세 번째 단계에서는 0.2 M sucrose 용액에서 5분간, 마지막 단계에서는 기본융해액에서 5분간 처리하였다. 배아는 하루 전에 배양기에서 평형시킨 10% SSS가 함유된 HTF 배양액으로 수회 세척한 후 37℃, 5%CO2의 조건하에서 배양하였다.
BI7 CBA)의 5~6주령의 암컷과 10~13주령의 생식능력 이 확인된 동종의 수컷 생쥐를 사용하였다. 난포의 성장을 촉진하기 위해서는 pregnant mares' serum gonadotropin (PMSG; Sigma, USA) 5 IU를 복강내에 주사하고, 48시간 후에 5 IU human chorionic gonadotropin (hCG:, Sigma, USA)를 주입하여 과배란을 유도하였다. HCG 주사 후 즉시 수컷과 1:1로 합사시켜 교미를 유도하였으며, 다음날 질전이 확인된 개체만을 실험에 사용하였다.
외의 얼음결정형성에 따른 손상이 배아의 발달에 유해한 영향을 준 것으로 사료된다. 또한, 배아 동결보존 후 융해시 동결보호제의 제거를 위해 재수화과정을 거치는데, 완만동결 후 융해 시는 1.0 M에서부터 0.5 M과 0.2 M sucrose의 3단계 재수 화과정을 거치는 반면, 유리화동결 후 융해과정에서는 0.5 M로부터 0.4 M, 0.3 M, 0.2 M, 0.1 M의 5단계 재수화과정을 통해 보다 효과적으로 동결보호제를 제거하였다. 2004년 Isachenko 등은 3단계과 정의 재수화보다 4단계의 재수화과정으로 동결보호제를 제거하는 것이 배아의 삼투압 변화에 따른 손상을 줄이는데 효과적이라고 하였다.
유리화동결은 10% SSS를 첨가한 DPBS를 기본 용액으로 하고 여기에서 5분간 평형을 유지한 다음, 20% ethylene glycol (Sigma, USA)이 첨가된 용액에 옮겨서 1분 30초 동안 배아를 전처리하였다. 이후 40% ethylene glycol, 18% Ficoll (Sigma, USA), 0.
융해한 전핵시기 배아의 회수율과 생존율은 동결 배아에 대한 백분율로 계산하였고, 융해 후 144 시간 동안 24시간 단위로 배아의 성장률 및 부화율을 관찰하였으며, 성장률 및 부화율은 회수된 배아에 대한 백분율로 평가하였다. 융해 후 200배의 도립현미경으로 관찰시, 세포질에 응집된 현상이 나타나지 않고 깨끗하며, 위란강이 비정상적으로 넓어지지 않고, 투명대가 밝고 온전한 형태의 배아를 생존한 것으로 판정하였다.
유리화동결은 10% SSS를 첨가한 DPBS를 기본 용액으로 하고 여기에서 5분간 평형을 유지한 다음, 20% ethylene glycol (Sigma, USA)이 첨가된 용액에 옮겨서 1분 30초 동안 배아를 전처리하였다. 이후 40% ethylene glycol, 18% Ficoll (Sigma, USA), 0.5 M sucrose가 혼합된 EFS40 동결용액에 옮긴 후 바로 electron microscopy (EM) grid (1GC 400; Pelco International, USA)에 적재하고 가능한 빨리 액체질 소에 침지하였으며 40초가 넘지 않도록 신속히 수행하였다.
하루 이상 액체질소 안에 보관되어 있던 배아의 융해는 동결된 straw를 액체질소통에서 대기중으 로 옮겨 20초간 노출시킨 후 straw 표면의 물기를 제거한 다음 알코올을 묻힌 거즈로 닦아 소독하였다 Straw내의 배아와 동결보존액을 배양접시에 흘려내고 해부현미경하에서 배아의 수를 확인하였다. 기본융해액으로는 10% SSS가 첨가된 DPBS를 사용하였으며, 첫 단계에서는 1.
그 후 37℃, 5% CO2의 조건으로 조절된 배양기에서 10% Serum Substitute Supplement (SSS; Irvine Scientific, USA)가 첨가된 HTF 배양액에 넣어 약 1시간 동안 배양한 후 정상적인 형태의 두 개의 전핵이 관찰되는 수정란만을 실험에 사용하였다. 회수된 배아를 유리화 동결군과 완만동결군으로 나누어 동결하였고 사용된 배아의 수는 평균 15개였고 동결실험은 각각 12회에 걸쳐 시행하였다.
대상 데이터
난포의 성장을 촉진하기 위해서는 pregnant mares' serum gonadotropin (PMSG; Sigma, USA) 5 IU를 복강내에 주사하고, 48시간 후에 5 IU human chorionic gonadotropin (hCG:, Sigma, USA)를 주입하여 과배란을 유도하였다. HCG 주사 후 즉시 수컷과 1:1로 합사시켜 교미를 유도하였으며, 다음날 질전이 확인된 개체만을 실험에 사용하였다. 생쥐 배아의 체외배양 에는 직접 제조한 Human Tubal Fluid (HTF) 배양액을 사용하였으며, 삼투압은 280 mOsm/kg으로 조절하였고, 4℃에 냉장보관하고 4주 이내에 사용하였다.
본 실험에서는 명 10시간과 암 14시간으로 광주기를 조절하고, 물과 먹이가 충분히 공급되는 상태에서 사육한 생쥐 제 1세대 잡종 B6CBAF1 (C57BI7 CBA)의 5~6주령의 암컷과 10~13주령의 생식능력 이 확인된 동종의 수컷 생쥐를 사용하였다. 난포의 성장을 촉진하기 위해서는 pregnant mares' serum gonadotropin (PMSG; Sigma, USA) 5 IU를 복강내에 주사하고, 48시간 후에 5 IU human chorionic gonadotropin (hCG:, Sigma, USA)를 주입하여 과배란을 유도하였다.
HCG 주사 후 즉시 수컷과 1:1로 합사시켜 교미를 유도하였으며, 다음날 질전이 확인된 개체만을 실험에 사용하였다. 생쥐 배아의 체외배양 에는 직접 제조한 Human Tubal Fluid (HTF) 배양액을 사용하였으며, 삼투압은 280 mOsm/kg으로 조절하였고, 4℃에 냉장보관하고 4주 이내에 사용하였다.
데이터처리
실험을 통해 얻은 모든 결과들은 SPSS 프로그램을 이용한 X2-test를 시행하여 통계적 유의성을 조사하였고, p값이 0.05 미만인 경우를 유의하다고 판정 하였다.
성능/효과
1.5 M PROH를 기본으로한 완만동결법과 40%의 enthylene glycol을 기본으로 한 EFS40 용액을 이용한 유리화동결법을 이용하여 생쥐 전핵시기 배아를 동결 및 융해 후 그 회수율과 생존율을 비교해본 결과, 회수율은 완만동결군이 동결된 147개의 배아 중 137개 배아를 회수하여 93.1%이었고 유리 화동결군은 동결된 169개의 배아 중 113개의 배아를 회수하여 66.9%로 완만동결군이 유리화동결군 에 비해 유의하게 높은 회수율을 보였으며 (p< 0.001), 회수 배아의 생존율은 완만동결군이 회수된 137개의 배아 중 114개 배아의 생존으로 83.2%이 고 유리화동결군은 회수된 113개 배아 중 99개의 배아가 생존하여 87.6%로 유리화동결군이 약간 높았으나 두 군간에 유의한 차이는 없었다.
본 연구에서는 인간 전핵시기 배아의 동결에 최적의 동결방법을 적용하기 위해 생쥐 전핵시기 배아를 이용하여 완만동결법과 유리화동결법의 효용성을 비교하였다. 그 결과 ethylene glycol을 기본 동결보존액으로 사용한 유리화동결법 은 완만동결 법 보다 시간이 단축되고 비싼 장비가 필요 없어 경제적이고 간단했을 뿐 아니라 동결-융해 후 전반적으로 높은 생존율과 성장률을 나타내었다. 특히 EM grid의 이용은 straw보다 조작이 간단하면서도 효과적이었다.
동결-융해 후 생존된 배아를 매 24시간 단위로 그 성장률을 살펴본 결과, 융해 후 24시간 배양 시 2-세포기까지의 성장률은 완만동결군이 59.1% (81/ 137)이었고 유리화동결군이 77.0% (87/113)로 두 군 간에 유의한 차이를 보였으며 (p<0.003), 48시간 동안의 배양에서도 완만동결군이 53.3% (73/137)이고 유리화동결군이 72.6% (82/113)로 유의하게 유리화 동결군에서 높은 4-세포기까지의 성장률을 보였으며 (p<0.003), 72시간 배양하였을 때의 상실배로의 성장률 역시 완만동결군이 46.7% (64/137)이고 유리 화동결군이 67.3% (76/113)로 유리화동결군에서 유의하게 높은 성장률을 보였다 (p<0.001).
2004년 Isachenko 등은 3단계과 정의 재수화보다 4단계의 재수화과정으로 동결보호제를 제거하는 것이 배아의 삼투압 변화에 따른 손상을 줄이는데 효과적이라고 하였다. 따라서, 완만동결군은 융해과정에서 의 3단계 재수화과정의 삼투압 변화가 배아의 발달 양상에 좋지 않은 영향을 준 것으로 보인다. .
1% (60/113)로 유리화동결군에서 다소 높은 성장률을 보였으나 유의한 차이는 없었다. 마지막으로, 144시간 배양시 부화포배기로의 성장률은 완만동결군이 26.3% (36/137)이고 유리화동결군이 43.4% (49/113)로 유리화동결군에서 유의하게 높은 성장률을 보였다 (p<0.005).
본 연구에서는 배아 동결보존술에서 가장 보편적으로 사용되고 있는 완만동결법과 새롭게 기대되고 있는 유리화동결법을 비교하여 생쥐 전핵시 기 배아의 동결보존을 위해 어느 방법이 최적의 동결방법인지 알고자 시도되었다. 먼저 완만동결과 유리화동결 후 융해한 전핵기 배아의 회수율에서 는 완만동결군이 93.1%로 66.9%의 유리화동결군에 비해 유의하게 높은 회수율을 보였지만, 회수 후의 생존율에서 는 유리화동결군이 유의하지 는 않지만 약간 더 높은 생존율을 나타내는 경향이었다. 유리 화동결법에서는 EM grid와 그 위의 배아가 외부에 직접적으로 노출되어 있어 배아의 손실률이 높은 것으로 생각되며, 이를 개선하기 위한 노력이 필요할 것으로 생각된다.
이때 동결-융해 후 생존율은 shaw가 34%, EM grid가 51~72%로 나타나 EM grid에서 높은 생존율을 보고하였다. 본 논문에서도 straw를 사용한 완만동결법보다 EM grid 를 사용한 유리화동결법이 회수율은 낮았지만 더 높은 생존율을 보였다.
융해 후 매 24시간마다 144시간 동안 배아의 성장률을 비교 관찰한 결과에서도 2-세포기, 4-세포기, 상실배기, 부화 포배기로의 성장률 모두 유리화동 결군에서 유의하게 높게 나타났으며, 포배기에서도 유의하지는 않지만 유리화동결군에서 더 높은 성장률을 관찰하였다. 이는 완만동결 시 우려되는 세포 내 .
융해 후 배양 96시간째 포배기 배아로의 성장률은 완만동결군이 40.1% (55/137)이었고 유리화동결 군이 53.1% (60/113)로 유리화동결군에서 다소 높은 성장률을 보였으나 유의한 차이는 없었다. 마지막으로, 144시간 배양시 부화포배기로의 성장률은 완만동결군이 26.
후속연구
특히 EM grid의 이용은 straw보다 조작이 간단하면서도 효과적이었다. 그러나 향후 인간 전핵시기 배아에 대한 동결보존에 대한 후속 연구와 유리화동결 법에서 보다 높은 회수율 획득을 위하여 동결 시 사용하는 보관용기에 대한 지속적인 개발과 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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