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문제 정의
- 현 연구에서는 간의 이물질대사에 대한 인삼의 효능 메카니즘을 더 구명하기 위하여 생후 6주 경과시부터 12개월까지 장기간 홍삼의 물 추출물을 공급한 흰쥐에 간의 대표적인 이물질 대사 효소 유도제인 PB와 3-MC를 주사하여 장기간 홍삼의 투여가 간의 이물질대사 효소계 유도에 미치는 영향을 조사하고자 하였다.
제안 방법
- 각 시험군의 나이가 3개월, 12개월 되었을 때, 생리식염수와 이물질대사효소 유도제인 PB (80㎎/㎏) 과 3-MC (20㎎/㎏)를 3일 연속으로 흰쥐의 복강에 투여하였고, 다음 날까지 절식시킨 후 희생시키고 간을 적출하였다.
- 2% 이상 배합사료)를 사용하였다. 대조군과 홍삼 투여군은 충분한 양의 사료를 공급하였으며, 생후 6주 부터 홍삼투여군은 홍삼의 물 추추물을 흰쥐의 체중변화와 음수량을 고려하여 체중 kg당 약 25 mg 이 섭취되도록 식수에 녹여 공급하였다.
- 동물사육실의 조건은 conventional system으로 온도는 20±2℃, 습도는 40-60%, 환기는 1시간당 12-15회로 하였으며, 1일중 12시간은 200-300 Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 그리고 cage는 22 X 32 X ]7 cni 의 polycar- bonate재질로 만든 것을 사용하였으며 깔집은 (주)Samtako 제품의 버드나무송으로 만든 것을 사용하였다.
- 이용하였다. 흰쥐는 이유 후(분만 후 21-23일) 체중이 50 ± 3 g인 개체만을 선별하여 대조군과 홍삼투여군으로 나누었고, 각 실험군마다 48마리씩 사육하였다. 흰쥐의 사육은 이유 후 30일까지는 한 cage에 5마리, 3개월까지는 2마리, 그 후에는 한 마리씩 넣어 사육하였다.
대상 데이터
- 차단하였다. 그리고 cage는 22 X 32 X ]7 cni 의 polycar- bonate재질로 만든 것을 사용하였으며 깔집은 (주)Samtako 제품의 버드나무송으로 만든 것을 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 실험동물은 Sprague-Daw ley(SD) 계로 수컷만을 이용하였다. 흰쥐는 이유 후(분만 후 21-23일) 체중이 50 ± 3 g인 개체만을 선별하여 대조군과 홍삼투여군으로 나누었고, 각 실험군마다 48마리씩 사육하였다.
- 흰쥐의 사육은 이유 후 30일까지는 한 cage에 5마리, 3개월까지는 2마리, 그 후에는 한 마리씩 넣어 사육하였다. 실험동물의 사료는 (주) Samtako 제품의 고형사료 (조단백질 18.0% 이상, 조지방 5.0% 이상, 조섬유 4.5% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.7% 이상, 인 1.2% 이상 배합사료)를 사용하였다. 대조군과 홍삼 투여군은 충분한 양의 사료를 공급하였으며, 생후 6주 부터 홍삼투여군은 홍삼의 물 추추물을 흰쥐의 체중변화와 음수량을 고려하여 체중 kg당 약 25 mg 이 섭취되도록 식수에 녹여 공급하였다.
데이터처리
- 모든 데이터는 평균 土표준편차로 나타내었으며, 데이터 분석은 StatView version (4, 0 Abacus Concepts, Inc. Berkeley, CA) 을 이용하였고, Fisher's protected least significant difference test 혹은 Scheffe's F test에 의해 두 처리군 사이에 “값이 0.05보다 작은 값을 나타내었을 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- 측정하였다. Ethoxycoumarin O-deethylase (ECOD)와 benzphetamine N-demethylase (BPDM)의 활성도는 각각 Greenlee와 Poland의 방법 (1978) 및 Thomas등의 방법 (1976)에 따라 측정하였다. Glutathione-S-transferase (GST)는 Habig등의 방법 (1974)에 따라 l-chloro-2, 4-dinitrobenzen을 기질로 하여 측정하였고, 단백질 함량은 표준물질로 bovine serum albumin을 사용하여 Lowry 등의 방법(1951)에 따라 측정하였다.
- Ethoxycoumarin O-deethylase (ECOD)와 benzphetamine N-demethylase (BPDM)의 활성도는 각각 Greenlee와 Poland의 방법 (1978) 및 Thomas등의 방법 (1976)에 따라 측정하였다. Glutathione-S-transferase (GST)는 Habig등의 방법 (1974)에 따라 l-chloro-2, 4-dinitrobenzen을 기질로 하여 측정하였고, 단백질 함량은 표준물질로 bovine serum albumin을 사용하여 Lowry 등의 방법(1951)에 따라 측정하였다.
- 간의 이물질대사효소 중 cytochrome P-450과 cytochrome b5의 함량은 Omura와 Sato의 방법 (1964)에 따라 측정하였으며, NADPH cytochrome P-450 reductase 활성도는 Wiliam 과 Kamin의 방법 (1962)에 준하여 microsome 분획에 의한 cytochrome c의 환원율을 이용하여 측정하였고, NADH cytochrome bs의 활성도는 Mihara와 Sato의 방법 (1975)에 따라 측정하였다. Ethoxycoumarin O-deethylase (ECOD)와 benzphetamine N-demethylase (BPDM)의 활성도는 각각 Greenlee와 Poland의 방법 (1978) 및 Thomas등의 방법 (1976)에 따라 측정하였다.
- 적출한 간을 즉시 액체질소에 넣었으며, Lee 등의 방법 (2002)에 따라 간을 4배의 130 mM KC1 을 함유한 30 mM Hepes 완충액 (pH 7.4)으로 희석하여 균질화한 다음, differential centrifiigation에 의해서 microsome과 cytosol 분획을 분리하였다. Microsome을 분리하는 전 과정은 0-4℃ 저온실에서 수행하였으며 -70℃에 보관하면서 각종 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 01) 3-MC와 PB를 투여했을 때는 홍삼투여군은 유의성 없이 대조군에 비해 약간 높은 경향만을 나타내었다. 12개월에서 홍삼투여군은 3개월에 비해 유도제를 투여 하든 안 하든 그 활성도의 감소폭이 대조군보다 적게 나타났다.
- Table 3은 장기간 홍삼의 물 추출물을 공급한 흰쥐에 이물질대사효소 유도제 3-MC와 PB를 투여하고 간 microsome에서 cytochrome bs의 함량과 cytochrome b5 reductase의 활성도를 즉정한 결과이다. 3개월 대조군 흰쥐에 cytochrome P-450 유도제 3-MC와 PB를 투여했을 때 무 처리 군에 비해 cytochrome bs의 함량은 증가하였으나 cytochrome P-450 함량과 같이 크게 증가하지는 않았으며, cytochrome b5 reductase의 활성도는 무처리군과 큰 차이를 보이지 않았다. 또한 홍삼투여군에서도 3-MC와 PB를 투여했을 때 대조군과 거의 같은 경향을 나타내었고, 12개월에서 대조군과 홍삼투여군 모두 3개월에 비해 cytochrome bs의 함량과 cytochrome b5 reductase의 활성도는 감소하였다.
- 이 결과는 PB는 BPDM을, 3-MC는 ECOE 선택적으로 유도한다는 것을 시사한다. 3개월 및 12개월 홍삼투여군에 PB를 투여하면 BPDM의 활성도를 각각 1.9배와 2.3배 증가시켜 (p<0.01) 이는 대조군에 비하여 현저히 감소한 것으로 홍삼의 장기투여가 PB에 의한 BPDM의 . 유도효과를 억제한다는 것을 나타내는 것이다.
- 1 은 장기간 홍삼의 물 추출물을 공급한 흰쥐에 이물질대사 효소유도제 3-MC와 PB를 투여하고 간에서 GST 활성도를 조사한 결과이다. 3개월 흰쥐에서 대조군과 홍삼투여군 모두 3-MC와 PB의 투여는 GST의 활성도를 증가시켰으나 (p<0.01) 대조군이 홍삼투여군보다 더 높은 활성도를 나타내었다. 그러나 12 개월에서 홍삼투여군에 3-MC와 PB를 투여했을 때 GST 활성도는 3개월 홍삼투여군의 각각 86%와 83 수준을 유지하였으나, 12개월에서 대조군은 GST 활성이 3개월의 정상군에 비해 각각 77%와 72%의 수준을 나타내었다.
- 01). 3개월에서 홍삼투여군은 대조군에 비해 cytochrome P-450 함량이 약간 증가하는 경향이었으나 3-MC와 PB를 처리하면 그 함량은 각각 1.6배와 1.8배 증가하여 대조군에 비해 낮게 유도되었다. 또한, 12개월 된 흰쥐에서 3-MC와 PB를 처리했을 때 cytochrome P-450의 함량은 무처리군에 비해 각각 2.
- 장기간 홍삼의 물 추출물을 처리한 흰쥐에 cytochrome P-450 유도제인 3-MC와 PB 를 투여하고, 간에서 cytochrome P-450 reductase의 활성도 변화를 측정한 결과는 Table 1에 나타나 있다. 흰쥐의 나이가 3개월 되었을 때 홍삼처리군은 정상군에 비해 cytochrome P- 450 reductase의 활성도가 증가되어 있었으며 Q?<0.01), 대조군 12개월은 3개월의 약 71%의 활성도를 유지하고 있었으나 홍삼 투여군은 약 75% 유지하고 있었다. 두 시험군의 나이가 3개월과 12개월에서 모두 PB를 투여했을 때가 3-MC를 투여했을 때보다 cytochrome P-450 reductase의 활성도가 높았으며 (p<0.
- 01) 대조군이 홍삼투여군보다 더 높은 활성도를 나타내었다. 그러나 12 개월에서 홍삼투여군에 3-MC와 PB를 투여했을 때 GST 활성도는 3개월 홍삼투여군의 각각 86%와 83 수준을 유지하였으나, 12개월에서 대조군은 GST 활성이 3개월의 정상군에 비해 각각 77%와 72%의 수준을 나타내었다. 따라서 흰쥐에 3-MC와 PB를 투여했을 때 간 이물질대사 phase II 효소인 GST도 phase I 효소들과 같이 나이가 들어감에 따라 그 활성도가 감소하는데 장기간의 홍삼의 처리는 이러한 감소 효과를 완화하는 효과가 있다고 판단된다.
- 따라서 Table 2는 홍삼의 물 추출물을 공급한 흰쥐에 이물질대사효소 유도제 3- MC와 PB를 투여하여 이 기질에 의해서 선택적으로 유도되는 cytochrome P-450의 monooxygenase 중의 하나인 BPDM과 ECOD의 활성도를 간의 microsome에서 측정한 결과이다. 대조군에서 BPDM의 활성도는 3개월과 12개월에서 PB를 처리했을 때 무처리군에 비해 각 3.0배와 2.7배 중가하였으나 (p<0.01), 3-MC의 처리는 무처리군에 비해 L7배와 1.9배를 증가 시켜(pv01), BPDM 활성도는 PB 처리가 3. MC보다더 현저하게 유도되었다.
- 01), 대조군 12개월은 3개월의 약 71%의 활성도를 유지하고 있었으나 홍삼 투여군은 약 75% 유지하고 있었다. 두 시험군의 나이가 3개월과 12개월에서 모두 PB를 투여했을 때가 3-MC를 투여했을 때보다 cytochrome P-450 reductase의 활성도가 높았으며 (p<0.01), 3개월에서 3-MC를 처리하였을 때 홍삼 투여군은 대조군과 거의 비슷한 수준이었으나 PB처리군은 홍삼 투여군이 대조군보다 더 낮은 활성도를 유지하고 있었다. 그러나 유도제를 투여하지 않았을 때 12개월에서 cytochrome P-450 reductase의 활성도는 홍삼투여군이 대조군보다 높았으나 ⑦ <0.
- , 2006). 따라서 장기간 홍삼의 식이는 다핵 방향족탄화수소 화합물로서 대표적인 발암제 3-MC 뿐만 아니라 항경련제 치료제로서 다양한 부반응을 일으키는 PB의 간대사효소 유도효과를 조절한다는 것을 의미하며, 이러한 작용기전이 홍삼의 항암효과의 메카니즘과 관련이 있을 것으로 판단된다. 한편, 12개월 된 흰쥐의 대조군과 홍삼 투여군의 cytochrome P-450의 함량은 3개월에 비해 각각 약 73%와 82% 유지하고 있었으며, 3-MC와 PB를 투여했을 때도 12개월의 정상군은 3개월에 비해 그 함량이 각각 78% 와 76% 유지하였으나, 홍삼투여군은 각각 94%와 87%를 유지하였다.
- 0배로 12개월 투여에 의하여는 억제하지 못하였으나 3개월 투여에 의하여 현저히 억제되었음을 알 수 있다. 또한 같은 흰쥐의 나이에서 유도제를 투여 안 했을 때나 투여했을 때 모두 홍삼 투여군이 대조군보다 두 효소는 거의 낮은 활성도를 나타내었다. 이러한 결과는 다핵 방향족 탄화수소의 발암과정을 억제하거나 약물의 부반응을 억제하는 홍삼의 메카니즘을 설명할 수 있는 실마리가 되지 않을까 생각되며, 더 많은 연구가 필요하리라 판단된다.
- 3개월 대조군 흰쥐에 cytochrome P-450 유도제 3-MC와 PB를 투여했을 때 무 처리 군에 비해 cytochrome bs의 함량은 증가하였으나 cytochrome P-450 함량과 같이 크게 증가하지는 않았으며, cytochrome b5 reductase의 활성도는 무처리군과 큰 차이를 보이지 않았다. 또한 홍삼투여군에서도 3-MC와 PB를 투여했을 때 대조군과 거의 같은 경향을 나타내었고, 12개월에서 대조군과 홍삼투여군 모두 3개월에 비해 cytochrome bs의 함량과 cytochrome b5 reductase의 활성도는 감소하였다. 따라서 cytochrome bs의 함량과 cytochrome b5 reductasee 활성도는 홍삼을 처리하거나 P-450의 유도제 처리에 의해 크게 영향을 받지 않는 것으로 판단된다.
- 8배 증가하여 대조군에 비해 낮게 유도되었다. 또한, 12개월 된 흰쥐에서 3-MC와 PB를 처리했을 때 cytochrome P-450의 함량은 무처리군에 비해 각각 2.3배와 2.4배 증가하였다 (p< 0.01), 12개월에서도 홍삼투여군은 무처리군에 비해 cytochrome P-450의 함량은 높게 유지되었으나, 3-MC와 PB 를 처리하면 그 함량이 각각 1.9배와 2.0배 정도로 3개월에서와 같이 이들의 효소유도효과를 억제하였다 (p<0.01). 즉 실험동물에 홍삼을 장기간 투여하고 대표적인 이물질대사 효소 유도제인 3-MC와 PB를 처리하면 이 효소유도제들에 의한 효소유도 효과를 억제함을 알 수 있었다.
- 은 생후 6주부터 12개월까지 약 11개월동안 홍삼의 물 추출물을 공급한 흰쥐에 이물질대사효소 유도제 3-MC 와 PB를 투여하여 간 microsome에서 cytochrome P-450 함량을 즉정한 결과이다. 본 실험에서 대표적인 cytochrome P- 450 유도제인 3-MC와 PB를 3개월 된 대조군 흰쥐에 처리했을 때 무처리군에 비해 그 함량이 각각 약 2.1 배와 2.4배 증가하는 것을 확인하였다 ⑦ <0.01). 3개월에서 홍삼투여군은 대조군에 비해 cytochrome P-450 함량이 약간 증가하는 경향이었으나 3-MC와 PB를 처리하면 그 함량은 각각 1.
- 또한 3-MC에 .의한 ECOD의 유도 효과는 홍삼 3개월 및 12개월 투여군에서 각각 3.3배와 3.0배로 12개월 투여에 의하여는 억제하지 못하였으나 3개월 투여에 의하여 현저히 억제되었음을 알 수 있다. 또한 같은 흰쥐의 나이에서 유도제를 투여 안 했을 때나 투여했을 때 모두 홍삼 투여군이 대조군보다 두 효소는 거의 낮은 활성도를 나타내었다.
- 01). 즉 실험동물에 홍삼을 장기간 투여하고 대표적인 이물질대사 효소 유도제인 3-MC와 PB를 처리하면 이 효소유도제들에 의한 효소유도 효과를 억제함을 알 수 있었다. Benzo(a)pyrene과 같이 다핵 방향족 탄화수소 화합물은 그 자체성분보다 간의 이물질 대사 효소에 의한 대사산물이 더 독성이 높다고 알려져 있다.
- 따라서 장기간 홍삼의 식이는 다핵 방향족탄화수소 화합물로서 대표적인 발암제 3-MC 뿐만 아니라 항경련제 치료제로서 다양한 부반응을 일으키는 PB의 간대사효소 유도효과를 조절한다는 것을 의미하며, 이러한 작용기전이 홍삼의 항암효과의 메카니즘과 관련이 있을 것으로 판단된다. 한편, 12개월 된 흰쥐의 대조군과 홍삼 투여군의 cytochrome P-450의 함량은 3개월에 비해 각각 약 73%와 82% 유지하고 있었으며, 3-MC와 PB를 투여했을 때도 12개월의 정상군은 3개월에 비해 그 함량이 각각 78% 와 76% 유지하였으나, 홍삼투여군은 각각 94%와 87%를 유지하였다. 즉 나이가 들어감에 따라 cytochrome P-450의 함량은 정상군이나 cytochrome P-450의 유도제인 3-MC와 PB를 투여군도 모두 감소하였으나 홍삼 투여군은 나이가 들어도 그 함량은 정상군에 비해 어느 정도 더 유지되고 있어 이와 같은 결과는 지난 연구결과와 같았다 (Lim & Lee, 2006).
후속연구
- 또한 같은 흰쥐의 나이에서 유도제를 투여 안 했을 때나 투여했을 때 모두 홍삼 투여군이 대조군보다 두 효소는 거의 낮은 활성도를 나타내었다. 이러한 결과는 다핵 방향족 탄화수소의 발암과정을 억제하거나 약물의 부반응을 억제하는 홍삼의 메카니즘을 설명할 수 있는 실마리가 되지 않을까 생각되며, 더 많은 연구가 필요하리라 판단된다. 한편 대조군 12개월에서 PB의 투여는 BPDM의 활성도를 3개월의 72%를 유도하였으나 12개월 홍삼 투여군은 PB를 투여했을 때 3개월의 95%를 유도하였으며, 또한 대조군 12개월에서 3-MC의 투여는 ECOD의 활성도를 3개월의 55%를 유도하였으나 홍삼투여군은 78%를 유도하였다.
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