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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 Helicobacter pylorie 대한항균 활성 및 항산화 활성을 탐색하고 항균물질을 개발하기 위한 연구의 일환으로 108종의 뽕잎로부터 Helicobacter pylorie 대한저해 정도를 측정하고, 항산화 효과도 살펴보았다.
제안 방법
- Helicobacter pylorie 대한항균 활성이 강한 뿡잎 추출물의 페놀성물질 함량 측정. 페놀화합물은 phenolic hydroxyl기를 가지기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 결합하는 성질을 가지며, 항산화 효과 및 항균 작용 등의 생리활성 기능을 가지는 것으로 알려져 있어:" Helicobacter pylorie 대한항균 활성이 강한 뽕잎 추출물을 선별하여 추출물에 함유된 페놀성 화합물의 함량을 조사하였다. 물 추출물과 80% ethanol 추출물로 측정한 phenol 함량 측정 결과는 Table 7에서 보는 바와 같이 Helicobacter pylorie 대한항균 활성을 가지는 대부분의 뽕잎 추출물의 phenol 함량이 물 추출물보다 80% ethanol 추출물에서 다소 높게 나타났다.
- ABTS radical cation decolorization의 측정. 추출물들의 상대적인 항산화 즉정은 hydrogen-donating antioxidant와 chain breacking antioxidant 모두를 측정할 수 있고 aqueous phase와 organic phase 모두에 적용이 가능하며 표준물질의 사용으루 추줄물의 상대 비교가 7) 능하도록 potassium per sulfhte와의 반응에 의해 생성된 ABTS+ free radical0] 추출물 속의 항산화물질 에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용하여 측정하였다.
- Helicobacter pylorie 대한항균 활성이 강한 뿡잎 추출물의 페놀성물질 함량 측정. 페놀화합물은 phenolic hydroxyl기를 가지기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 결합하는 성질을 가지며, 항산화 효과 및 항균 작용 등의 생리활성 기능을 가지는 것으로 알려져 있어:" Helicobacter pylorie 대한항균 활성이 강한 뽕잎 추출물을 선별하여 추출물에 함유된 페놀성 화합물의 함량을 조사하였다.
- 실험에 사용한 균주는 위, 십이지장궤양 원인균인 Helicobacter /Z로서 표준균 주인 ATCC 43504, originated from human gastric samples를 사용하였다. Helicobacter pylorie] 배양에는 최적 배지 (special peptone 0.5 g, agar 0.75 g, NaCl 0.25 응, yeast extract 0.25 g, beef extract 0.2 g 및 pyruvic acid 0.025 g)를 사용하여 미호기성 조건을 유지시켜주기 위해서 10% CO2 incubator를 이용하였으며, incubator의 습도는 항상 95% 이상으로 유지하였으며, agar plate상에서 배양은 37C로 48~72시간 동안 실시하였다.2
- 추출물의 제조.물 추출물은 뽕잎 시료에 20배의 물과 혼합(w/v)하고, ethanol 추출물은 시료에 20배의 80% ethanol을 가하여 homogeniger로 각각 20, 000 rpm에서 1분간 균질화시킨 후 24시간 동안 교반 추출하였으며, 추출액은 Whatman No. 1 filter paper로 여과한 후 필요에 따라 rotary vacuum evaporator (Eyela NE, Japan)에서 200 μg/mZ의 농 도가 되게 농축하여 추출물 시료로 사용하였다.
- Disc agar dision법은 Helicobacter pylori 최적 배지 plate에 Helicobacter pylori규 100 p. 분주하여멸균 유리봉으로도말한 다음, 멸균된 disc paper(<|> 8 mm) 를 올리고 0.45 |im membrane Hlter로 제균한 각 추출물을 vacuum evaporator로 농축한 후 멸균수로 희석하여 phenol 함량^ 50-200 ng/100 |가되도록 조절한 후각 추출물 100 |1> disc paper에 흡수시키고, 대조구로는 멸균수를 흡수시킨 후 37℃의미 호기 성 조건에서 48시간 동안 incubation한 다음, disc 주위의 clear zone 생성 유무를 확인하였다.
- ABTS radical cation decolorization의 측정. 추출물들의 상대적인 항산화 즉정은 hydrogen-donating antioxidant와 chain breacking antioxidant 모두를 측정할 수 있고 aqueous phase와 organic phase 모두에 적용이 가능하며 표준물질의 사용으루 추줄물의 상대 비교가 7) 능하도록 potassium per sulfhte와의 반응에 의해 생성된 ABTS+ free radical0] 추출물 속의 항산화물질 에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용하여 측정하였다. 그 결과 Table 3, 4와 같이 물 추출물에서 당상 2호, 다께다도 몬지가, 80% ethanol 추출물에서 시상 5호, 백해대엽, 수광, 백아십 문자, 적목 등이 60% 미만의 낮은 친수성 및 lipophilc 물질의 항산화력을 나타내었으나 이를 제외한 대부분의 뽕잎 품종은 90% 이상의 높은 저해력을 나타내어 항산화력은 매우 우수하였다.
대상 데이터
- 시료.본 실험에서 사용된 108 종류의 뽕나무 잎은 경북 상주시 소재의 잠사곤충 시험장의 표본묘목에서 채취하여 4℃에서 저온저장하면서 이용하였다(Table 1, 2).
- Helicobacter pylori 배양. 실험에 사용한 균주는 위, 십이지장궤양 원인균인 Helicobacter /Z로서 표준균 주인 ATCC 43504, originated from human gastric samples를 사용하였다. Helicobacter pylorie] 배양에는 최적 배지 (special peptone 0.
이론/모형
- ABTS radical cation decolorization의 측^. ABTS radical cation decolorization의 측정은 Pellegrin 등의 방법 의해 측정하였다.즉, 7mM ABTS[22'-azinobis(3-ethyl benzothiazoline- 6-sulfbnic acid)] 5 ml를 혼합한 ABTS용액 1 m/와 시료용액 50 I”를 혼합하여 30초간 진탕한 후 2.
- 전자공여능(Electron donating ability) 측정. DPPH radical 에 대한 소거 활성은 Blois의 방법 2에 준하여 측정하였다. 각 시료 0.
- Antioxidant Protection Factor(PF) 측정. PF는 Andarwulan 과 Shetty의 방법”)으로 측정하였다. 10mg의 p-carotene/50ml chloroform 용액 1 ml를 evaporator®- 수기에 넣고 40℃ water bath에서 chlorofbmr을 증류시킨 후 20 g/ linoleic acid, 184 \il Tween 40과 50 m/ H2O2를 가하여 emulsion을 만들고, 5 m/의 emulsion에 시료용액 100를 혼합하여 vortex로 잘 섞어준 뒤 5(TC에서 30분간 반응시켜 냉각시킨 다음, 470nm 에서 흡광도를 측정하였다.
- Thiobarbituric acid reactive substances(TBARS) 측정.TBARS는 Burge와 Aust의 방법 끄에 따라 측정하였다. 1% linoleic acid와 1% Tween 4Q으로 emulsion을 만들고 emulsion 0.
- 총 페놀 함량의 측정. 총 페놀 함량은 Folin-Denis 방법®으 로 측정하였으며, 뽕잎 추출물 Im 95% ethanol 1 m/와 증류수 5 ml를 가한 액에 1 N Folin-ciocalteu reagent 0.5 m/을 가하고 5분간 정치시킨 후 Im/의 5% Na2CO3 용액을 가하였다. 이 혼합액을 1시간 동안 정치한 다음 분광광도계(UV/Vis Spectrophotometer, Jasco, Japan)를 사용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 추출물의 Helicobacter pylon 항균 활성 검색* Helicobacter pylori6^ 대한주줄물의 항균 활성 검색은 disc agar diffiision method로 실시하였다. Disc agar dision법은 Helicobacter pylori 최적 배지 plate에 Helicobacter pylori규 100 p.
- 전자공여능은 시료의 flavonoids 및 phenol 성물질 등에 대한 항산화 작용의 지표3라 할 수 있다. 항산화활성 중 oxidative free radical 반응을 이용한 환원성 물질의 분석 시약인 l-l-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)는 아스코르빈산, 토코페롤, polyhydroxy 방향 족 화합물, 방향족 아민류에 의해 환원되어짙은 자색이탈색되는 DPPH법으로 측정하였다. 그 결과 Table 3, 4와 같이 청올뽕 품종의 뽕잎이 55.
성능/효과
- pyl아을 저해하는 물질을 탐색한 결과 Table 5, 6과 같이 감락상, 다호조생, 신일뽕, 국상 27호, 개량 십문자, 국부, 수중상, 백광6호, 이상, 사천금, 영변 추우, 사. 175, 당상 2호, 청목노상으로 14품종의 뽕잎에서 저해환을 나타냈으며, 그 중 물 추출물에서는 다호조생 품종이 지름 13 mm의 저해환을 알코올 추출물에서는 청목노 상 품종이 지름 15 mm의 저해환으로 효과가 가장 우수하였다(Fig. 1). Helicobacter pylorie 대한항균 활성은 주로 ethanol 추출물에서 검출되었으며, 뽕잎의 품종별로 억제 효과는 다양한 것으로 나타났다.
- Helicobacter pylorie 대한항균 활성은 주로 ethanol 추출물에서 검출되었으며, 뽕잎의 품종별로 억제 효과는 다양한 것으로 나타났다. Diker와 Hascelik2**)는 차 추출물로부터 균주 별로 15 mm 내외의 clear zone을 얻은 것으로 보고하여, 본 연구에 사용된 청목 노상종의 뽕잎과 Helicobacter pylori 에 대한 억제 효과가 비슷하다는 것을 알 수 있었다. 뽕잎의 경우 타 식물에 비해 재배가 용이하고 단위 면적당 원료 생산량이 뛰어나 산업화에 적용시키기에 좋을 것으로 판단되었다.
- 1). Helicobacter pylorie 대한항균 활성은 주로 ethanol 추출물에서 검출되었으며, 뽕잎의 품종별로 억제 효과는 다양한 것으로 나타났다. Diker와 Hascelik2**)는 차 추출물로부터 균주 별로 15 mm 내외의 clear zone을 얻은 것으로 보고하여, 본 연구에 사용된 청목 노상종의 뽕잎과 Helicobacter pylori 에 대한 억제 효과가 비슷하다는 것을 알 수 있었다.
- 이러한 P- carotene을 linoleic acid emulsion에 첨가하여 한약재 주출물들의 지용성 물질에 대한 항산화력을 측정한 결과 Table 3, 4와 같이 청올뽕, 고수9, 금상, 사원뽕, 와룡, 수봉뽕, 검설뽕, 청운뽕, 대륙뽕, 하수상품종을 제외한 나머지 대부분의 뽕잎 품종은 높은 antioxidant protection factor(PF)를 나타내었다. PF의 경우 일반적으로 1.2 PF를 기준으로 그 이상의 경우 지용성 물질에 대한 항산화력이 높다고 판단할 수 있으나 본 연구에 이용된 뽕잎 추출물의 PF는 최고 3.08 PF를 나타내어 지용성 물 질에 대한 항산화력은 대단히 우수하다고 판단되었다. 그러나 품종 간 격차는 매우 크게 나타났다.
- 추출물들의 상대적인 항산화 즉정은 hydrogen-donating antioxidant와 chain breacking antioxidant 모두를 측정할 수 있고 aqueous phase와 organic phase 모두에 적용이 가능하며 표준물질의 사용으루 추줄물의 상대 비교가 7) 능하도록 potassium per sulfhte와의 반응에 의해 생성된 ABTS+ free radical0] 추출물 속의 항산화물질 에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는 것을 이용하여 측정하였다. 그 결과 Table 3, 4와 같이 물 추출물에서 당상 2호, 다께다도 몬지가, 80% ethanol 추출물에서 시상 5호, 백해대엽, 수광, 백아십 문자, 적목 등이 60% 미만의 낮은 친수성 및 lipophilc 물질의 항산화력을 나타내었으나 이를 제외한 대부분의 뽕잎 품종은 90% 이상의 높은 저해력을 나타내어 항산화력은 매우 우수하였다. Kim 등은 예루살렘 세이지 의 물추출물에서 97.
- 항산화활성 중 oxidative free radical 반응을 이용한 환원성 물질의 분석 시약인 l-l-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)는 아스코르빈산, 토코페롤, polyhydroxy 방향 족 화합물, 방향족 아민류에 의해 환원되어짙은 자색이탈색되는 DPPH법으로 측정하였다. 그 결과 Table 3, 4와 같이 청올뽕 품종의 뽕잎이 55.2%의 낮은 전자공여능을 나타내었으며 이외의 다른 대부분의 품종은 물과 80% ethanol 추출물에서 80% 이상의 높은 전자공여능을 나타내었다. Kim 등 26)은 국내산 생약 추출물의 전자공여능에 관한 연구보고에서 목단, 황금, 산수유, 작약 등이 100 ppm의 농도에서 각각 65, 57.
- 페놀화합물은 phenolic hydroxyl기를 가지기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 결합하는 성질을 가지며, 항산화 효과 및 항균 작용 등의 생리활성 기능을 가지는 것으로 알려져 있어:" Helicobacter pylorie 대한항균 활성이 강한 뽕잎 추출물을 선별하여 추출물에 함유된 페놀성 화합물의 함량을 조사하였다. 물 추출물과 80% ethanol 추출물로 측정한 phenol 함량 측정 결과는 Table 7에서 보는 바와 같이 Helicobacter pylorie 대한항균 활성을 가지는 대부분의 뽕잎 추출물의 phenol 함량이 물 추출물보다 80% ethanol 추출물에서 다소 높게 나타났다. Clear zone이 13 mm 이상 확인된 뽕잎 추출물들은 대부분이 15mg/g 이상의 비교적 높은 함량의 phenol 함량을 나타내었다.
- 여러 유리기 중에서 TBARS는 유리기에 의한 지질 손상의 지표로 가장 많이 이용되고 있다. 뽕잎 추출물들의 TBARS를 측정한 결과 Table 3, 4와 같이 신일뽕, 양면상, 수원뽕, 도내, 당상, 축무, 홍올뽕, 수계뽕, 상일뽕, 백아십 문자, 불전2호, 오노다마구와, 야마나 까다스께 품종만이 대조구에 비해 TBARS값이 차이가 나지 않아 산화촉진 인자를 binding 하는 능력이 낮은 것으로 나타났으며, 이들 품종을 제외한 다른 대부분의 품종들이 대조구에 비해 낮은 TBARS값을 내어 산화촉진 인자를 binding 하는 능력이 높음을 알 수 있었으며, 물 추출물보다 80% ethanol 추출물이 더 낮은 TBARS값을 나타내어 유기용매에 의한 뽕잎 추출물의 항산화 효과가 열수 추출물에 비해 우수하다고 판단되었다.
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