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문제 정의
- 의약품성분들의 유. 전독성 감수성 및 위험도를 평가하고자 한다. 또, 나아가 산화적 스트레스 환경하에서 식품의약품 등의유전독성 감수성 및 위험도를 평가함으로써 새로운유전독성 시험법 개발 가능성을 제시하고자 한다.
- 전독성 감수성 및 위험도를 평가하고자 한다. 또, 나아가 산화적 스트레스 환경하에서 식품의약품 등의유전독성 감수성 및 위험도를 평가함으로써 새로운유전독성 시험법 개발 가능성을 제시하고자 한다.
- 실시하였다. 이는 스트레스가 식품의약품 등의 유전독성에 미치는 영향을 평가함으로써 이들 물질에 대한 위험도 및 감수성 평가를 개선하고자 하였다. 또한, 산화적 스트레스 조건에서는 유전독성물질의 유전독성이 저용량에서도 증가되는 것을 확인하였으며, 향후 산화적 스트레스 조건에서 보다 다양한 유전독성물질의 저용량 노출에 따른 유전독성 평가가수행되어야 할 것으로 판단된다.
제안 방법
- 이에본 연구에서는 사람의 세포주를 이용하여 산화적스트레스 모델을 만들고 이를 토대로 기존의 유전독성 시험법을 이용하여 식품. 의약품성분들의 유.
- 세포배양을 위해 RPMI 1640 배지에 10mM HE- PES, 1 mM sdoum pyruvate, 4.5 g/L glucose, 1.5 g/L sodium bicarbonate와 10% FBS, 1% penicillin/strep- tomycin을 첨가하여 사용하였고, 37℃, 습도 95%, 5%CC>2 배양기에서 배양하였고, 2~3일마다 한번씩 계대배양하였다.
- well plate에 분주하였다. Overnight incubation한 후 H2O2와 MNNG-I- 농도별로 처리하고 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양한 후에 MTSassay를 이용하여 세포독성시험을 실시하였다. TK6 세포를 96 well plate에 SxlO’mL의 세포를 50|iL씩 분주한 후에 시험물질을 농도별로 처치하고 24시간 배양하였다.
- MTS에 근거하여 MNNG 및 压6 투여농도를 설정하였다. 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 #를 2시간 처치한 후 MNNG를 각 세포에서 2시간 처리한 후 시료를 채취하였다.
- 양하여 사용하였다. 5%의 CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였고 2~3일마다 한번씩 RPMI 1640배지를 이용하여 계대하였다. 배양 세포를 12- well plate에 1 x 10。cells/mL 이 되도록 파종을 한 후, 각각의 well 에 压。2를 저농도 및 고농도 투여군으로 각각 6.
- 5%의 CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였고 2~3일마다 한번씩 RPMI 1640배지를 이용하여 계대하였다. 배양 세포를 12- well plate에 1 x 10。cells/mL 이 되도록 파종을 한 후, 각각의 well 에 压。2를 저농도 및 고농도 투여군으로 각각 6.75 혹은 13.5 pM을 2시간 처치하였고, MNNG 를 저 , 중, 고농도의 농도를 사용하여 각각 0.117, 0.234, 0.468 μM을 2시간 처치하였다.
- 30~60분간 방치한다. 이어서 alkaline solu- tion에 Comet Slides을 20 ~ 60분 방치한 후 슬라이 드를 전기 영동기 계로 옮기 어 25 V, 200 mA에서 30분간 전기영동을 실시한다. 70% 알콜에 5분간 담근 후 자연 건조시키고 나서 ethidium bro-mide로 염색한 후 형광현미경으로 관찰하고, 영상분석프로그램 (Komet 3.
- 이어서 alkaline solu- tion에 Comet Slides을 20 ~ 60분 방치한 후 슬라이 드를 전기 영동기 계로 옮기 어 25 V, 200 mA에서 30분간 전기영동을 실시한다. 70% 알콜에 5분간 담근 후 자연 건조시키고 나서 ethidium bro-mide로 염색한 후 형광현미경으로 관찰하고, 영상분석프로그램 (Komet 3.1)를 이용하여 tail moment (tail DNA x tail length)값을 측정하여 DNA strand brea- kage 정도를 확인하였다.
- MTS에 근거하여 MNNG 및 氏。2 투여농도를 설정하였다. 배양 세포를 12 well plate에 1 x lb cells/mL이 되도록 파종을 한후 각각의 well에 压。2 6.75(IM을 2시간 처치하였고, MNNG를 저, 중, 고농도의 농도를 사용하여 각각 0.117, 0.234, 0.468 을 2시간 처치하였다.
- 이 상층액에 있는 malondialdehyde (MDA)의 양을 MDA-586 kit(BIOTYTECH, USA)< 사용하여 정 량하였다. MDA standard curve를 작성한 후샘플에 대한 MDA의 양을 환산하였다. 데이터는평균土 표준편차로 표시하였다.
- 이 상층액에 있는 malondialdehyde (MDA)의 양을 MDA-586 kit(BIOTYTECH, USA)< 사용하여 정 량하였다. MDA standard curve를 작성한 후샘플에 대한 MDA의 양을 환산하였다. 데이터는평균土 표준편차로 표시하였다.
- 시험물질을 처치한 세포주에서 각 투여시간 및 투여용량별로 시료를 채취하였다. 샘플을 PBS로 세척 한 후 RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA)-$- 이용하여 total RNA< 추출하였다.
- 1에 해당하는 샘플만 다음 단계로 진행하였다. 정량을 마친 total RNA를 Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technology, USA)을 이용하여 degradation 여부를 확인하였다. 준비된 샘플은 실험에 사용하기 전까지 -70 ℃에 보관하였다.
- 5 μL를 첨가하여 , 25"C에서 10분, 37℃에서 1시간, 95℃에서 5분간 처리한 후 즉시 얼음에 1。분간 둔 후에 -2(TC에서 분석 시 까지 보관하였다. cDNAs는 human catalase, glutathione peroxidase 1 (Gpx), superoxide dismutase 1 (Cu /Zn-SOD; SOD1), superoxide dismutase 2 (MnSOD; SOD2) mRNA에 대한 oligonucleotide primeis와 probe (Applied Biosystems, CA, USA)를 사용하여 증폭하였으며 , 증폭방법은 TaqMan® Gene Expression Assays 제조사의 매뉴얼에 따라 실시하였다. PCR program cyclese 다음과 같이 실시하였다.
- PCR program cyclese 다음과 같이 실시하였다. 50℃에서 2분간, 95℃에서 10분간 initial denaturing 한 후에 40 cycles (95℃ for 15 sec, 60℃ for 1 min)을 반복하여 증폭하였다. Beta-actin mRNA를 internal standard로 사용하였으며, 각 유전자의 발현을 real-time quantitative PCR로 정량하였으며, betaactin mRNA 발현수준에 의해 보정하였다.
- 50℃에서 2분간, 95℃에서 10분간 initial denaturing 한 후에 40 cycles (95℃ for 15 sec, 60℃ for 1 min)을 반복하여 증폭하였다. Beta-actin mRNA를 internal standard로 사용하였으며, 각 유전자의 발현을 real-time quantitative PCR로 정량하였으며, betaactin mRNA 발현수준에 의해 보정하였다. 모든 PCR products는 linear cycles.
- 저하되었으며, 田。2에 대한 독성감수성을 고려하여 H2O2 시험농도를 최고농도 13.5 皿, 최 저 농도 6.75 |1M로 설정하였다. 또한 MNNG 에 대한 MTS assay 결과 농도의존적으로 세포생존율이 저하되었으며, MNNG에 대한 독성감수성을고려하여 MNNG를 저, 중, 고농도로 각각 0.
- 75 |1M로 설정하였다. 또한 MNNG 에 대한 MTS assay 결과 농도의존적으로 세포생존율이 저하되었으며, MNNG에 대한 독성감수성을고려하여 MNNG를 저, 중, 고농도로 각각 0.117, 0.234, 0.468)1M을 설정 하였다.
- 1A). 이와 같은 사항을 고려하여 각각의 well에 H2O2를 저농도 및 고농도 투여군으로 각각 6.75 혹은 13.5 卜iM을 선택하여 2시간 처치하였고, MNNG 는 저, 중, 고농도의 농도로 각각 0.117, 0.234, 0.468μM을 2시간 처치하였다.
- 1 의 값을 나타내었다. 분리된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다. Real-time RT-PCR 방법에 의해 human catalase, Gpx, SOD 1, SOD2 mRNA의 발현을 조사하였다.
- 분리된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다. Real-time RT-PCR 방법에 의해 human catalase, Gpx, SOD 1, SOD2 mRNA의 발현을 조사하였다. Catalase mRNA 발현은 H2O2 전처치 및 MNNG 투여군에서 감소되 었으나, MNNG 투여용량별 변화는 크게 나타나지 않았다.
- 유전독성시험을 위한 용량설정을 위해 MTS assay로 TK6 세포에 대한 감수성을 판단하였다. 田。2와 MNNG에 대한 MTS assay 결과 농도 의존적 인 세포생존율을 관찰하였으며, MNNG가 상대적으로 적은 농도에서 세포사를 유발하는 것으로 판단되었다.
- 5 μM에서는 유전독성을 유발하지 않았다. 또, MNNG의경우 세포생존율에 영향을 미치지 않으면서 유전독성을 유발하는 농도를 0.468 μM로 설정하여 공비 2로 하여 중농도 및 저농도를 설정하였다. 이 같은 설정은 MNNG에 의해 유전독성이 유발되는 농도에서 산화적 스트레스에 의해 유전독성이 증폭되는지 여부를 판정하기 위함이다.
- 본 실험을 통해 in vitro 산화적 스트레스 유발 모델 확립하였고, 정상상태와 스트레스 상태에서 유전독성물질에 대한 유전독성 평가를 실시하였다. 이는 스트레스가 식품의약품 등의 유전독성에 미치는 영향을 평가함으로써 이들 물질에 대한 위험도 및 감수성 평가를 개선하고자 하였다.
대상 데이터
- 사람 세 포주 TK6 (human lymphoblast cell line)는 American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA; CRL-8015TM)에서 구입하였다. rpmi 1640, fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin는 Gibco BRL(USA)에서 구입하였으며, sodium bicarbonate, DMSO, hydrogen peroxide (H2O2)는 Sigma사로부터구입하였고 N'-methyl-N'-nitroguanidine (MNNG)는 TCI로부터 구입하였다.
- 구입하였다. rpmi 1640, fetal bovine serum (FBS), penicillin/streptomycin는 Gibco BRL(USA)에서 구입하였으며, sodium bicarbonate, DMSO, hydrogen peroxide (H2O2)는 Sigma사로부터구입하였고 N'-methyl-N'-nitroguanidine (MNNG)는 TCI로부터 구입하였다.
- 시험물질로는 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 H26(Sigma, H1009)를 사용하였고, 유전 독성물질로는 MNNG (TCI, M0527)를 사용하였다. 시험물질의 용해를 위해 사용된 DMSO는 세포 성장과 형질 전환을 유도하지 않는 0.
- MNNG (TCI, M0527)를 사용하였다. 시험물질의 용해를 위해 사용된 DMSO는 세포 성장과 형질 전환을 유도하지 않는 0.5% 이내로 사용되었다.
- TK6 세포를 10% FBS가 포함된 RPMI 1640에서 배 양하여 사용하였다. 5%의 CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였고 2~3일마다 한번씩 RPMI 1640배지를 이용하여 계대하였다.
데이터처리
- MDA standard curve를 작성한 후샘플에 대한 MDA의 양을 환산하였다. 데이터는평균土 표준편차로 표시하였다.
- MDA standard curve를 작성한 후샘플에 대한 MDA의 양을 환산하였다. 데이터는평균土 표준편차로 표시하였다.
- Comet assay의 tail moment, MDA 및 real-time RT-PCR 데 이터는 JMP program (SAS Institute, Cary, USA)을 사용하여 유의수준을 검증하였다.
이론/모형
- H2O2 와 MNNG 에 대한 세포독성을 측정하기 위하여 Cell Titer 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, G5421, USA)를 사용하였다.
- cDNA 합성을 위해 TaqMan® Gold RT-PCR Kit (Applied Biosystmes, USA)를 사용하였다. 2 pg의 total RNA를 10X RT Buffer 10 μL, 25 mM M응Ck 22 μL, deoxyNTPs mixture 20 μL, random hexamers 5 |1L, RNase inhibitor 2 μL, MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U/eL) 2.
성능/효과
- H2O2 투여용량 6.75와 13.5 |1M에서는 대조군에 비해 증가를 나타내지 않았으나, 27μM에서는 대조군에 비해 유의적인 증가가 보였다 (p< 0.01) (Fig. 1A). 이와 같은 사항을 고려하여 각각의 well에 H2O2를 저농도 및 고농도 투여군으로 각각 6.
- 처치결과 MNNG 처치별 용량의존적으로 DNA 손상이 증가하였다. 이에 비해 压。2를 저농도로 처치한 경우 MNNG 단독투여군에 비교하여 DNA 손상이 증가하였으며, 특히 MNNG 고용량 투여군에있어서 H2O2 전처치에 DNA 손상이 크게 증가하였다(Fig.
- 증가하였다. 이에 비해 压。2를 저농도로 처치한 경우 MNNG 단독투여군에 비교하여 DNA 손상이 증가하였으며, 특히 MNNG 고용량 투여군에있어서 H2O2 전처치에 DNA 손상이 크게 증가하였다(Fig. IB, C). Comet assay의 대표적인 예를 Fig.
- 결과 压。2를 처치하고 MNNG를 투여한 군에서 MDA의 양이 증가양상이 관찰되었다(Fig. 3).
- 판단하였다. 田。2와 MNNG에 대한 MTS assay 결과 농도 의존적 인 세포생존율을 관찰하였으며, MNNG가 상대적으로 적은 농도에서 세포사를 유발하는 것으로 판단되었다. H2O2 투여농도 설정에 있어서 세포 생존율에 영향을 미치지 않으면서 유전독성을 유발하지 않는 농도를 찾고자 시험한 결과 27|iM에서는 유전독성을 유발하였으나, 6.
- 이 같은 설정은 MNNG에 의해 유전독성이 유발되는 농도에서 산화적 스트레스에 의해 유전독성이 증폭되는지 여부를 판정하기 위함이다. H2O2 저농도 및 고농도 투여군으로 각각 6.75 혹은 13.5 ptM를 2 시간 처치하였고, MNNG를 저, 중, 고농도의 농도를 사용하여 각각 0.117, 0.234, 0.468 μM를 2시간 처치하여 Comet assay를 실시한 결과 MNNG 처치 별 용량의존적으로 DNA 손상이 증가하였다. 또, 压。2를 전처치 후 MNNG를 투여한 경우가 MNNG 단독투여군에 비교하여 DNA 손상이 증가하였다.
- 또, 压。2를 전처치 후 MNNG를 투여한 경우가 MNNG 단독투여군에 비교하여 DNA 손상이 증가하였다. 특히 MNNG 고용량 투여군에 있어서 田。2 전처치에 의해 DNA 손상이 크게 증가할 뿐만 아니라 MNNG 저용량 투여군에 있어서도 H2O2 전처치에 의해 DNA 손상이 증가가 나타났는데, 이는 산화적스트레스가 가해진 경우 저용량의 유전 독성 물질이 노출될 경우 유전독성이 크게 증폭될 수 있음을 의미한다.
- 들 수 있다. 이 지질과산화의 대표적인 산물인 MDA를 정량한 결과 H2O2를 처치하고 MNNG를투여한 군에서 MDA의 양이 증가되었으며, MNNG 투여용량에 따라 MDA의 양이 증가됨을 확인하였다
- 또, 산화적 스트레스 유발과 유전독성물질 처치에 따른 항산화효소의 변화를 살펴보기 위해 realtime RT-PCR로 관련효소의 발현을 조사해본 결과 catalase mRNA 발현은 H2O2 전처치 및 MNNG 투여군에서 전체적으로 감소하는 양상을 나타내어, 산화적 스트레스가 가해진 상황에서는 catalase mRNA 발현이 감소하는 것으로 생각된다.
- 이는 GPx mRNA 의 감소보다는 경미하게 나타났다. 이와 같은 결과를 종합하면 H2O2 전처치 및 MNNG 처치군에서항산화효소 가운데 catalase mRNA 및 GPx mRNA 발현이 감소되며, 이는 산화적 스트레스에 의한 MNNG 유전독성증가와 연관되는 것으로 생각된다.
후속연구
- 이러한 과학적 보고들로 볼 때 유해물질 혹은 기존의 유익한 물질일지라도 스트레스 환경에서 유전독성에 대한 감수성이 변화될 수 있는 가능성이 있음에 따라 이들 물질의 활성을 좀 더 민감하게 평가할 수 있는 시스템을 개발하는 것이 필요하다. 이에본 연구에서는 사람의 세포주를 이용하여 산화적스트레스 모델을 만들고 이를 토대로 기존의 유전독성 시험법을 이용하여 식품.
- 이는 H2O2 전처치 후에 MNNG 저농도 혹은 중농도 처치를 한 경우 GPx mRNA의 감소가 유전독성증가에 관여할 가능성이있는 것으로 생각된다. 하지만 MNNG 고농도 처치군에서 GPx mRNA의 감소가 나타나지 않은 것이어떠한 기전에 의한 것인지는 본 실험을 통해 규명하기 어려우며, 추가적인 연구를 요망한다. 한편 SOD1 mRNA 및 SOD2 mRNA의 발현은 H2O2 전처치 및 MNNG 저농도 혹은 중농도 투여군에서약간의 감소경향을 나타내었다.
- 이는 스트레스가 식품의약품 등의 유전독성에 미치는 영향을 평가함으로써 이들 물질에 대한 위험도 및 감수성 평가를 개선하고자 하였다. 또한, 산화적 스트레스 조건에서는 유전독성물질의 유전독성이 저용량에서도 증가되는 것을 확인하였으며, 향후 산화적 스트레스 조건에서 보다 다양한 유전독성물질의 저용량 노출에 따른 유전독성 평가가수행되어야 할 것으로 판단된다. 또한, 환경 중에산화적 스트레스 유발 물질이 존재할 경우 낮은농도의 유전독성물질에 의해서도 유전자 손상을더욱 증가시킬 수 있는 가능성이 있으므로 산화적스트레스 유발 환경에서는 위해물질의 노출저감화가 필요할 것으로 생각된다.
- 본 유전독성 평가법은 독성물질에 대한 안전성 평가기술 확립 및 유전체자료 제출에 대한 가이드라인 작성에 활용될 예정이며, 향후 이를 기반으로 한 새로운 개념의 안전성 평가시스템은 식품 . 의약품 안전성평가 분야의 기술을 선진화하고, 국가경쟁력을 향상 시킬뿐만 아니라 신약 개발에도 커다란 도움이 될 것으로 생각된다.
- 또, 나아가 산화적 스트레스 환경하에서 식품 . 의약품 등의 유전독성 감수성 및 위험도를 평가함으로써 새로운 유전독성 시험법 개발 가능성을 제시할 수 있다고 생각된다. 이런 유전독성 평가방법은 독성물질에 대한 안전성평가기술 확립 및 유전체자료 제출에 대한 가이드라인 작성에 활용될 예정이며, 향후 이를 기반으로 한 새로운 개념의 안전성 평가시스템을 통해 식품 , 의약품 안전성평가 분야의 기술을 선진화하고, 국가 경쟁력을 향상 시킬뿐만 아니라 신약 개발에도 커다란 도움이 될 것으로 생각된다.
- 의약품 등의 유전독성 감수성 및 위험도를 평가함으로써 새로운 유전독성 시험법 개발 가능성을 제시할 수 있다고 생각된다. 이런 유전독성 평가방법은 독성물질에 대한 안전성평가기술 확립 및 유전체자료 제출에 대한 가이드라인 작성에 활용될 예정이며, 향후 이를 기반으로 한 새로운 개념의 안전성 평가시스템을 통해 식품 , 의약품 안전성평가 분야의 기술을 선진화하고, 국가 경쟁력을 향상 시킬뿐만 아니라 신약 개발에도 커다란 도움이 될 것으로 생각된다.
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