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문제 정의
- 본 연구는 사상자(Torilis Fructus)의 품질관리 기준을 설정하기 위하여 사상자의 주요성분이며 그 생물학적 활성이 많이 구명되어 있는 guaiane-type sesquiterpene인 torilin을 지표성분으로 선정하고 사상자로부터 분리정제하여, 그 구조를 동정하였다. 또한 사상자에서 torilin의 함량 정량방법을 HPLC법으로 확립하였으며, 이를 통하여 국내에서 유통되는 사상자에 대한 품질관리 기준을 설정하고자 하였다.
- 본 연구는 사상자(Torilis Fructus)의 품질관리 기준을 설정하기 위하여 사상자의 주요성분이며 그 생물학적 활성이 많이 구명되어 있는 guaiane-type sesquiterpene인 torilin을 지표성분으로 선정하고 사상자로부터 분리정제하여, 그 구조를 동정하였다. 또한 사상자에서 torilin의 함량 정량방법을 HPLC법으로 확립하였으며, 이를 통하여 국내에서 유통되는 사상자에 대한 품질관리 기준을 설정하고자 하였다.
제안 방법
- TLC는 precoated silica gel plate(Kieselgel 60F254, Merck, NJ, USA)를 사용하였으며, 컬럼 크로마토그래피를 위한 silica gel 및 ODS gel은 Kieselgel 60 (70-230 mesh, Merck, NJ, USA)과 Lichroprep RP-18(40-63 µm, Merck, NJ, USA)을 사용하였다.
- 각 표준 용액을 10 µl씩 취하여 HPLC의 chromatogram을 얻고 이로부터 평균 면적을 구하였다.
- 각종 NMR은 Varian UNITY 500 Spectrometer로 측정하였으며, chemical shift는 TMS를 표준물질로 하여 δ(ppm)로 나타내었다.
- 이상의 결과와 같이 HPLC을 이용한 분석방법 및 회귀직선방정식을 이용한 torilin의 함량분석을 위한 분석법을 확립하였다. 또한 지표성분의 함량분석을 실시하기 전에 사상자 중 한 시료(SA-18)를 이용하여 확립한 함량분석법을 이용하여 지표성분의 회수율을 측정하기 위해 사상자 시료(5.0 g)에 표준품 torilin을 각각 2.0, 4.0, 8.0 mg/5 g 첨가한 후 70% EtOH로 열수추출하여 HPLC을 이용하여 회수율을 측정하였다. 그 결과 2.
- 사상자 중 지표성분의 함량 분석 − 현재 국내에서 유통되고 있는 사상자 중 한국산 3종과 중국산 15종, 총 18종을 수집하여 70% EtOH로 열수추출한 추출물을 상기에서 확립된 지표성분의 함량분석법을 이용하여 분석하였다.
- 사상자를 70% EtOH로 추출하여 얻은 추출물로부터 silica gel, ODS gel column chromatography 및 HPLC을 실시하여 1종의 주요 화합물을 분리하여 분광학적 분석 및 물리·이화학적 성질을 조사하여 최종적으로 torilin으로 구조 동정 하였으며 함량분석을 위한 최적의 HPLC 조건을 확립하였다.
- 5 g를 얻었다. 이렇게 얻은 n-hexane 분획물을 n-hexane과 EtOAc를 이용하여 silica gel column chromatography (n-hexane : EtOAc=100:0~5:5, v/v)를 수행하여 7개의 분획을 얻고 TLC (전개용매; n-hexane:EtOAc=7:3)로 확인하여 지표성분을 함유하고 있는 hexane:EtOAc=5:1~8:1(v/v) 분획을 감압 농축하여 0.94 g을 얻었다. 이후 ODS column chromatography (40~100% MeOH, v/v)를 실시하여 12개 분획으로 얻고 TLC (전개용매; n-hexane:EtOAc=7:3)로 확인하여 지표성분을 함유하고 있는 60%~80% MeOH 분획을 감압 농축하여 0.
- 0 mg/ml로 하여 stock solution으로 하였다. 이를 일정량씩 취하여 1.0, 0.5, 0.25, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 mg/ml 농도의 표준 용액을 조제하였다. 각 표준 용액을 10 µl씩 취하여 HPLC의 chromatogram을 얻고 이로부터 평균 면적을 구하였다.
- 94 g을 얻었다. 이후 ODS column chromatography (40~100% MeOH, v/v)를 실시하여 12개 분획으로 얻고 TLC (전개용매; n-hexane:EtOAc=7:3)로 확인하여 지표성분을 함유하고 있는 60%~80% MeOH 분획을 감압 농축하여 0.88 g을 얻었다. 최종적으로 HPLC를 실시하여 지표물질(56 mg)을 분리하였다.
- 각 표준 용액을 10 µl씩 취하여 HPLC의 chromatogram을 얻고 이로부터 평균 면적을 구하였다. 희귀직선방정식을 구하기 위한 HPLC는 3회 반복으로 실시하였으며, UV는 230 nm와 254 nm에서 각각 측정하여 peak 면적과 화합물의 양과의 상관관계를 이용하여 정량곡선을 작성하였다. 이때의 HPLC 조건은 다음과 같다.
대상 데이터
- 각종 NMR은 Varian UNITY 500 Spectrometer로 측정하였으며, chemical shift는 TMS를 표준물질로 하여 δ(ppm)로 나타내었다. HPLC는 Hewlett Packard사의 1100 series를 사용하였다. TLC는 precoated silica gel plate(Kieselgel 60F254, Merck, NJ, USA)를 사용하였으며, 컬럼 크로마토그래피를 위한 silica gel 및 ODS gel은 Kieselgel 60 (70-230 mesh, Merck, NJ, USA)과 Lichroprep RP-18(40-63 µm, Merck, NJ, USA)을 사용하였다.
- 사상자(Torilis Fructus)는 중국에서는 벌사상자(Conidium monnieri CUSSON)의 과실을 사용하며, 우리나라와 일본에서는 뱀도랏(Torilis Japonica DC.)의 과실을 사용한다.19) 그러나 현재 우리나라의 시장에 유통되고 있는 사상자는 국산 뿐 만아니라 중국산이 많은 비중을 차지하고 있는 것으로 알려졌으며, 실제로 실험을 위하여 산지별 사상자를 채집함에 있어 대다수가 중국산임을 확인 할 수 있었다.
- 재료 및 시약 − 실험에 사용된 한국산, 중국산 사상자 18종은 금산과 대전 및 서울의 한약재상에서 구입하여 사용하였으며, 본 연구실에서 외형 등 외관에 의하여 확인 하였고, 표본은 KT&G 중앙연구원 건강식품연구소에 보관하고 있다.
성능/효과
- )의 과실을 사용한다.19) 그러나 현재 우리나라의 시장에 유통되고 있는 사상자는 국산 뿐 만아니라 중국산이 많은 비중을 차지하고 있는 것으로 알려졌으며, 실제로 실험을 위하여 산지별 사상자를 채집함에 있어 대다수가 중국산임을 확인 할 수 있었다. 그러므로 국내에 유통되고 있는 사상자의 품질관리 기준의 필요성이 크게 요구되고 있는 실정이다.
- 사상자에서 분리된 지표성분의 동정 − 사상자 70% EtOH 추출물을 n-hexane으로 추출하여 silica gel 및 ODS gel column chromatography를 실시하여 얻은 분획에 대하여 semi-prep. HPLC를 이용하여 UV하에서 98%이상의 순도를 지니는 지표성분을 얻었다. 지표성분은 무색의 oil 형태로 TLC(전개용매; n-hexane:EtOAc=7:3)상에서 0.
- 0 mg/5 g 첨가한 후 70% EtOH로 열수추출하여 HPLC을 이용하여 회수율을 측정하였다. 그 결과 2.0, 4.0 mg/5 g을 첨가한 경우는 44.5, 74.12%로 회수율이 비교적 낮았으나, 8.0 mg/5 g의 농도에서는 95.4%의 높은 회수율을 나타내었다 (Table III).
- 사상자 중 지표성분의 함량 분석 − 현재 국내에서 유통되고 있는 사상자 중 한국산 3종과 중국산 15종, 총 18종을 수집하여 70% EtOH로 열수추출한 추출물을 상기에서 확립된 지표성분의 함량분석법을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 지표성분인 torilin은 한국산 및 중국산 사상자 모두에서 주요 화합물로 존재함을 확인 할 수 있었으며, 다른 성분들의 peak와 양호하게 분리되는 적합한 분석조건임을 알 수 있었다. 또한, 확립된 HPLC 분석조건 하에서 한국산과 중국산의 전반적인 HPLC 경향도 매우 유사하게 나타났다 (Fig.
- 또한 254 nm 분석 시에는 5.311~12.378 mg/g의 범위를 나타내었으며 그 평균값 및 표준편차는 7.052±0.160 mg/g 으로 230 nm 및 254 nm 분석 시 거의 유사한 결과를 나타냈다 (Table IV).
- 또한 7농도의 torilin를 이용하여 HPLC chromatogram을 얻고 이로부터 평균 면적를 구하여 230 nm, 254 nm에서 얻은 회귀 직선방정식은 Y=2982.3X−69.296과 Y=1692.1X−46.009로 나타났으며, R2는 각각 0.9997 및 0.9998로 직선성이 인정되었다 (Fig. 3).
- 이상의 결과로부터 사상자의 품질규격을 평가하는 것은 사상자의 대표적 성분이며 다른 한약재에는 거의 함유되어 있지 않고, 비교적 산지에 따른 표준편차도 적은 torilin을 기준으로 하는 것이 바람직할 것으로 판단된다. 또한 torilin의 UV 최대흡광도 및 정량한계농도 등을 고려할 때 사상자의 함량분석은 230 nm에서 분석하는 것이 타당하며 개체수의 한정을 지니고 있지만 분석한 18종의 시료의 결과로 볼 때 지표성분인 torilin의 함량은 5.0 mg/g 건조중량 (0.5 w/w%) 이상으로 규정하는 것이 바람직할 것으로 사료된다.
- 현재 torilin은 진통소염작용,15) anti-angiogenic activity,16) hepatoprotective activity17) 및 testosterone 5α-reductase inhibitiory activity18)등 많은 연구가 활발히 진행되고 있으며, 사상자의 주요 화합물을 이루고 있어 사상자의 지표성분으로 설정하는 것이 타당하다고 사료되며, 이를 기준으로 사상자의 품질규격을 평가하는 것이 바람직할 것으로 판단된다. 또한, 우리의 실험 결과로 볼 때 사상자의 품질규격을 평가하기 위한 지표성분인 torilin 함량은 5.0 mg/g 건조 중량(0.5 w/w%) 이상으로 규정하는 것이 바람직할 것으로 사료된다.
- 160 mg/g 으로 230 nm 및 254 nm 분석 시 거의 유사한 결과를 나타냈다 (Table IV). 또한, 지표성분인 torilin의 함량은 개체에 따라 약 2배 가량의 차이로 나타났으나, 이러한 차이는 다른 생약제와 마찬가지로 채집 시기 및 재배 산지에 따른 차이일 것으로 사료되며, 시장에 유통되고 있는 한국산과 중국산과의 지표성분의 차이는 크지 않은 것으로 판단된다.
- 5의 Rf값을 나타내었으며, 최대 흡광도는 235 nm를 나타내었다. 분자량을 알아보기 위해 ESI-MS 측정한 결과 m/z 375.6 [M-H]+을 나타내어 분자량이 376임을 알 수 있었다. 또한, 지표성분의 구조를 결정하기 위하여 각종 NMR spectrum을 측정하였으며 그 결과를 Table I에 나타내었다.
- 이상의 결과로부터 사상자의 품질규격을 평가하는 것은 사상자의 대표적 성분이며 다른 한약재에는 거의 함유되어 있지 않고, 비교적 산지에 따른 표준편차도 적은 torilin을 기준으로 하는 것이 바람직할 것으로 판단된다. 또한 torilin의 UV 최대흡광도 및 정량한계농도 등을 고려할 때 사상자의 함량분석은 230 nm에서 분석하는 것이 타당하며 개체수의 한정을 지니고 있지만 분석한 18종의 시료의 결과로 볼 때 지표성분인 torilin의 함량은 5.
- 01 mg/ml 이었다 (Table II). 이상의 결과와 같이 HPLC을 이용한 분석방법 및 회귀직선방정식을 이용한 torilin의 함량분석을 위한 분석법을 확립하였다. 또한 지표성분의 함량분석을 실시하기 전에 사상자 중 한 시료(SA-18)를 이용하여 확립한 함량분석법을 이용하여 지표성분의 회수율을 측정하기 위해 사상자 시료(5.
- 또한, 지표성분의 구조를 결정하기 위하여 각종 NMR spectrum을 측정하였으며 그 결과를 Table I에 나타내었다. 이상의 물리화학적 성질 및 각종 spectral data를 검토하여 분리한 지표성분을 guaien-type sesquiterpene인 torilin으로 추정하고 이미 보고된 문헌과 비교한 결과10,20) 정확히 일치함으로써 분리한 지표성분을 최종적으로 torilin (8,11-dihydroxy-8-ngeloyl11-acetyl-4-guaien-3-one)으로 동정하였다 (Fig. 1).
- 지표물질의 함량분석법 확립 − Torilin을 MeOH에 용해 시킨 후 YMC-A C18 reverse-phase column (YMC-ODS-A, 4.6×250 mm, 5 µl, Japan)에 주입하고, 분리능이 양호한 용매계로 MeOH : H2O 혼합용매 (65 : 35, v/v)를 사용하여 HPLC를 실시한 결과 torilin의 98% 이상의 순도를 나타내었으며 retention time은 23.796 min이었다 (Fig. 2).
- 한국산과 중국산을 포함한 사상자의 지표성분인 torilin 함량은 건물중량 대비 0.5% 이상을 함유하고 있는 것으로 나타났으며, 이를 자세히 살펴보면 230 nm 분석 시 5.402~12.633 mg/g의 범위를 나타내었으며 그 평균값 및 표준편차는 7.167±0.168 mg/g 이었다.
- 3). 한편 0.01, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0 mg/ml의 농도의 표준액을 1일 3회 측정한 일내정밀도 및 1일 1회 3일간 측정한 일간 정밀도는 230 nm 및 254 nm에서 모두 상대표준편차가 10% 이하로 양호한 결과를 얻었으며, 정량한계농도는 모두 0.01 mg/ml 이었다 (Table II). 이상의 결과와 같이 HPLC을 이용한 분석방법 및 회귀직선방정식을 이용한 torilin의 함량분석을 위한 분석법을 확립하였다.
- 사상자를 70% EtOH로 추출하여 얻은 추출물로부터 silica gel, ODS gel column chromatography 및 HPLC을 실시하여 1종의 주요 화합물을 분리하여 분광학적 분석 및 물리·이화학적 성질을 조사하여 최종적으로 torilin으로 구조 동정 하였으며 함량분석을 위한 최적의 HPLC 조건을 확립하였다. 확립된 HPLC 조건을 이용하여 시중에 유통되고 있는 18종의 사상자로부터 torilin의 분석 시 다른 성분들의 peak와 매우 양호하게 분리되었으며, 비교적 산지 및 채집 시기에 따른 torilin의 표준 편차도 적음을 알 수 있었다. 현재 torilin은 진통소염작용,15) anti-angiogenic activity,16) hepatoprotective activity17) 및 testosterone 5α-reductase inhibitiory activity18)등 많은 연구가 활발히 진행되고 있으며, 사상자의 주요 화합물을 이루고 있어 사상자의 지표성분으로 설정하는 것이 타당하다고 사료되며, 이를 기준으로 사상자의 품질규격을 평가하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.
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