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문제 정의
- 따라서 본 연구는 장기간 규칙적인 지구성 운동이 고혈압에 의한 병리학적 심장비대 발생 효과기전을 개선시킬 수 있는지 분자표현형 수준에서 구명하기 위해 본태성 고혈압 쥐를 이용하여 장기간 규칙적인 저강도 트레드밀 운동을 실시한 후 안정시 심박수, 혈압, 혈역학 변인(hemodynamic pa- rameter)과 심장근과 골격근의 eNOS, ET-1 m RNA 및 골격근의 eNOS 단백질 발현수준의 차이를 보고자 한다.
제안 방법
- 12주간 운동을 수행한 후 pentobarbital Sodium(50 mg/ kg)을 복강 내 주입시켜 마취시킨 후 심장근과 양쪽 하퇴에서 가자미근, 비복근, 장지신근을 분리하였다. 조직(0.
- 8%—10% separating gel(30% acrylamide: bisacrylamide, 1.5M tris pH8.8, 10% SDS, TEMED, 10% ammonium persulfate) 3}- 5% stacking gel (30% acrylamide: bisacryl amide, l.M tris pH6.8, 10% SDSZ TEMED, 10% ammonium persul- fate)을 만들어 사용하였고, 원심분리 (15,000 rpmz 20 min) 한상층 액과 SDS loading buffer(60 mM tris pH6.8, 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% Bromophenol Blue)를 잘 혼합한 후 100℃에서 10분간 끓여 단백질을 변성시켰다. 이를 식힌 다음 15,000 rpm으로 20분간 4℃에서 원심분리하고 standard marker(SDS-PAGE Molecular Weight Standards, BioRad) 와 함께 각 샘플을 Mini-Protein H dual-slab apparatus(Bio-Rad)에 분주된 stacking gel well에 같은 총 단백질량이 200 이 되도록 분주한후 80volt에서 2시간 정도 샘플이 바닥에 닿을 때까지 전기 영동하였다.
- eNOS 와 ET-1 을 조사하기 위해 RT product와 함께 eNOS mRNA (5' primer : 669-688 base, 3' primer : 829-848 base, AJ_ 249546), ET-1 mRNA(5'primer : 224-243 base, 3' primer : 667-710 base, NM_ 254)를 활용하였다. PCR 기계 (Flexigene, Techne, USA) 에서 28 cycles 로 eNOS mRNA를 위해서는 94℃ 3분(predenaturation), 94℃ 15초(denatura- tion), 53℃ 15초(annealing), 72℃ 30초(elongation), 72℃ 7분 (post- elongation) 간 합성하였다. ET-1 mNA를 위해서는 94℃ 3분(predenaturation), 94℃ 30초(denaturation), 70℃ 15초(annealing), 72℃ 45초(elongation), 72℃ 7분(post-elon- gation)간 합성하였다.
- Rodent 트레드밀 (Myung-Jin Co, Korea) 을 활용하여 트레드밀 런닝의 사전 적응훈련(18 m/min)을 7일간 10분 동안 수행시켰으며, 본 운동에서는 Arakawa가 제시한 트레드밀 운동 방법을 수정하여 12주 동안 주 5일, 1일 60분씩 0% 경사도에서 20 m/min 속도로 훈련시켰다[2].
- Transfer buffer (190 mM glycine, 50 mM Tris-base, 0.05% SDS, 20% methanol) 에 적신 PVDF membrane Millipore), Whatman 3M paper, 전기영동한 젤, ECL membrane (Amersham), Whatman 3M paper, PVDF membrane (Millipore)을 차례로 겹 쳐 Mini trans-blot module(Bio Rad) 에 장치한 후 40 volt로 2시간 전사하였다. Membrane으로 증착이 끝나면 rocker platform위에서 1시간 동안 mem- brane을 3% skim milk 용액(in TNT: 10 mM Tris-base pH 8.
- ET-1 mNA를 위해서는 94℃ 3분(predenaturation), 94℃ 30초(denaturation), 70℃ 15초(annealing), 72℃ 45초(elongation), 72℃ 7분(post-elon- gation)간 합성하였다. 동일한 양의 전체 RNA를 확인하기 위하여 P-actin primer(sense: S'-GAA-GAT-CCT-GAC-CGA- GCG-TG-3'; anti-sense: 5'-CGT-ACT-CCT-GCT-TGC- TGA- TCC3) 를 사용하였다.
- 분리된 RNA 1 을 DEPC 처리된 증류수와 oligo(dT)pri- mer를 첨가하여 RNA 혼합액으로 제조하였다. RNA 혼합액을 70℃에서 10분 동안 Poly-A annealing하였다.
- 수축기 혈압과 확장기 혈압은 tail-cuff pulse detection system(Muromachi MK-1000 model, Muromachi Kikai CO. LTD, Tokyo, Japan)을 활용하여 주 1회 오전 10시 와 오후 2 시 사이 동일한 날짜와 시간대에 acrylic holder를 이용하여 실험 모델 동물들의 몸통을 고정시킨 후 28℃ 온도에서 30분 동안 안정을 취하게 한 후 측정하였다.
- 실험동물의 사육은 1964년 Guiding Principles for the care and Use Az 1에 따라 12시간 간격으로 명암을 유지시켰으며 사육장의 실내온도는 22℃~24℃로 하고 상대 습도는 40%~60%로 유지하였다. 실험동물 사육 기간 동안 고형 쥐 사료와 함께 수돗물만 공급하고 케이지 마다 2마리씩 분산시켜 사육하였다[1].
- 배정하였다. 실험동물의 사육은 1964년 Guiding Principles for the care and Use Az 1에 따라 12시간 간격으로 명암을 유지시켰으며 사육장의 실내온도는 22℃~24℃로 하고 상대 습도는 40%~60%로 유지하였다. 실험동물 사육 기간 동안 고형 쥐 사료와 함께 수돗물만 공급하고 케이지 마다 2마리씩 분산시켜 사육하였다[1].
- 마지막 단계로 ECL substrate 용액(Santacruz, Biotech, USA)에 membrane을 넣고 5 분간 발색시켰다. 얻어진 membrane을 densitometer(Sharp jx-330)를 이용하여 스캔 후 이미지 분석 프로그램(Image Master ver.3.0, Biotech Pharmacia)을 통해 eNOS 단백질량을 산출하였다. 총 단백질량은 BSA (bovine serum albumin, 570 nm)을 이용하여 Bradford(1976)의 방법으로 정 량하였다.
- 분리된 RNA는 DEPC 처리된 물로 녹여서 각각 260 nm에서 흡광도 측정을 위하여 정량하였다. 정량된 RNA을 확인하기 위하여 0.5 ug의 RNA 를 1%의 agarose gel에 전기영동한 후 18s와 28s의 rRNA 밴드를 확인하였다.
- RNA 혼합액을 70℃에서 10분 동안 Poly-A annealing하였다. 증폭을 위한 주형으로 사용될 cDNA는 1 xfirst strand buffer[50 mM Tris-HCL (pH 8.3)z 75 mM KC1, 3 mM MgCk), 10 mM di- thiosphate dNTP)] 와 Super Script n RNaseH-Reverse Transcriptase 200units를 넣어 42℃에서 50분 동안 합성하였고 90℃에서 5분 동안 열처리하여 반응을 종결하였다. eNOS 와 ET-1 을 조사하기 위해 RT product와 함께 eNOS mRNA (5' primer : 669-688 base, 3' primer : 829-848 base, AJ_ 249546), ET-1 mRNA(5'primer : 224-243 base, 3' primer : 667-710 base, NM_ 254)를 활용하였다.
대상 데이터
- 3)z 75 mM KC1, 3 mM MgCk), 10 mM di- thiosphate dNTP)] 와 Super Script n RNaseH-Reverse Transcriptase 200units를 넣어 42℃에서 50분 동안 합성하였고 90℃에서 5분 동안 열처리하여 반응을 종결하였다. eNOS 와 ET-1 을 조사하기 위해 RT product와 함께 eNOS mRNA (5' primer : 669-688 base, 3' primer : 829-848 base, AJ_ 249546), ET-1 mRNA(5'primer : 224-243 base, 3' primer : 667-710 base, NM_ 254)를 활용하였다. PCR 기계 (Flexigene, Techne, USA) 에서 28 cycles 로 eNOS mRNA를 위해서는 94℃ 3분(predenaturation), 94℃ 15초(denatura- tion), 53℃ 15초(annealing), 72℃ 30초(elongation), 72℃ 7분 (post- elongation) 간 합성하였다.
- 이 연구에서 활용한 실험모델동물은 미국 Charles River (Charles River Laboratories, Wilmington, Massachu setts, USA)회사로 부터 구입한 체중이 100 g~115 g인 6주령 된 수컷 본태성 고혈압 쥐(SHR, n=14)와 Wister-Kyoto 쥐(WKY, n=7)로 Wister-Kyoto 쥐를 정상혈압 집단으로 두고 본태성고혈압 쥐 14마리를 각각 비교집단(n=7)과 운동집단(n=7)에 무선 배정하였다. 실험동물의 사육은 1964년 Guiding Principles for the care and Use Az 1에 따라 12시간 간격으로 명암을 유지시켰으며 사육장의 실내온도는 22℃~24℃로 하고 상대 습도는 40%~60%로 유지하였다.
데이터처리
- 이 연구 결과 얻어진 자료를 SPSS/PC+Version 11.0 통계프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치 (mean, SD)를 산출하였다. 집단 간 차이를 알아보기 위해 일원 변량분석(one-way ANOVA)를 이용하여 분석하였고 사후검증은 SNK(Student Newman-Keul)를 적용하였다.
- 0 통계프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치 (mean, SD)를 산출하였다. 집단 간 차이를 알아보기 위해 일원 변량분석(one-way ANOVA)를 이용하여 분석하였고 사후검증은 SNK(Student Newman-Keul)를 적용하였다. 가설의 수락 기준은 a=.
이론/모형
- 1 mM EGTA, Protease inhibitor cocktail tablet]와 함께 얼음에 넣고 균질화 (homegenizer, PYREX Coming, USA) 시킨 후 15,000 rpm으로 10분간, 4℃에서 원심분리 (Model: Mega 17R, Small high speed refrigerated centrifuge, Han-Nil Science) 하여 상층을 분리하였다. 총 단백질량은 BSA (bovine serum albumin, 570 nm) 를 이용하여 Bradford (1976)의 방법으로 정량하였으며 적출된 조직은 -80℃에서 냉동 보관하였다.
- 0, Biotech Pharmacia)을 통해 eNOS 단백질량을 산출하였다. 총 단백질량은 BSA (bovine serum albumin, 570 nm)을 이용하여 Bradford(1976)의 방법으로 정 량하였다.
성능/효과
- 12주간의 저강도 트레드밀 운동은 본태성 고혈압 쥐의 안정 시 심박수와 혈압, LPOA와 호모시스테인 수준의 개선과 함께 심장근의 eNOS mRNA 및 골격근의 sNOS 단백질 발현량을 증가시킨 반면 심근의 ET-1 mRNA 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 결국 운동이 혈압조절뿐만 아니라 고혈압에 의한 심근비대현상 관련 유전자들의 기능개선을 가져와 고혈압을 개선시키는 작용을 한 다는 것을 확인할 수 있었다.
- <Fig. 1>에서 보는 바와 같이, LPOA와 호모시스테인 수준을 살펴보면, LPOA와 호모시스테인 각각 변량 분석한 결과 p<.05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타나 사후 검증한 결과 SHR 비교집단과 WKY 비교집단간에 p<, 05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났으며 SHR 운동집 단과 WKY 비교집단 간에도 ?<-05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났다. 그리고 SHR 비 교집 단과 SHR 운동집 단간에도 p<-05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났다.
- <Fig. 2>에서 보는 바와 같이, 집단별 심장근의 ET-1 mRNA의 발현량을 변량분석 결과, 집단간에 p<.05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타나 사후 검증한 결과, WKY 비교집단과 SHR 비교집단과 p<.05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났으며, WKY 비교집 단과 SHR 운동집단과 p<.05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났으며 SHR 비교집단과 SHR 운동집단 간에도 p<-05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났다.
- 한편 <Fig. 3>에서 보는 바와 같이 골격근 형태별 eNOS 단백질 발현량을 변량분석 결과, 장지신근의 경우 집단간에 p<-05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타나 사후검증한 결과, 비교집단인 WKY와 SHR간에는 p<.05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났으며 WKY 비교집단과 SHR 운동집단에도 p<.05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났다.
- <Fig. 3>에서 보는 바와 같이, 골격근 형태별 eNOS 단백질 발현량을 변량분석 결과, 가자미근과 비복근의 경우 집단 간에 p<.05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타나 사후 검증한 결과, 비교집 단인 WKY와 SHR간에는 p<.05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났다. 그리고 WKY 비교집단과 SHR 운동집단에는 p<.
- 결론적으로 12주간의 규칙적인 저강도 트레드밀 운동은 본태성 고혈압 쥐의 안정 시 심박수, 수축기 . 이완기 혈압감소, hemodynamic parameter의 개선, 그리고 심장근과 골격근 형태별 eNOS의 발현 증가 및 병리학적 심근비대에 관여하는 ET-1 유전자 발현을 감소시켜 고혈압 개선에 효과적으로 작용하는 것으로 나타났다.
- 05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났다. 그리고 WKY 비교집단과 SHR 운동집단에는 p<.05수준에서 차이가 있는 것으로 나타났으며 SHR 비교집단과 SHR 운동집단 간에도 p<.05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났다. 한편 <Fig.
- 본 연구의 주요한 결과는 장기간의 저 강도 트레드밀 운동이 본태성 고혈압 쥐의 안정시 심박수, 수축기와 이완기 혈압 감소는 물론 고혈압에 의한 병리학적 심근비대에 관여하는 조절인자인 심근의 ET-1 감소 및 eNOS mRNA와 골격근의 eNOS 발현이 증가되었다는 것이다.
- 심박 수의 경우 변량 분석한 결과 P<05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타나 사후 검증한 결과 비교집단인 WKY와 SHR 간에 p<.05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났으며 SHR 운동집단과 WKY 비교집단 간에도 p<.05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났고, SHR 운동집단과 SHR 비교집단 간에도 p<.05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났다. <Table 1> 에서 보는 바와 같이, 수축기 이완기 혈압을 살펴보면, 수축기 혈압의 경우 변량 분석한 결과 P<-05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타나 사후 검증한 결과 SHR 비교집단과 WKY 비교집단 간에 p<-05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났으며 SHR 운동집단과 WKY 비 교집단 간에도 p<.
- 05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났다. <Table 1> 에서 보는 바와 같이, 수축기 이완기 혈압을 살펴보면, 수축기 혈압의 경우 변량 분석한 결과 P<-05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타나 사후 검증한 결과 SHR 비교집단과 WKY 비교집단 간에 p<-05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났으며 SHR 운동집단과 WKY 비 교집단 간에도 p<.05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났다. 그리고 SHR 비교집단과 SHR 운동집단 간에도 p<-05 수준에서 차이가 있는 것으로 나타났다.
- 이러한 결과들은 운동에 의한 혈류량 증가 및 골격근과 심혈관계의 NOS up-regulation을 통한 혈관확장 및 혈관내피성장요인 (Vascular endothelial growth factor; VEGF) 의 분비 증가는 eNOS를 활성화시켜 NO의 생성을 증가에 기인한다고 볼 수 있다[3, 22]. 이 연구에서 심장근 뿐만 아니라 골격근에서의 eNOS 단백질의 발현증가 현상은 고혈압 개선효과에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 생각된다.
- 이 연구에서는 SHR 운동집단의 심근 eNOS mRNA 수준과 가자미근과 비복근의 eNOS 단백질 수준이 다른 두 집단에 비교했을 때 유의한 수준에서 높게 나타났다. 장지신근의 eNOS 단백질 수준은 SHR 운동집단과 WKY집단 과 유의한 차이를 보여 eNOS의 발현이 골격근 형태별로 차이를 나타낸다는 선행연구 결과와 일치하는 결과를 얻었다.
- 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 결국 운동이 혈압조절뿐만 아니라 고혈압에 의한 심근비대현상 관련 유전자들의 기능개선을 가져와 고혈압을 개선시키는 작용을 한 다는 것을 확인할 수 있었다.
- 고혈압 쥐의 안정 시 심박수, 수축기 . 이완기 혈압감소, hemodynamic parameter의 개선, 그리고 심장근과 골격근 형태별 eNOS의 발현 증가 및 병리학적 심근비대에 관여하는 ET-1 유전자 발현을 감소시켜 고혈압 개선에 효과적으로 작용하는 것으로 나타났다.
- 한편 이러한 결과들과 함께 본 연구에서 규칙적인 운동은 본태 성 고혈압쥐의 hemodynamic fators의 개선효과를 가져왔다. 이는 운동과 혈압개선 효과에 관한 선행연구들과 일치하는 것으로 [11, 12, 19] 운동을 통한 혈액량, 신장기능, 부신피질호르몬, 신경성 조절 등의 다양한 기전들이 상호 복합적으로 관여한 것으로 보여 진다.
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