Streptococcus mutans Ingbritt의 비수용성 글루칸을 합성하는 효소인 glucosyltransferase B 및 C의 mRNA 발현에 대한 각 당의 영향을 fluorescent in situ hybridization(FISH) 방법으로 관찰하여 다음의 결과를 얻었다. 1. 1% 설탕이 함유된 BHI 배지에서 S. mutans Ingbritt를 접종하여 배양할 때 배양 9시간 째 gtfB 및 gtfC유전자의 mRNA가 발현이 급격히 증가하였다. 2 BHI 액체배지에 설탕을 첨가한 경우 gtfB및 gtfC유전자의 mRNA가 발현되었으며, 10% 설탕을 첨가한 경우 1%와 5%보다 gtfB 및 gtfC 유전자의 발현이 감소되었다. 3. 1% 설탕이 첨가된 BHI 액체 배지에 당을 첨가한 경우 포도당은 10% 첨가하였을 때 gtfB 및 gtfC 유전자의 mRNA 발현이 감소하였고, 과당의 경우 1% 첨가한 경우 감소하여 5% 와 10%에서는 gtfB및 gtfC 유전자가 거의 발현되지 않았다. 4. 자일리톨의 경우 1%부터 gtfB및 gtfC유전자 mRNA 발현이 대조군보다 감소하였고, 5%와 10%에서는 두 유전자 모두 발현이 현저하게 감소하였다. 5. 유당의 경우 두 유전자의 발현에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었고, 솔비톨의 경우 각 농도에서 두 유전자의 발현이 대조군보다 감소하였다. 결론적으로 비수용성 글루칸 합성하는 gtfB및 gtfC 유전자의 mRNA 발현이 포도당, 과당 자일리톨 첨가에 의해 감소함을 알 수 있었다.
Streptococcus mutans Ingbritt의 비수용성 글루칸을 합성하는 효소인 glucosyltransferase B 및 C의 mRNA 발현에 대한 각 당의 영향을 fluorescent in situ hybridization(FISH) 방법으로 관찰하여 다음의 결과를 얻었다. 1. 1% 설탕이 함유된 BHI 배지에서 S. mutans Ingbritt를 접종하여 배양할 때 배양 9시간 째 gtfB 및 gtfC유전자의 mRNA가 발현이 급격히 증가하였다. 2 BHI 액체배지에 설탕을 첨가한 경우 gtfB및 gtfC유전자의 mRNA가 발현되었으며, 10% 설탕을 첨가한 경우 1%와 5%보다 gtfB 및 gtfC 유전자의 발현이 감소되었다. 3. 1% 설탕이 첨가된 BHI 액체 배지에 당을 첨가한 경우 포도당은 10% 첨가하였을 때 gtfB 및 gtfC 유전자의 mRNA 발현이 감소하였고, 과당의 경우 1% 첨가한 경우 감소하여 5% 와 10%에서는 gtfB및 gtfC 유전자가 거의 발현되지 않았다. 4. 자일리톨의 경우 1%부터 gtfB및 gtfC유전자 mRNA 발현이 대조군보다 감소하였고, 5%와 10%에서는 두 유전자 모두 발현이 현저하게 감소하였다. 5. 유당의 경우 두 유전자의 발현에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었고, 솔비톨의 경우 각 농도에서 두 유전자의 발현이 대조군보다 감소하였다. 결론적으로 비수용성 글루칸 합성하는 gtfB및 gtfC 유전자의 mRNA 발현이 포도당, 과당 자일리톨 첨가에 의해 감소함을 알 수 있었다.
Insoluble glucan is the important component of oral biofilm, which is synthesized from sucrose through the action of glucosyltransferase (GTF) B and GTF C encoded by the gtfB and gtfC genes, respectively of Streptococcus mutans. In present study, the effects of various sugars on the mRNA expression ...
Insoluble glucan is the important component of oral biofilm, which is synthesized from sucrose through the action of glucosyltransferase (GTF) B and GTF C encoded by the gtfB and gtfC genes, respectively of Streptococcus mutans. In present study, the effects of various sugars on the mRNA expression of gtfB and gtfC of S. mutans Ingbritt were examined by fluorescent in situ hybridization (FISH). The mRNA of gtfB and gtfC was expressed normally in the BHI broth containing 1% and 5% sucrose. The mRNA expression was decreased by the addition of 10% of glucose, and 1%, 5% and 10% of fructose. Lactose had no great effect on the expression of gtfB and gtfC. 5% and 10% of xylitol greatly reduced the mRNA expression of gtfB and gtfC. Sorbitol slightly decreased the mRNA expression of gtfB and gtfC when compared to the control. In summary, mRNA expression of gtfB and gtfC was decreased by the addition of glucose, fructose, and xylitol.
Insoluble glucan is the important component of oral biofilm, which is synthesized from sucrose through the action of glucosyltransferase (GTF) B and GTF C encoded by the gtfB and gtfC genes, respectively of Streptococcus mutans. In present study, the effects of various sugars on the mRNA expression of gtfB and gtfC of S. mutans Ingbritt were examined by fluorescent in situ hybridization (FISH). The mRNA of gtfB and gtfC was expressed normally in the BHI broth containing 1% and 5% sucrose. The mRNA expression was decreased by the addition of 10% of glucose, and 1%, 5% and 10% of fructose. Lactose had no great effect on the expression of gtfB and gtfC. 5% and 10% of xylitol greatly reduced the mRNA expression of gtfB and gtfC. Sorbitol slightly decreased the mRNA expression of gtfB and gtfC when compared to the control. In summary, mRNA expression of gtfB and gtfC was decreased by the addition of glucose, fructose, and xylitol.
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제안 방법
mutans 균 내에서의 직접적인 gtfB 및 gtfC 유전자의 발현 변화에 대해서는 보고되지 않고 있다. 따라서, 본 실험에서는 gtfB 및 gtfC 유전자의 5 ' 의 catalytic domain에 상보적인 형광 probe를 사용하여 S. mutans 내에서 gtfB 유전자의 mRNA 발현변화를 fluorescent in situ hybridization (FISH)의 방법으로 관찰하였다.
바이오니아 (Bioneer Co. Korea)에 의뢰하여 S. mutans MT8148의 gtfB (GeneBank Acc. No. D88653) 유전자 및 gtfC 유전자 (GeneBank Acc. No. D88652)의 catalytic domain의 5' 말단부위 의 염 기서 열에 상보적 인 RT-B1117 (5' -cataaggcgt- taatttcccttca-3' ) probe와 RT-C1195 (5' -cctgtgaagt- tagcttgctattg-3') 를 합성한 후 제조된 probe 의 5'말단에 fluorescein isothiocyanate (FITC)를 부착하였다. 제조된 형광 probe는 적정농도로 멸균수에 희석하여 사용하기까지 -70℃에 보관하였다.
1% 자당이 포함된 BHI broth (BHIS)에 S. mutans Ingbritt를 접종한 것을 대조군으로 하고 각 농도의 당이 포함된 BHIS broth에 S. mutans Ingbritt를 접종한 것을 실험군으로 하였다. 37 ℃ 배 양기 에서 9시간 배 양한 후 3배 volume의차가운 4% paraformaldehyde 용액을 첨가하여 4℃에서 16 시간 고정시켰다.
4)으로 3000 rpm에서 10분간 세척한 후 얻은침전물에 동량의 PBS와 에탄올이 혼합된 용액 100 问를 첨가한 후 -20℃에서 1시간 이상 유지하였다. 슬라이드 글라스 위에 20 闻씩 점액하여 37℃에서 2시간 지난 후 50%, 80%, 100% 에탄올에 3분간 담가 탈수시켰다.
슬라이드에 고정된 세포에 闯당 10 ng의 형광 probe가 함유된 hybridization 용액 (0.9 M sodium chloride, 0.01% sodium dodecyl sulfate (SDS), 5 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl (pH 7.2), 35% formamide)을 첨가하여 46℃에서 2시간 반응시킨 후 세척액 (180 mM sodium chloride, 0.01% SDS, 5 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7.2)으로씻고 48℃로 가온한 세척액에 20분간 담그고 멸균수로 씻은 후 건조하여 3 시간 내에 공초점레이저 현미경 confocal laser scanning microscopy (CLSM, Leica, Heidelberg, Germany)를 이용하여 형광강도를 분석하였다.
gtfC 유전자의 mRNA 발현도 유사하였다. 이후 실험에서는 배양시간을 9시간으로 하여 gtfB 및 gtfC 유전자의 mRNA 발현을 관찰하였다.
10% 설탕을 첨가한 경우 gt/B 및 gtfC 유전자의 mRNA 발현이 모두 감소하였다. 이후 실험에서는 BHI에 1% 설탕을 첨가한 후 다른 종류의 당의 농도를 다르게 첨가하면서 gtfB 및 gtfC 유전자의 mRNA 발현을 관찰하였다(Fig. 3)
1% 설탕이 포함된 BHI 액체배지에서 증식한 S. mutans Ingbritt의 gtfB 및 gtfC 유전자의 mRNA 발현에 따른 형 광강도를 대조군으로 하였다. 포도당을 1%와 5% 되게 첨가한 경우 淇缶 및 gtf。유전자의 mRNA 발현에 따른 형광강도가 대조군과 큰 차이를 보이지 않았으나 10% 첨가한 경우 형광강도가 감소되었다(Fix 4).
구별하는 것을 어렵게 한다. 그러나 구강 내 연쇄상구균에서 GTF의 신호부위와 촉매부위에 해당하는 부위의 단백일차 구조의 변화가 보고되었으며그 후 이 부위에 해당하는 약 400bp 정도의 유전자 염기서열이 매우 다양하게 변화됨이 보고되었다m 본 실험은 Fujiwara 등의 보고에 따라 GTF 효소의 촉매부위를 지정하는 gtf 유전자의 5'염기서열에 대한 primer를 합성한 후 구강 내 세균이 쉽게 노출될 수 있는 여러가지 당과 각 당의 농도변화에 따른 S. mutans의 gtfB 및 gtfC 유전자의 발현을 FISH 방법으로 관찰하였다.
Streptococcus mutans Ingbritt의 비수용성 글루칸을 합성하는 효소인 GTFB 및 GTFC의 mRNA 발현에 대한 각 당의 영향을 fluorescent in situ hybridization (FISH) 방법으로 관찰하여 다음의 결과를 얻었다.
대상 데이터
Streptococcus mutans Ingbritt (serotype c)를 brain heart infusion (BHI, Difco, Detroit, MI, USA) broth에 접종하여 37 ℃ 탄산가스 배양기에서 하룻밤 배양한 후 증식한 S. mutans Ingbritt를 동일 배지에 2회 계대 배양하여 활성화시킨 후 사용하였다.
실험에 사용할 설탕, 포도당, 과당, 유당, 자일리톨 및 솔비톨은 Sigma 사에서 구입하여 적정 농도로 제조한 후 0.45 ㎛ 구멍 크기의 여과지 에 멸균한 후 BHI 액체 배지 에 혼합하여 사용하였다.
이론/모형
gtf 유전자의 mRNA에 대한 oligonucleotide probe는 Fujiwara 등”에 의한 보고에 따라 제조되었다. 바이오니아 (Bioneer Co.
성능/효과
S. mutans Ingbritt의 gtfB 유전자가 1% 설탕이 함유된 BHI 배지에서 발현되는 것이 FISH 결과 관찰되었다(Fig. 1). 1% 설탕이 함유된 BHI 배지에 S.
1). 1% 설탕이 함유된 BHI 배지에 S. mutans Ingbritt를 접종하여 6시간, 9시간, 12시간, 24시간 배양한 후 세균을 회수하여 gtfB 유전자의 mRNA 발현을 관찰한 결과 6시간 배양한 경우거의 발현되지 않은 반면 9시간 배양한 경우 급격히 증가하였다(Fig. 2).
1). 1% 설탕이 함유된 BHI 배지에 S. mutans Ingbritt를 접종하여 6시간, 9시간, 12시간, 24시간 배양한 후 세균을 회수하여 gtfB 유전자의 mRNA 발현을 관찰한 결과 6시간 배양한 경우거의 발현되지 않은 반면 9시간 배양한 경우 급격히 증가하였다(Fig. 2).
본 연구에서 1% 설탕을 함유한 BHI 액체배지에 S. mutans 를 접종하여 배양시간에 따른 gtfB 및 gtfC 유전자의 mRNA 발현을 관찰한 결과 9시간 배양했을 때 gtfB 유전자의 mRNA 발현이 급격히 증가하여 24시간째에는 발현이 더 증가하였다. 이는 대수 증식기 (logarithmic growth phase) 말기에 gtfB 유전자의 mRNA 발현이 대수증식기 초기보다 2배 이상 증가한다는 이전의 보고와 일치 한다气 gtfC 유전자의 경우 gt 缶와 유사한 양상을 보였다.
mutans의 부착기전에 비수용성 글루칸이 중요하다는 많은 보고와 연관되는 결과이다'as. 1% 설탕이 함유된 배지에 다른 당을 첨가한 경우 당 종류 및 농도에 따라 gtfB 및 gtfC 유전자의 mRNA 발현이 다르게 나타났다. 포도당의 경우 10%에서 gtfB 및 gt"유전자 발현을 억제하였으나, 과당의 경우 1% 농도에서부터 gtfB 및 gtfC 유전자의 mRNA 발현이 감소하여 5% 와 10%에서는 두 유전자 모두 거의 발현되지 않았다.
자일리톨은 PEP:Cfru-PTS에 의해 세포 내로 운반된 후 xylitol- 5-phosphate 형태로 축적되어 당 대사와 관련한 효소의 활성을 저해한다고 알려져 있으나项, GTFB 및 GTFC 활성에 대한영향은 알려져 있지 않다. 본 실험 결과 자일리톨을 첨가한 경우 1%에서 10% 까지 농도 의존적으로 gtfB 및 gtfC 유전자 발현을 억제하였다. 이 결과는 이전에 보고된 자일리톨의 gtfD mRNA 발현에 대한 효과와 유사하며顶, 자일리톨이 세균 증식과는 별개로 gtfB 및 gtfC 유전자 발현에 직접 영향을 미침으로써 비수용성 글루캔 합성을 감소시킴을 시사한다.
본 실험 결과 자일리톨을 첨가한 경우 1%에서 10% 까지 농도 의존적으로 gtfB 및 gtfC 유전자 발현을 억제하였다. 이 결과는 이전에 보고된 자일리톨의 gtfD mRNA 발현에 대한 효과와 유사하며顶, 자일리톨이 세균 증식과는 별개로 gtfB 및 gtfC 유전자 발현에 직접 영향을 미침으로써 비수용성 글루캔 합성을 감소시킴을 시사한다. 솔비톨은 6 탄당 당알코올로 치아 우식증을 유발하지는 않으나 항우식 및치료효과는 없다고 알려져 있다後>.
솔비톨은 6 탄당 당알코올로 치아 우식증을 유발하지는 않으나 항우식 및치료효과는 없다고 알려져 있다後>. 본 실험에서 솔비톨의 첨가는 두 유전자의 발현을 약간 억제하였으나 대조군과 큰 차이는 없었다. 또 결과에 보고하지는 않았지만 솔비톨은 S.
mutans의 치면 부착에 더 중요한 작용을 하는 것으로 보고되었다꼬). 본 실험에서는 당 첨가에 따른 gtfB 및 gtfC 유전자의 mRNA 발현 양상이 유사한 것으로 관찰되었다. 결론적으로 본 실험을 통해 관찰한 각 당의 淇缶 및 g成:의 유전자 발현에 대한 영향은, 치면 세균막의 성장 및 치아 우식증 조절에 대한 이해를 돕는데 기여할 것으로 생각된다.
1. 1% 설탕이 함유된 BHI 배지에서 S. mutans Ingbritt를접종하여 배양할 때 배양 9시간 째 淇缶 및 gtfC 유전자의 mRNA가 발현이 급격히 증가하였다.
2. BHI 액체배지에 설탕을 첨가한 경우 gtfB 및 gtfC 유전자의 mRNA가 발현되었으며, 10%보다 1%와 5% 설탕을첨 가한 경우 淇缶 및 gtfC 유전자가 잘 발현되었다.
3. 1% 설탕이 첨가된 B印 액체 배지에 당을 첨가한 경우 포도당은 10% 첨가하였을 때 gtfB 및 gtfC 유전자의 mRNA 발현이 감소하였고, 과당의 경우 1% 첨가한 경우부터 감소하여 5% 와 10%에서는 두 유전자가 거의 발현되지 않았다.
4. 유당의 경우 각 농도에서 두 유전자의 mRNA 발현에 따른 형광강도가 대조군보다 약간 감소하였으나 큰 차이는없었으며, 솔비톨의 경우 각 농도에서 두 유전자의 mRNA 발현이 대조군보다 약간 감소되었다.
5. 자일리톨의 경우 5%와 10%에서는 두 유전자 발현이 대조군보다 현저하게 감소하였다.
결론적으로 비수용성 글루칸을 합성하는 gtfB 및 gtfC 유전자의 mRNA 발현이 포도당, 과당, 자일리톨 첨가에 의해 감소함을 알 수 있었다.
후속연구
본 실험에서는 당 첨가에 따른 gtfB 및 gtfC 유전자의 mRNA 발현 양상이 유사한 것으로 관찰되었다. 결론적으로 본 실험을 통해 관찰한 각 당의 淇缶 및 g成:의 유전자 발현에 대한 영향은, 치면 세균막의 성장 및 치아 우식증 조절에 대한 이해를 돕는데 기여할 것으로 생각된다.
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