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문제 정의
- 예비실험의 결과 melanin 생합성을 저해하는 활성을 가지는 황백의 추출물로 부터 활성 성분을 분리하고, 구조를 규명하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 그 결과, 12종의 화합물을 분리하여 구조를 결정하였고, B-16 mouse melanoma cell lines에서의 melanin 생합성억제효과를 측정하였다.
- 따라서 피부의 melanin 생성을 억제하는 물질의 개발은 종래에 주로 이용되던 tyrosinase 활성 억제 뿐만 아니라 melanocyte에서 종합적으로 melanin 생성을 억제하는 물질의 개발에 초점이 맞추어지고 있다. 이러한 연구 추세에 맞추어 본 연구실에서는 배양된 B-16 mouse melanoma cell lines에서 melanin 생합성을 효과적으로 저해하는 물질을 천연물로부터 개발하고자, 100여 종의 국산 자원식물을 MeOH로 추출하고 이를 유기용매와 물로 분획하여 시료를 조제하고, 각각의 시료에 대하여 배양된 B-16 mouse melanoma cell lines에서의 melanin 생성 저해 활성을 측정하였다.3) 그 결과 비교적 강한 활성을 나타낸 황백(黃柏)으로부터 활성 지향적 분리방법에 의거하여 melanin 생성 저해물질을 분리, 구조를 규명하였다.
제안 방법
- δ 109.7, 120.0, 141.1, 143.2에서 furan ring에 기인하는 네 개의 carbon signal을 관찰 할 수 있었으며 그 밖에 다른 signal들도 문헌7,8)과 비교하여 일치됨을 확인 후 limonin으로 구조를 동정하였다.
- 1. 피부 melanin 생합성을 저해하는 물질을 천연물로부터 개발하고자 황백 MeOH과 MC추출물의 MC분획과 n-BuOH 분획으로부터 melanin 생성 억제물질의 분리를 시도한 결과 12종의 화합물을 분리하였다.
- 1 g)과 Fr. 13-6 (2.7 g)는 reverse phase인 RP-18를 이용하여 이동상을 H₂O:MeOH=5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, MeOH 순으로 유출시켜 compound 10 (200 mg), compound 12 (350 mg)를 분리 정제하였다. n-BuOH 분획 169 g을 silica gel 크로마토그래피를 실시하여 MC에 대한 MeOH의 비율을 증가시켜서 Fr.
- 2. 분리된 12종의 화합물들은 각종 spectral data의 검토 결과 각각 obacunone (1), limonin (2), β-sitosterol (3), bis(2-methylheptyl)phthalate (4), cycloeucalenol (5), berberine (6), palmatine (7), jatrorrhizine (8), syringin (9), umbelliferone (10), rutaecarpine (11) 그리고 scopoletin (12)으로 결정하였다.
- 이러한 연구 추세에 맞추어 본 연구실에서는 배양된 B-16 mouse melanoma cell lines에서 melanin 생합성을 효과적으로 저해하는 물질을 천연물로부터 개발하고자, 100여 종의 국산 자원식물을 MeOH로 추출하고 이를 유기용매와 물로 분획하여 시료를 조제하고, 각각의 시료에 대하여 배양된 B-16 mouse melanoma cell lines에서의 melanin 생성 저해 활성을 측정하였다.3) 그 결과 비교적 강한 활성을 나타낸 황백(黃柏)으로부터 활성 지향적 분리방법에 의거하여 melanin 생성 저해물질을 분리, 구조를 규명하였다.
- Compounds39), 410), 1019,20), 1121), 1222) − 문헌을 참고하여 spectral data와 비교 후 각각 β-sitosterol, bis(2-methylheptyl)phthalate, umbelliferone, rutaecarpine와 scopoletin으로 구조 결정을 하였다.
- 먼저 B-16 mouse melanoma cell lines에서 melanin 생성 억제효과를 강하게 보인 MC분획 519 g 중 136 g을 silica gel 크로마토그래피를 실시하여 다음과 같이 분획하였다. n-Hexane에 대한 EtOAc의 비율을 증가시키면서 elution 하여 16개 분획 (Fr. 1~ Fr. 16)을 얻었다. Fr.
- 예비실험의 결과 melanin 생합성을 저해하는 활성을 가지는 황백의 추출물로 부터 활성 성분을 분리하고, 구조를 규명하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 그 결과, 12종의 화합물을 분리하여 구조를 결정하였고, B-16 mouse melanoma cell lines에서의 melanin 생합성억제효과를 측정하였다. 황백에서 분리된 화합물은 alkaloid류 4종, limonoid류 2종을 포함하여 모두 12종이었으며, 저해율을 %로 표시하였다(Table I).
- 5 N이 되도록 70% perchloric acid를 첨가하고 5분간 얼음물에 방치하였다. 다시 동일하게 원심분리 시킨 후 상등액을 버리고 난 후 0.5 N perchloric acid로 2회 반복 추출하고 cold ethanol/ether (3:1)로 2회 반복 추출한 뒤 ethyl ether로 추출하여 건조시킴으로서 정량을 하였으며, 그 건조물에 1 N NaOH 용액 1 ml를 첨가한 후 5분간 끓는 물에서 처리하여 멜라닌을 녹인 다음 405 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하여 control과 비교하였다.
- 추출물을 증류수에 현탁시키고 동량의 MC를 가하여, 분획깔때기로 MC층과 H₂O층을 분획하는 조작을 수 회 반복 실시한 후 감압 농축하여 519 g의 MC분획을 얻었으며, 동일한 방법으로 169 g의 n-BuOH분획을 얻었다. 먼저 B-16 mouse melanoma cell lines에서 melanin 생성 억제효과를 강하게 보인 MC분획 519 g 중 136 g을 silica gel 크로마토그래피를 실시하여 다음과 같이 분획하였다. n-Hexane에 대한 EtOAc의 비율을 증가시키면서 elution 하여 16개 분획 (Fr.
- 배지를 교환한 후 시험 물질을 첨가하고, IBMX를 100 µM이 되도록 첨가하여 2일간 더 배양한 뒤 배지를 버리고 trypsin-EDTA (0.25/0.02%) 용액 1 ml로 처리한 뒤에 microcentrifuge tube에 옮겨 12,000 rpm으로 5분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 육안으로 control과 비교하였다.
- − 융점은 Fisher-Johns의 Melting Point Apparatus를 사용하여 측정하였으며, 온도는 보정하지 않았다. 선광도는 JASCO의 DIP-1000 (digital polarimeter, Tokyo, Japan)를 사용하였고, 자외선 흡광도 측정은 Pharmacia의 Ultrospec III를 사용하였다. Fraction collector는 Advantec의 SF-160을 사용하였다.
- 즉, B-16 mouse melanoma cell lines을 EMEM (10% feral FCS) 배지를 사용하여 T-75 culture flask에서 confluence가 될 때까지 배양한 후, culture dish에 cell number가 1×106/dish 이상이 되도록 seeding한 후 1일간 더 배양하였다. 시험물질을 working concentration의 100배 이상으로 제조하여 0.5% DMSO 또는 ethanol 등의 용매에 녹인 후 첨가하여 1일간 배양하였다. 배지를 교환한 후 시험 물질을 첨가하고, IBMX를 100 µM이 되도록 첨가하여 2일간 더 배양한 뒤 배지를 버리고 trypsin-EDTA (0.
- 즉, B-16 mouse melanoma cell lines을 EMEM (10% feral FCS) 배지를 사용하여 T-75 culture flask에서 confluence가 될 때까지 배양한 후, culture dish에 cell number가 1×106/dish 이상이 되도록 seeding한 후 1일간 더 배양하였다.
- − 황백 6 kg을 MeOH과 methylene chloride (MC)를 1:1 비율로 섞어서 5일간씩 3회 반복 추출하여, 추출액을 모아 감압 농축한 결과 898 g의 extract를 얻었다. 추출물을 증류수에 현탁시키고 동량의 MC를 가하여, 분획깔때기로 MC층과 H₂O층을 분획하는 조작을 수 회 반복 실시한 후 감압 농축하여 519 g의 MC분획을 얻었으며, 동일한 방법으로 169 g의 n-BuOH분획을 얻었다. 먼저 B-16 mouse melanoma cell lines에서 melanin 생성 억제효과를 강하게 보인 MC분획 519 g 중 136 g을 silica gel 크로마토그래피를 실시하여 다음과 같이 분획하였다.
대상 데이터
- − 황백은 대구시내 약전 골목에서 구입하여 전문가의 확인을 거쳐 사용하였다.
- 발색시약은 vanillin-sufuric acid시액을 사용하였다. B-16 mouse melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성을 평가하는 실험에 사용된 시약 및 기기는 0.5 N hyperchloric acid, cold ethanol ether (3 : 1), 1 N NaOH solution, hemacytometer, microcentrifuge, UV/VIS spectrophotometer, B-16 melanoma cell lines이다. HPLC는 LC-10A (Shimadzu)를 사용하였다.
- 선광도는 JASCO의 DIP-1000 (digital polarimeter, Tokyo, Japan)를 사용하였고, 자외선 흡광도 측정은 Pharmacia의 Ultrospec III를 사용하였다. Fraction collector는 Advantec의 SF-160을 사용하였다. NMR은 Bruker 250 MHz (DMX 250)을 사용하여 측정하였으며, 내부표준물질로는 tetramethylsilane (TMS) 및 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate sodium salt (DSS)를 사용하였고, chemical shit value는 part per million (ppm) 단위로 사용하였다.
- 5 N hyperchloric acid, cold ethanol ether (3 : 1), 1 N NaOH solution, hemacytometer, microcentrifuge, UV/VIS spectrophotometer, B-16 melanoma cell lines이다. HPLC는 LC-10A (Shimadzu)를 사용하였다.
- Fraction collector는 Advantec의 SF-160을 사용하였다. NMR은 Bruker 250 MHz (DMX 250)을 사용하여 측정하였으며, 내부표준물질로는 tetramethylsilane (TMS) 및 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate sodium salt (DSS)를 사용하였고, chemical shit value는 part per million (ppm) 단위로 사용하였다. 추출 및 column chromatography용 용매는 시약용 일급을 사용하였고, TLC plate는 Merck silicagel 60 F254, RP-18 60 F254s를 사용하였다.
- Column chromatography용 silicagel은 Merck의 silicagel (70-230 mesh)를, reverse phase용은 Merck의 Lichroprep® RP-18 (40-63 µm)및 Mitsubishi의 MCI gel CHP20P (75-150 µm)을 사용하셨다. 발색시약은 vanillin-sufuric acid시액을 사용하였다. B-16 mouse melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성을 평가하는 실험에 사용된 시약 및 기기는 0.
- 본 연구에 참여한 오준석, 정희욱, 최은향은 BK21 연구 사업단으로 장학금을 수혜받은 학생임.
성능/효과
- δ 76.6에서는 C-3에 해당되는 hydroxyl group에 인접한 methylene proton signal을 확인함으로서 triterpenoid에 해당되는 cycloeucalenol로 결론짓고, 문헌11-13)에 소개된 spectral data와 비교하여 구조 결정하였으며, 문헌 조사 결과 이 식물에서는 처음으로 분리된 화합물로 확인되었다.
- 13C-NMR spectrum에서는 총 18개의 signal이 관찰되었으며 δ 109.8에서 methylenedioxy carbon에 기인하는 signal이 관찰되었으며, δ 28.2, 57.2에서 C-5, 6에 기인하는 methylene signal이 관찰되며, δ 57.6, 62.5에서 C-10, 9에 기인하는 methoxy signal이, δ 103.6-152.0에서 benzene ring에서 유래된 methine 및 quaternary carbon signal이 확인되었다.
- 13C-NMR spectrum에서는 총 26개의 signal이 관찰되었으며, δ 207.4, 166.9, 166.7에서 C- 7, 3, 16의 ketone group임을 확인 할 수 있었다.
- 1H-NMR spectrum의 δ 1.07, 1.17, 1.18, 1.30에서 나타나는 singlet은 적분치에 따라 12H분의 H-30, 18, 29, 28에 의한 네 개의 methyl group임을 나타내는 proton signal을 확인할 수 있었고, δ 6.30, 7.30, 7.38에서의 singlet은 furan ring에 기인하는 proton을 확인할 수 있었다.
- 1H-NMR spectrum의 δ 1.12, 1.24, 1.46, 1.89에서 나타나는 singlet으로 H-18, 19, 28, 29, 30에서 기인되는 다섯 개의 methyl group을 확인할 수 있었고, δ 6.37, 7.40, 7.43에서의 singlet으로 furan ring에서 기인하는 proton임을 확인할 수 있었다.
- 3. 분리된 화합물 중 cycloeucalenol (5)은 이 식물로부터는 처음 분리되었다.
- 4. 분리된 각 화합물의 B-16 melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성 저해 활성은 berberine (6)과 palmatine (7)이 10 µg/ml의 농도에서 각 각 96%, 90%의 저해율로 높은 활성을 나타내었으며, limonin은 47%의 저해율을 나타내었다.
- 6과 유사한 1H-NMR spectrum 양상을 보였으며, δ 3.87, 3.92, 4.02, 4.14에서 네 개의 singlet이 관찰되었으며, 적분치로서 aromatic methoxyl groups이 네 개 있음을 알 수 있었다.
- 5에서 C-3, 2, 10, 9에 기인하는 methoxy signal이 관찰되었다. 그 밖에 다른 signal들도 문헌14)과 비교하여 일치됨을 확인 후 이상의 결과를 종합하여 protoberberine의 골격에 methoxyl group가 4개 치환된 palmatine으로 구조를 동정하였다.
- 분리된 각 화합물을 배양된 B-16 melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성 저해 활성을 측정한 결과 berberine (6)과 palmatine (7)이 10 µg/ml 농도에서 각 각 96 %, 90 %의 저해율로 높은 억제 활성을 나타내었으며, limonin은 대조 물질인 arbutin보다 약한 활성을 나타내었다.
- 이것은 palmatine의 C-3에 결합되어 있는 methoxy group 대신에 hydroxy group이 치환되어 있음을 알 수 있게 해준다. 이상의 결과로부터 protoberberine의 골격에 methoxyl group 세 개와 hydroxy group 한 개가 치환되어 있고, 그 밖에 다른 signal들도 문헌14,15)과 비교하여 일치됨을 확인 후 jatrorrhizine으로 구조를 동정하였다.
- 그 결과, 12종의 화합물을 분리하여 구조를 결정하였고, B-16 mouse melanoma cell lines에서의 melanin 생합성억제효과를 측정하였다. 황백에서 분리된 화합물은 alkaloid류 4종, limonoid류 2종을 포함하여 모두 12종이었으며, 저해율을 %로 표시하였다(Table I).
후속연구
- 분리된 각 화합물을 배양된 B-16 melanoma cell lines에서의 멜라닌 생성 저해 활성을 측정한 결과 berberine (6)과 palmatine (7)이 10 µg/ml 농도에서 각 각 96 %, 90 %의 저해율로 높은 억제 활성을 나타내었으며, limonin은 대조 물질인 arbutin보다 약한 활성을 나타내었다. Alkaloid가 일반적으로 세포독성을 나타낸다는 보고24,25)가 있는 것을 생각할 때, 이 결과는 melanin 생성 억제 활성을 보인 berberine과 palmatine의 melanoma cell lines에 대한 세포 독성에 대한 결과일 수 도 있다고 판단되며, 향 후 이에 대한 검토가 이루어져야 한다고 생각된다.(Table I.
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