본 연구에서는 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4-EPSPS 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되고 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 제초제 복합 저항성 감자 식물체를 육성하고자 실험하였다. Bar 유전자를 포함하는 pCAMBIA3300에 CaMV35S 프로모터에 의해 조절되는 CP4-EPSPS 유전자를 도입하여 식물체용 발현 운반체를 제작하고, 이를 Agrobacterium tumafaciens EHA105에 도입하였다. 태동밸리 잎 절편체를 Agrobacterium과 공동배양한 다음, phosphinothricin 0.5 mg/L이 첨가된 배지에서 선발하고 호르몬 무처리 MS발근시켜 형질전환체 (E3-6)를 얻었다. PCR, Southern 분석, 효소면역반응 분석 등을 통해 두 가지 유전자가 도입되었으며 이들이 정상적으로 발현됨이 확인되었다. E3-6 식물체는 glufosinate-ammonium의 어린 식물체 잎 도포처리, glyphosate 용액에 치상한 식물체 조직에서의 shikimate 축적 여부 조사를 통하여 조사한 결과, 두 제초제에 대해 저항성을 나타내었다. 또한 형질전환감자의 전식물체에 대해 glyphosate와 glufosinate-ammonium 각각의 용액 또는 이들의 혼합물을 처리한 후 제초활성 반응을 조사한 결과, E3-6 형질전환 감자는 두 제초제를 각각 단독으로 처리할 때나 혼합하여 동시 처리할 때에도 동일한 저항성이 나타남을 확인하였다.
본 연구에서는 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4-EPSPS 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되고 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 제초제 복합 저항성 감자 식물체를 육성하고자 실험하였다. Bar 유전자를 포함하는 pCAMBIA3300에 CaMV35S 프로모터에 의해 조절되는 CP4-EPSPS 유전자를 도입하여 식물체용 발현 운반체를 제작하고, 이를 Agrobacterium tumafaciens EHA105에 도입하였다. 태동밸리 잎 절편체를 Agrobacterium과 공동배양한 다음, phosphinothricin 0.5 mg/L이 첨가된 배지에서 선발하고 호르몬 무처리 MS발근시켜 형질전환체 (E3-6)를 얻었다. PCR, Southern 분석, 효소면역반응 분석 등을 통해 두 가지 유전자가 도입되었으며 이들이 정상적으로 발현됨이 확인되었다. E3-6 식물체는 glufosinate-ammonium의 어린 식물체 잎 도포처리, glyphosate 용액에 치상한 식물체 조직에서의 shikimate 축적 여부 조사를 통하여 조사한 결과, 두 제초제에 대해 저항성을 나타내었다. 또한 형질전환감자의 전식물체에 대해 glyphosate와 glufosinate-ammonium 각각의 용액 또는 이들의 혼합물을 처리한 후 제초활성 반응을 조사한 결과, E3-6 형질전환 감자는 두 제초제를 각각 단독으로 처리할 때나 혼합하여 동시 처리할 때에도 동일한 저항성이 나타남을 확인하였다.
This study was conducted to develop an antibiotics marker-free potato (Solanum tuberosum L., cv. Taedong valley) plant having resistance against two herbicides. Agrobacterium tumefaciens strain EHA105, harboring a binary vector plasmid pCAMBIA3300 containing bar gene under the control of a promoter ...
This study was conducted to develop an antibiotics marker-free potato (Solanum tuberosum L., cv. Taedong valley) plant having resistance against two herbicides. Agrobacterium tumefaciens strain EHA105, harboring a binary vector plasmid pCAMBIA3300 containing bar gene under the control of a promoter CaMV35S and linked CP4-EPSPS genes driven by CaMV35S promoter, was used in the current study. The leaf segments of newly bred potato variety (cv. Taedong Valley) was co-cultured with Agrobacterium. Then, the regenerated individual shoots were excised and transferred to potato multiplication medium supplemented with 0.5 mg/L phosphinothricin. The shoots were rooted in MS medium without hormone and obtained putative transgenic plant E3-6. Integration of target genes into the E3-6 plant and their expression was confirmed by PCR, Southern analysis, and ELISA test. The tissue necrosis test on young leaf blade and shikimic acid accumulation test using the tissue of E3-6 plant were conducted to investigate the resistance to glufosinate-ammonium and glyphosate, respectively. The transgenic plants (E3-6) simultaneously showed a high resistance to both herbicides. The same results were surely obtained also in the whole plants foliar-treated with alone or mixture of two herbicides, glufosinate-ammonium and glyphosate.
This study was conducted to develop an antibiotics marker-free potato (Solanum tuberosum L., cv. Taedong valley) plant having resistance against two herbicides. Agrobacterium tumefaciens strain EHA105, harboring a binary vector plasmid pCAMBIA3300 containing bar gene under the control of a promoter CaMV35S and linked CP4-EPSPS genes driven by CaMV35S promoter, was used in the current study. The leaf segments of newly bred potato variety (cv. Taedong Valley) was co-cultured with Agrobacterium. Then, the regenerated individual shoots were excised and transferred to potato multiplication medium supplemented with 0.5 mg/L phosphinothricin. The shoots were rooted in MS medium without hormone and obtained putative transgenic plant E3-6. Integration of target genes into the E3-6 plant and their expression was confirmed by PCR, Southern analysis, and ELISA test. The tissue necrosis test on young leaf blade and shikimic acid accumulation test using the tissue of E3-6 plant were conducted to investigate the resistance to glufosinate-ammonium and glyphosate, respectively. The transgenic plants (E3-6) simultaneously showed a high resistance to both herbicides. The same results were surely obtained also in the whole plants foliar-treated with alone or mixture of two herbicides, glufosinate-ammonium and glyphosate.
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문제 정의
본 연구에서는 두 가지 제초제 저항성 유전자가 도입된 항생제 마커프리 감자를 국내 신품종 "태동벨리"를 대상으로 개발한 것이다. 따라서 이들 감자를 재배하면 다음과 같은 효과를 거둘 수 있다고 여겨진다.
따라서 잡초방제 측면에서의 이러한 기술적 과제들을 해결하기 위해서, 본 연구에서는 살초기작이 다르고 살초효과면에서 상가 및 상승작용을 가져 제초제 처리량 저감 재배체계를 도입할 수 있도록 두 가지 비선택성 제초제에 저항성을 가지되 항생제 마커를 포함하지 않는 형질전환 감자를 육성하고자 하였다.
제안 방법
5 mg/L이 첨가된 PSM 배지에서 10일 후부터 절편체의 절단면에서 캘러스가 형성되기 시작하였으며 약 6-8 주 후에 신초가 발생하기 시작하였다. 1차 선발배지에서 유기된 여러 신초들을 PPT 5 mg/L이 첨가된 SUM 배지로 옮긴 후 형질전환식물체를 선발하였다. 형질전환과정 중 신초 유도 선발배지 (PSM)와 발근 유도 선발배지 (PRMM)에서 선발된 개체의 신초발생율과 발근율은 표 2와 같았다.
Bar 유전자를 포함하는 pCAMBIA33OO에 CaMV35S 프로모터와 NOS 종결인자 사이에 CP4-EPSPS 유전자를 도입하여 식물체용 발현 운반체 p35S-EPSPS-B를 제작하였다 (Figure 1). 이를 Agrobacterium tumafaciens EHA105에 도입하였으며 Agrobacterium tumafaciens EHA 105/p35E-Bar로 명명하여 한국생명공학연구원 부설 유전자은행 (KCTC)에2006년 10 월 25일자로 기탁하였다 (KCTC 11008BP).
CP4-EPSPS (CP4 5-enol-pyrubylshikimate-3-phosphate synthase) 유전자를 분리하기 위하여 Bglll 및 Sad 제한효소 위치가 각각 도입된 프라이머 (5'-TAG CAG ATC TTT CAA GAA TGG-3', 5'-AAG GCA TGC AGG CTG TAG CCA-3')> 합성하였다. 또한 유전자 변형 콩인 라운드업-레디 (Roundup- Ready, Monsanto) 콩에서 통상적인 방법으로 총 RNA를 분리하고, 이로부터 역전사효소를 이용하여 cDNA를 제조하였다.
추출하였다. Genomic DNA 30 µg씩을 제한효소 EcoRI 및 Hindlll로 절단하여 agarose gel에서 전기 영동을 수행하였다. 이를 Zeta Probe membrane (Bio-Rad 사)으로 전달한 후 32P로 표지한 유전자 단편을 탐침으로 이용하여 혼성화(hybridization) 반응을 수행하였다.
(지상부가 20-30 cm 정도 자람). Glyphosate와 glufosinate-ammonium 원제를 0.1% Tween 20 + 43% acetone 용액에 각각 750 figM 및 500 µg/mℓ 농도로 용해시킨 후 이들을 각각 단독으로 또는 혼합하여 감자 식물체의 잎에 흠뻑 젖을 정도로 폿트당 50 mℓ씩 살포하였다. 제초제가 처리된 감자 식물체를 온실조건에 옮겨, 처리 후 2일째와 7일째에 잎의 엽록소 함량 변화와 광계 Ⅱ의 광량자 수율 변화를 측정하여 제초활성 반응을 조사하였다.
PCR 검정: Bar와 CP4-EPSPS 유전자의 존재여부를 확인하기 위하여 각각의 특이 프라이머 ㎛r의 경우 5'-CGG TCT GCA CCA TCG TCA ACC3와 5'-GTC CAG CTG CCA GAA ACC CAC-3', CP4-EPSPS의 경우 5'-CCG TAA GGA AGG CGA CAC-3, 와 5'-AGG AAG CTC ATG GCG ATG-3')를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 증폭반응은 GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer)에서 실시흐}였는바, 94℃ 에서 3분간 변성 반응시킨 후, 94℃ 에서 30초 변성 60℃ (bar)/65.
PCR, Southern analysis, 효소면역반응 분석 등을 통해 유전자 도입여부를 확인하였다.
PCR, Southern 분석, 효소면역반응 분석 등을 통해 유전자 도입여부를 확인하였다. PCR을 통한 검정 결과, 선발된 감자 식물체 시료 (E3-6)에서 bar와 CP4-EPSPS 유전자 밴드가 관찰되어, 감자 식물체 내에 상기 유전자들이 삽입된 것
Southern 분석: 감자 식물체 잎으로부터 DNeasy Plant Maxi kit (QIAGEN 사)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. Genomic DNA 30 µg씩을 제한효소 EcoRI 및 Hindlll로 절단하여 agarose gel에서 전기 영동을 수행하였다.
감자의 절편체 (잎, 줄기, 엽병)를 일정한 크기로 잘라 전 배양배지 (potato pre-culture media, PPM)에서 24시간 배양한 다음, 상기에서 제조된 Agrobacterium 희석액에 넣어 10분간 감염시켰다. 그 후, 이를 멸균된 여과지에서 10분간 건조시키고, 건조된 절편을 공배양 배지 (potato co-culture media, PCM)에서 48시간동안 암배양한 후 선발 배지 (potato selection media, PSM)에 옮겨 재분화 선발을 통해 신초를 유기하였다.
상기의 프라이머와 합성 cDNA를 사용하여 94 ℃ 에서 1분 52℃ 에서 1분, 72℃ 에서 2분의 1사이클의 PCR을 30회 수행하여 CP4-EPSPS 유전자를 증폭한 후, 공급자가 제공하는 프로토콜에 따라 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T Easy에 클로닝 하였다. 그 후 얻어진 CP4-EPSPS 절편을 CaMV35S 프로모터 하류의 BmHI과 NOS 종결인자 상류의 Sad 위치에 삽입한 후, 이를 bar 유전자가 선발표지로 포함되어 있는 pCAMBIA3300 (Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia)에 도입하여 식물체용 발현벡터를 제작하였다(P35S-EPSPS-B). 이 발현벡터를 An (1987)의방법에 따라 Agrobacterium tumafaciens EHA 105 (Hood et al.
그 후, 이를 멸균된 여과지에서 10분간 건조시키고, 건조된 절편을 공배양 배지 (potato co-culture media, PCM)에서 48시간동안 암배양한 후 선발 배지 (potato selection media, PSM)에 옮겨 재분화 선발을 통해 신초를 유기하였다. 재분화된 신초들을 phosphinothricin (PPT) 5 mg/L 가 각각 포함된 계대배양배지 (sub-culture media, SUM)에 옮겨 생존하는 것들을 선발하였다.
첫 번째 단계는 간이검정법으로서 bar 유전자 활성에 따른 저항성의 경우는 잎의 일부에 glufosinate-ammonium (순도 50% 내외, Bayer CropScience)을 도포처 리하여 세포괴사 여부를, CP4-EPSPS 유전자 활성에 따른 저항성의 경우에는 glyphosate (순도 62%, (주) 경농) 용액에 치상된 잎절편 내의 shikimate 축적여부를 조사하였다. 두 번째 단계에서는 식물체가 정상적 인 생육을 거쳐 일정한 크기에 이르렀을 때 비선택성 제초제를 식물체 전체에 경엽 처리하여 실제 제초제 저항성을 나타내는지를 확인하였다.
5'-AAG GCA TGC AGG CTG TAG CCA-3')> 합성하였다. 또한 유전자 변형 콩인 라운드업-레디 (Roundup- Ready, Monsanto) 콩에서 통상적인 방법으로 총 RNA를 분리하고, 이로부터 역전사효소를 이용하여 cDNA를 제조하였다. 상기의 프라이머와 합성 cDNA를 사용하여 94 ℃ 에서 1분 52℃ 에서 1분, 72℃ 에서 2분의 1사이클의 PCR을 30회 수행하여 CP4-EPSPS 유전자를 증폭한 후, 공급자가 제공하는 프로토콜에 따라 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T Easy에 클로닝 하였다.
또한 유전자 변형 콩인 라운드업-레디 (Roundup- Ready, Monsanto) 콩에서 통상적인 방법으로 총 RNA를 분리하고, 이로부터 역전사효소를 이용하여 cDNA를 제조하였다. 상기의 프라이머와 합성 cDNA를 사용하여 94 ℃ 에서 1분 52℃ 에서 1분, 72℃ 에서 2분의 1사이클의 PCR을 30회 수행하여 CP4-EPSPS 유전자를 증폭한 후, 공급자가 제공하는 프로토콜에 따라 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T Easy에 클로닝 하였다. 그 후 얻어진 CP4-EPSPS 절편을 CaMV35S 프로모터 하류의 BmHI과 NOS 종결인자 상류의 Sad 위치에 삽입한 후, 이를 bar 유전자가 선발표지로 포함되어 있는 pCAMBIA3300 (Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia)에 도입하여 식물체용 발현벡터를 제작하였다(P35S-EPSPS-B).
잎의 약 Icm?에 10 µℓ씩 도포 처리한 후 세포 괴사 여부를 육안으로 확인하였다. 한편, CP4-EPSPS 유전자 활성에 따른 저항성 간이검정으로서는 glyphosate 용액에 치상한 식물체 조직의 shikimate 축적 여부를 조사하였다 (Kim et al.
Genomic DNA 30 µg씩을 제한효소 EcoRI 및 Hindlll로 절단하여 agarose gel에서 전기 영동을 수행하였다. 이를 Zeta Probe membrane (Bio-Rad 사)으로 전달한 후 32P로 표지한 유전자 단편을 탐침으로 이용하여 혼성화(hybridization) 반응을 수행하였다. 혼성화 반응이 종료된 후 membrane을 세척하고, X-선 필름에 노출시켜 밴드를 확인하였다.
제초제가 처리된 감자 식물체를 온실조건에 옮겨, 처리 후 2일째와 7일째에 잎의 엽록소 함량 변화와 광계 Ⅱ의 광량자 수율 변화를 측정하여 제초활성 반응을 조사하였다. 잎의 엽록소 함량은 엽록소계 (SPAD 502, Minolta, Japan)를 이용하여 비파괴적으로 조사하였으며, 광량자 수율값 (quantum yield, Fv/Fm)은 펄스 진폭 변조 형광계 (Pulse Amplitude Modulation Fluorometer; PAM 2000, Walz, Germany)를 이용하여 조사하였다 (Schreiber et al. 1996).
그 후, 이를 멸균된 여과지에서 10분간 건조시키고, 건조된 절편을 공배양 배지 (potato co-culture media, PCM)에서 48시간동안 암배양한 후 선발 배지 (potato selection media, PSM)에 옮겨 재분화 선발을 통해 신초를 유기하였다. 재분화된 신초들을 phosphinothricin (PPT) 5 mg/L 가 각각 포함된 계대배양배지 (sub-culture media, SUM)에 옮겨 생존하는 것들을 선발하였다. 선발된 신초들은 호르몬이 없이 carbenicillin 500 mg/L가 포함된 기본 MS 고체배지 (PRMM 배지)에서 발근시켰다.
전식물체 경엽처리에 의한 제초제 저항성 검정: Glyphosate 와 glufosinate-ammonium 각각의 용액 또는 이들의 혼합물을 감자 성체식물에 처리한 후 2일째와 7일째에 잎의 엽록소 함량 변화와 광계 Ⅱ의 광량자 수율 변화를 측정하여 제초 활성 반응을 조사하였다. 그 결과, 비형질전환체에 glufosinate-ammonium을 단독처 리한 경우, 처리 후 2일째에 괴사 증상이 나타나기 시작하였고, 이때 광량자 수율값은 무처리구의 41% 수준이었지만 엽록소 함량에서는 차이가 관찰되지 않았다.
전식물체 경엽처리에 의한 제초제 저항성 검정: 기내에서 번식 중인 발근된 식물체를 부농상토 5호가 담긴 직경 13 cm, 높이 12 cm의 원형 폿트에 이식하여 순화시킨 다음, 온실 (주간 25℃ 내외/야간 20℃ 내외)에서 2개월간 생장시켰다 (지상부가 20-30 cm 정도 자람). Glyphosate와 glufosinate-ammonium 원제를 0.
1% Tween 20 + 43% acetone 용액에 각각 750 figM 및 500 µg/mℓ 농도로 용해시킨 후 이들을 각각 단독으로 또는 혼합하여 감자 식물체의 잎에 흠뻑 젖을 정도로 폿트당 50 mℓ씩 살포하였다. 제초제가 처리된 감자 식물체를 온실조건에 옮겨, 처리 후 2일째와 7일째에 잎의 엽록소 함량 변화와 광계 Ⅱ의 광량자 수율 변화를 측정하여 제초활성 반응을 조사하였다. 잎의 엽록소 함량은 엽록소계 (SPAD 502, Minolta, Japan)를 이용하여 비파괴적으로 조사하였으며, 광량자 수율값 (quantum yield, Fv/Fm)은 펄스 진폭 변조 형광계 (Pulse Amplitude Modulation Fluorometer; PAM 2000, Walz, Germany)를 이용하여 조사하였다 (Schreiber et al.
조사하였다. 첫 번째 단계는 간이검정법으로서 bar 유전자 활성에 따른 저항성의 경우는 잎의 일부에 glufosinate-ammonium (순도 50% 내외, Bayer CropScience)을 도포처 리하여 세포괴사 여부를, CP4-EPSPS 유전자 활성에 따른 저항성의 경우에는 glyphosate (순도 62%, (주) 경농) 용액에 치상된 잎절편 내의 shikimate 축적여부를 조사하였다. 두 번째 단계에서는 식물체가 정상적 인 생육을 거쳐 일정한 크기에 이르렀을 때 비선택성 제초제를 식물체 전체에 경엽 처리하여 실제 제초제 저항성을 나타내는지를 확인하였다.
특히 CP4-EPSPS의 경우, 비형질전환 식물체에서도 Southern 분석 에 사용된 CP4-EPSPS 유전자의 일부 절편과 혼성화되는 밴드가 관찰되었는데, 이는 비특이적 결합 혹은 감자의 EPSPS 유전자와 혼성화된 결과로 추정된다. 한편, 효소 면역반응 (ELISA) 검정을 통해 CP4-EPSPS 유전자가 정상적으로 발현되는지를 확인하고자 감자 형 질전환체로부터 단백질을 추출한 후 EPSPS 항체를 이용한 효소면역반응을 실행하였다. PPTr.
대상 데이터
6℃ (CF4-EFSFS)에서 30초 중합 (polymerization) 어닐링 (annealing), 그리고 72℃ 에서 30초씩 35회 신장 반응을 행하고, 72℃ 에서 10분간 추가 신장시켰다. 사용한 효소는 Taq 중합효소 (Takara) 이며 PCR 증폭의 결과는 1.0 % (w/v) agarose gel에서 전기영동으로 확인하였다.
형질전환을 위해 사용한 감자 (Solanum tuberosum) 품종은 국내 신품종인 태동밸리 (Taedong Valley, 품종등재번호 202002000007)와 대조구로 대서 (Atlantic)를 이용하였다. Agrobacterium tumafaciens EHA 105/p35E-Bar의 단일 콜로니를 취하여 kanamycin 50 mg/L이 첨가된 LB배지에 접종하고 이것을 28 ℃ 교반배양기에서 180 rpm의 속도로 하룻밤 배양하여 균농도가 600 nm에서의 흡광도 0.
이론/모형
그 후 얻어진 CP4-EPSPS 절편을 CaMV35S 프로모터 하류의 BmHI과 NOS 종결인자 상류의 Sad 위치에 삽입한 후, 이를 bar 유전자가 선발표지로 포함되어 있는 pCAMBIA3300 (Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia)에 도입하여 식물체용 발현벡터를 제작하였다(P35S-EPSPS-B). 이 발현벡터를 An (1987)의방법에 따라 Agrobacterium tumafaciens EHA 105 (Hood et al. 1993) 에 도입하였다.
효소면역반응 (ELISA) 검정: EPSPS를 검출하기 위하여 Agdia PSP 74000/0096 PathoScreen Kit을 사용하여 ELISA-DAS 방법 (Clark and Adams 1977)으로 조사하였다.
성능/효과
태동밸리와 대서 두 품종의 기내 배양된 식물체로부터 잎, 줄기, 엽병의 절편체를 채취한 후 이들을 각각 bar와 CP4-EPSPS 유전자가 포함된, 4grobacferi"m과 공동배양한 결과, PPT 0.5 mg/L이 첨가된 PSM 배지에서 10일 후부터 절편체의 절단면에서 캘러스가 형성되기 시작하였으며 약 6-8 주 후에 신초가 발생하기 시작하였다. 1차 선발배지에서 유기된 여러 신초들을 PPT 5 mg/L이 첨가된 SUM 배지로 옮긴 후 형질전환식물체를 선발하였다.
PPTr.EPSPS vector를 사용하여 형질전환된 E3-6 linee negative의 흡광도 (0.039)의 34배에 해당하는 흡광도 (1.332)를 나타내었고 positive (1.230) 흡광도보다는 높은 흡광도를 보여 E3-6은 형질전환체로 판단하는 동시에 매우 높은 단백질 발현양을 알 수 있었다 (Figure 4).
반응을 조사하였다. 그 결과, 비형질전환체에 glufosinate-ammonium을 단독처 리한 경우, 처리 후 2일째에 괴사 증상이 나타나기 시작하였고, 이때 광량자 수율값은 무처리구의 41% 수준이었지만 엽록소 함량에서는 차이가 관찰되지 않았다. 3일째에는 잎이 마르기 시작하여 5일째에 거의 고사되었으며, 처리 후 7일째에는 엽록소 함량과 광량자 수율 모두 0.
넷째, 본 연구에서 개발된 감자는 항생제 마커프리이기 때문에 항생제 내성 확산 문제에서 벗어날 수 있다. 다섯째, 본 연구에서의 태동벨리 감자는 우수 품질의 가공용 감자이기 때문에 소비량이 많아 농가소득 증대에 보다 크게 기여할 것으로 여겨진다.
첫째, 잡초방제를 위해 선택할 수 있는 약제가 하나에서 두 가지로 확대되기 때문에 잡초방제 체계 (혼합처리 및 체계처리)를 보다 원활하게 세울 수 있고, 서로 다른 특성의 제초제를 사용하게 됨에 따라 잡초방제 효과를 향상시킬 수 있어 궁극적으로 보다 적은 노동력 투입으로 감자 생산성을 높일 수 있을 것이다. 둘째 한가지 비선택성 제초제만 사용할 수 있도록 제작된 감자를 재배할 경우, 제초제를 계속적으로 사용함으로 인해 저항성 잡초의 조기 출현 문제가 발생될 수 있는데 본 발명의 감자는 서로 다른 기작의 제초제를 교대로 처리할 수 있기 때문에 저항성 잡초 조기 출현 문제를 막거나 최소화 시킬 수 있다. 아울러 glyphosate 제초제는 자연계에서 이미 몇몇 저항성 잡초가 발생된 것으로 보고되고 있는 바 (Sandermann 2006), 저항성 잡초 발생이 아직 보고되지 않은 glufosinate-ammonium 을 처리함으로서 이들을 용이하게 방제할 수 있다.
2005). 셋째, 두 약제간 상승효과를 나타내는 제초제를 혼합처리 할 경우, 최종 처리 약량 (제초제 투입량)을 낮출 수 있어 환경부담을 감소시키는 효과를 가진다. (Kim 등 2006) 은 glufosinate-ammonium + glyphosate 혼합처리는 작물의 약해를 줄이면서 광엽잡초를 효과적으로 제거하고자 할 때 사용될 수 있는 합제 조합이라고 보고하였다.
Glyphosate와 glufosinate-ammoniume 혼합 처리한 경우에는 glufosinate-ammonium을 단독처리한 경우와 비슷한 결과를 나타내었다. 이상의 실험결과를 종합해 볼 때, E3-6 형질전환 감자는 두 제초제를 각각 단독으로 처리할 때나 혼합하여 동시 처리할 때에도 동일한 저항성이 나타남을 확인하였다 (Table 5,Figure 5).
제초제 저항성 간이검정: 감자 형질전환체에서의 bar 유전자 활성에 따른 제초제 저항성 여부를 알기 위한 간이검정으로서 glufosinate-ammonium을 여러 농도로 조제하여 순화된 어린 식물체 잎에 도포처리한 결과, 형질전환체는 세포 괴사가 전혀 관찰되지 않았지만 비형질전환체는 황화 증상과 함께 세포괴사가 일어났다. 한편, CP4-EPSPS 유전자 활성에 따른 제초제 저항성 여부를 알기 위한 간이검정으로서 glyphosate 용액에 치상한 식물체 조직의 shikimate 축적 여부를 조사한 결과, 감자 형질전환 식물체에서는 380nm의 흡광도 증가가 관찰되지 않아 glyphosate에 대해 저항성인 것으로 판단되었다 (Table 3).
한편, 비형질전환체에 glyphosate를 단독처리한 경우 처리 후 2일째에는 제초활성이 전혀 나타나지 않아 광량자 수율과 엽록소 함량 공히 무처리구와 차이가 거의 없었다. 처리 후 7일째는 생육억제와 황회증상이 나타났으며 이 때 광량자 수율은 0.647 Fv/Fm로서 무처 리구의 82.9% 수준이었고, 엽록소 함량은 무처리구의 52.7% 수준을 보였다. 그러나 형질전환체는 약해가 전혀 나타나지 않아 모든 값이 무처 리구와 동일한 수치를 보였다 (Table 4, 5).
형질전환과정 중 신초 유도 선발배지 (PSM)와 발근 유도 선발배지 (PRMM)에서 선발된 개체의 신초발생율과 발근율은 표 2와 같았다. 최종적으로 3개체 중 신초발생과 발근이 가장 좋은 한 개체를 선택하여 이를 E3-6로 명명하였다.
함께 세포괴사가 일어났다. 한편, CP4-EPSPS 유전자 활성에 따른 제초제 저항성 여부를 알기 위한 간이검정으로서 glyphosate 용액에 치상한 식물체 조직의 shikimate 축적 여부를 조사한 결과, 감자 형질전환 식물체에서는 380nm의 흡광도 증가가 관찰되지 않아 glyphosate에 대해 저항성인 것으로 판단되었다 (Table 3).
후속연구
그러나 본 연구의 개발감자 보급에 있어서 부정적인 측면도 예측되는 바, 도입된 두 가지 제초제 저항성 유전자가 까마중, 배풍등과 같은 까마중 속 (Solanum spp.) 잡초로 전이 되어 이중저항성을 가진 잡초가 발생될 염려이다. 그러나 이러한 경우가 발생될 확률은 낮다고 여겨진다.
할지라도 다른 제초제를 사용하여 해당 잡초를 선택적으로 제거할 수 있는 기법의 개발이 가능하다. 따라서 본 연구에서 개발된 감자를 재배할 경우, 손실보다는 이익이 더 클 것으로 여겨지며, 본 형질 전환감자 계통이 실용화되기 위해서는 금후 재배적 특성, 품질 평가, 안정성 평가 등의 추가 연구가 필요하다 하겠다.
식량작물 중의 하나로서 재배되고 있다. 또한, 세계적으로 1980년대 이후부터 많은 기능성 품종들이 생명공학적 방법에 의해 육성되고 있어 이들의 실용화로 향후 감자 재배 면적은 계속 증가될 것으로 예상된다. (Mullins et al.
이들을 지속적으로 재배할 경우 동일 제초제를 연용하게 됨에 따라 특정 제초제의 환경내 축적, 저항성 잡초 조기 출현 등이 우려되며, 제초스펙트럼에서 벗어난 잡초들의 우점화로 잡초방제 효과가 감소될 수 있다. 이러한 상황에 대비하여 새로운 형질전환 작물 개발과 더불어 합리적인 제초체계 확립 연구가 진행되어야 한다.
따라서 이들 감자를 재배하면 다음과 같은 효과를 거둘 수 있다고 여겨진다. 첫째, 잡초방제를 위해 선택할 수 있는 약제가 하나에서 두 가지로 확대되기 때문에 잡초방제 체계 (혼합처리 및 체계처리)를 보다 원활하게 세울 수 있고, 서로 다른 특성의 제초제를 사용하게 됨에 따라 잡초방제 효과를 향상시킬 수 있어 궁극적으로 보다 적은 노동력 투입으로 감자 생산성을 높일 수 있을 것이다. 둘째 한가지 비선택성 제초제만 사용할 수 있도록 제작된 감자를 재배할 경우, 제초제를 계속적으로 사용함으로 인해 저항성 잡초의 조기 출현 문제가 발생될 수 있는데 본 발명의 감자는 서로 다른 기작의 제초제를 교대로 처리할 수 있기 때문에 저항성 잡초 조기 출현 문제를 막거나 최소화 시킬 수 있다.
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