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문제 정의
- 주목할만한 효과를. 나타낸 시료들을 선별하였고, 그 중 하나인 암대극의 화장품 원료로서의 특성을 알아보기 위하여 항산화(Mn-SOD 생성 억제), 미백(세포 내 멜라닌 생성 억제) 및 항염(IL-la, Ⅱ.-6, COX-2, total NO 생성 억저)) 효과를 측정하는 다양한 실험을 실시하였고, 화장품 원료로서의 이용 가능성을 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 다양한 천연물을 대상으로 실시한 전 실험(스크리닝)에서 주목할만한 효과를. 나타낸 시료들을 선별하였고, 그 중 하나인 암대극의 화장품 원료로서의 특성을 알아보기 위하여 항산화(Mn-SOD 생성 억제), 미백(세포 내 멜라닌 생성 억제) 및 항염(IL-la, Ⅱ.
- 본 연구에서는 암대극 추출물의 화장품 원료로서의 특성을 알아보기 위하여 항산화, 미백 및 항염 효과에 대한 평가를 진행하였다.
제안 방법
- 농축된 추출물은 동결건조 장치 (freeze dryer, EYELA, Japan)를 사용하여 분말로 만들어 보관 및 실험에 사용하였다. 70 % 메탄올 추출물 4g을 메탄올 20 mL로 용해시킨 후 주사 여과 (syringe filter, Sartorius, German)를 사용하여 여과한 후, 충진제 (silicagel, 230 ~ 400 mesh, Merck, USA)와 medium pressure liquid chromatography (MPLC) 를 사용하여 실험을 진행하였다. 실험에 사용한 용매조건은 각용 매의 극성 순서대로 hexane, hexane과 ethylacetate 혼합용액, ethylacetate, ethylacetate와 methyl alcohol 혼합용액, methyl alcohol의 순으로 용매를 변화시켜가면서 전개하여 5개의 분획으로 분리하였다.
- DMEM 과 Hams F-12 media를 3 : 1의 비율로 조성하고 FBS를 10 % 농도의 배양액에서 human normal fibroblasts를 배양하였다. Fibroblast를 12-well plate에 분주 한 후 24 h 동안 배양한다.
- DMEM 과 Hams F-12 media를 3 : 1의 비율로 조성하고 FBS를 10 % 농도의 배양액에서 human normal fibroblasts를 배양하였다. Fibroblast를 12-well plate에 분주 한 후 24 h 동안 배양한다.
- DMEM 과 Hams F-12 media를 3 : 1의 비율로 조성하고 FBS를 10 % 농도의 배양액에서 human normal fibroblasts를 배양하였다. Fibroblast를 12-well plate에 분주 한 후 24 h 동안 배양한다.
- DMEM 과 Hams F-12 media를 3 : 1의 비율로 조성하고 FBS를 10 % 농도의 배양액에서 human normal fibroblasts를 배양하였다. Fibroblast를 12-well plate에 분주 한 후 24 h 동안 배양한다.
- 분리하였다. 각각의 분획들을 대상으로 항산화(Mn- SOD 생성 억제), 미백(세포 내 멜라닌 생성 억제) 및 항염(IL-la, IL-6, COX-H 그리고 total NO 생성 억제) 효과에 대한 실험을 실시하였다.
- 라디칼들은 생체 내에서 항산화 효소인 Mn-SOD의 활성를 증가시키는데, 라디칼을 적절히 제거할 수 있는 항산화 물질이 존재하면 Mn-SOD의 활성은 정상 수준으로 회복된다[7] 산화적 스트레스에 의한 Mn-SOD 활성 증가에 암대극 추출물이 어떠한 영향을 미치는지 관찰하였다. 1번과 5번 분획은 실험한 모든 농도에서 Mn-SOD 생성을 억제하는 효과를 나타내었다.
- 배양 후 배지를 제거하고 10 % FBS, 0.2 mM the- ophylline이 함유된 DMEM에 농도별로 희석한 시료를 각각 첨가하고 나서, 세포가 약 80 % 이상 될 때까지 배양하였다. PBS로 세척하고 hypsin으로 처리하여 세포 peUet 을 회수하였다.
- 70 % 메탄올 추출물 4g을 메탄올 20 mL로 용해시킨 후 주사 여과 (syringe filter, Sartorius, German)를 사용하여 여과한 후, 충진제 (silicagel, 230 ~ 400 mesh, Merck, USA)와 medium pressure liquid chromatography (MPLC) 를 사용하여 실험을 진행하였다. 실험에 사용한 용매조건은 각용 매의 극성 순서대로 hexane, hexane과 ethylacetate 혼합용액, ethylacetate, ethylacetate와 methyl alcohol 혼합용액, methyl alcohol의 순으로 용매를 변화시켜가면서 전개하여 5개의 분획으로 분리하였다. 이들 5개의 분획들 각각에 대한 효능 평가를 실시하였다.
- 암대극을 70 % 메탄올로 추출하여 농축한 후, 크로마토그래피 방법 중 하나인 MPLC를 이용하여 5개의 분획들로 분리하였다. 각각의 분획들을 대상으로 항산화(Mn- SOD 생성 억제), 미백(세포 내 멜라닌 생성 억제) 및 항염(IL-la, IL-6, COX-H 그리고 total NO 생성 억제) 효과에 대한 실험을 실시하였다.
- 상등액이 제거된 pellet을 60 ℃ 항온기에서 24 h 동안 건조시킨 후 1 N NaOH를 첨가하여 세포 내의 melanin을 용해시켰다. 용해된 melanin을 PBS로 적당량 희석, ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정한 후 melanin 생성 저해율(%)을 계산하였다.
- 실험에 사용한 용매조건은 각용 매의 극성 순서대로 hexane, hexane과 ethylacetate 혼합용액, ethylacetate, ethylacetate와 methyl alcohol 혼합용액, methyl alcohol의 순으로 용매를 변화시켜가면서 전개하여 5개의 분획으로 분리하였다. 이들 5개의 분획들 각각에 대한 효능 평가를 실시하였다.
- 일주일 동안 추출하였다. 추출액은 여과지(Wliatman, No.2, England)와 흡입기를 사용하여 감압여과한 후, 회전 진공 농축기를 이용하여 농축하였다. 농축된 추출물은 동결건조 장치 (freeze dryer, EYELA, Japan)를 사용하여 분말로 만들어 보관 및 실험에 사용하였다.
- IL-la 는 전염 증성 조절 인자(pro- inflammatory medator)로 작용하는 세포 간 신호물질(사이토카인)로, 피부가 자극성 물질에 노출되었을 때, 염증반응의 일환으로 대식세포, 단핵세포 등의 진입을 유도하기 위하여 각질형성세포, 섬유아세포 등이 생산한다[8]. 피부 이상 반응을 유발하는 인자에는 화학물질, 세정제, 자외선 둥 많은 요소들이 있으며, 피부 보호 작용을 평가하기 위하여 인위적으로 ILTa의 생성을 유도시킨 후암대극 추출물이 ILTa의 생성을 억제하는지를 측정하였다. 1번과 5번 분획들이 ILTa 생성 억제 효과를 나타내었다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 시약으로는 potassium phosphate (mono-basic, di-basic), fetal bovine serum (FBS), Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM), trypsin-EDTA solution, hydrogen peroxide (H2O2), Hams F-12 (Nutrient Mixture FT2 Ham), dimethyl sulfoxide (DMSO), phosphate buffered saline (PBS) solutione Sigma (USA)사의 제품을, human IL-1 a ELISA Kit, human IL-6 ELISA Kit는 Endogen (USA)사의 제품을, COX-H EUSA Kit, total NO (nitric oxide) ELISA kit, Mn-SOD ELISA kit는 Assay Designs (USA & Canada) 사의 제품을, medium pressure liquid chromatography (MPLCX 이용한 크로마토그래피에 사용한 SiHcagel 60 (230 ~ 400 mesh)은 Merck (USA)사의 제품을, 용매는 덕산화학(Korea)과 Fisher (USA)사의 제품을 사용하였다. Human normal fibroblasts는 MTT (Korea) 사에서, B16- F10 melanocyte는 ATCC에서 분양받아 사용하였다. 실험에 사용한 기기로는 aspirator (EYELA, Japan), evaporator (EYELA, Japan and BUCHI, Switzerland), MPLC (BUCHI, Switzerland), ELISA reader (Molecular Devices, USA)를 사용하였다.
- 2, England)와 흡입기를 사용하여 감압여과한 후, 회전 진공 농축기를 이용하여 농축하였다. 농축된 추출물은 동결건조 장치 (freeze dryer, EYELA, Japan)를 사용하여 분말로 만들어 보관 및 실험에 사용하였다. 70 % 메탄올 추출물 4g을 메탄올 20 mL로 용해시킨 후 주사 여과 (syringe filter, Sartorius, German)를 사용하여 여과한 후, 충진제 (silicagel, 230 ~ 400 mesh, Merck, USA)와 medium pressure liquid chromatography (MPLC) 를 사용하여 실험을 진행하였다.
- 본 실험에 사용한 암대극은 2005년 6월 제주도에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 시약으로는 potassium phosphate (mono-basic, di-basic), fetal bovine serum (FBS), Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM), trypsin-EDTA solution, hydrogen peroxide (H2O2), Hams F-12 (Nutrient Mixture FT2 Ham), dimethyl sulfoxide (DMSO), phosphate buffered saline (PBS) solutione Sigma (USA)사의 제품을, human IL-1 a ELISA Kit, human IL-6 ELISA Kit는 Endogen (USA)사의 제품을, COX-H EUSA Kit, total NO (nitric oxide) ELISA kit, Mn-SOD ELISA kit는 Assay Designs (USA & Canada) 사의 제품을, medium pressure liquid chromatography (MPLCX 이용한 크로마토그래피에 사용한 SiHcagel 60 (230 ~ 400 mesh)은 Merck (USA)사의 제품을, 용매는 덕산화학(Korea)과 Fisher (USA)사의 제품을 사용하였다.
- Human normal fibroblasts는 MTT (Korea) 사에서, B16- F10 melanocyte는 ATCC에서 분양받아 사용하였다. 실험에 사용한 기기로는 aspirator (EYELA, Japan), evaporator (EYELA, Japan and BUCHI, Switzerland), MPLC (BUCHI, Switzerland), ELISA reader (Molecular Devices, USA)를 사용하였다.
- 사용하였다. 실험에 사용한 시약으로는 potassium phosphate (mono-basic, di-basic), fetal bovine serum (FBS), Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM), trypsin-EDTA solution, hydrogen peroxide (H2O2), Hams F-12 (Nutrient Mixture FT2 Ham), dimethyl sulfoxide (DMSO), phosphate buffered saline (PBS) solutione Sigma (USA)사의 제품을, human IL-1 a ELISA Kit, human IL-6 ELISA Kit는 Endogen (USA)사의 제품을, COX-H EUSA Kit, total NO (nitric oxide) ELISA kit, Mn-SOD ELISA kit는 Assay Designs (USA & Canada) 사의 제품을, medium pressure liquid chromatography (MPLCX 이용한 크로마토그래피에 사용한 SiHcagel 60 (230 ~ 400 mesh)은 Merck (USA)사의 제품을, 용매는 덕산화학(Korea)과 Fisher (USA)사의 제품을 사용하였다. Human normal fibroblasts는 MTT (Korea) 사에서, B16- F10 melanocyte는 ATCC에서 분양받아 사용하였다.
성능/효과
- 1번 분획은 0 ~ 40 %, 2번 분획은 50-70 %, 3번 분획은 10 ~ 60 %, 4번 분획은 10 ~ 40 % 그리고 5번 분획은 30 - 50 %까지 멜라닌 생성을 억제하였다. 저농도인 0.
- 억제 효과를 나타내었다. 1번과 5번 분획 모두 강한 효과를 나타내지는 않았으나, 농도가 증가할수록 효과도 증가하는 농도 의존적인 모습을 나타내었다. 나머지 세 개의 분획들(2번, 3번 그리고 4번)은 효과를 나타내지 않았다(Figure 4).
- 1번 분획은 10 ~ 20 %까지, 5번 분획은 10-40 %까지 Mn-SOD 생성을 억제하는 것으로 확인되었다. 1번과 5번 분획의 Mn-SOD 생성 억제 효과는 농도'의존적인 경향을 보였다. 나머지 세 개의 분획들(2번, 3번 그리고 4번)은 효과를 나타내지 않았다 (Figure 1).
- 5번 분획이 1번 분획과 비교하여 모든 실험(항산화, 미백 그리고 항염)에서 강한 효과를 나타내었다. 2번 분획은 미백(세포 내 멜라닌 생성 억제) 효과 실험에서 가장 강한 효과를 나타내었으나, 항산화 및 항염 실험에서는 전혀 효과를 나타내지 않았다. 나머지 2개 분획(2번과 4번)들은 미백(세포 내 멜라닌생성 억제) 효과 실험에서 약한 효과를 나타내었고, 항산화 및 항염 실험에서는 전혀 효과를 나타내지 않았다.
- 효과를 고루 나타내었다. 5번 분획이 1번 분획과 비교하여 모든 실험(항산화, 미백 그리고 항염)에서 강한 효과를 나타내었다. 2번 분획은 미백(세포 내 멜라닌 생성 억제) 효과 실험에서 가장 강한 효과를 나타내었으나, 항산화 및 항염 실험에서는 전혀 효과를 나타내지 않았다.
- 위의 결과를 토대로 암대극 추출물로부터 분리한 5개의 분획들 중에서 2개 분획(1 번과 5번)은 항산화(Mn- SOD 생성 억제), 미백(세포 내 멜라닌 생성 억제) 그리고 항염 (ILTa, IL-6, COX-D 그리고 total NO 생성 억제) 효과 모두에서 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였고, 이 중 5번 분획이 1번 분획과 비교하여 더욱 강한 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다. 1번과 5번 분획들로부터 활성 성분 분리 및 성분 물질 구조 확인 등에 대한 보다 다양한 추가 실험 및 연구가 필요하다고 사료된다.
- 1번 분획은 0 ~ 40 %, 2번 분획은 50-70 %, 3번 분획은 10 ~ 60 %, 4번 분획은 10 ~ 40 % 그리고 5번 분획은 30 - 50 %까지 멜라닌 생성을 억제하였다. 저농도인 0.00025 %의 농도에서 5개 분획들 모두 40 % 이상의 세포 내 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내었다. 2번 분획은 농도에 관계없이 '모든 농도에서 50 % 이상의 강한 효과를 나타내었다(Figure 2).
- 효능 실험결과를 간단히 요약하면, 1번과 5번 분획이 항산화(Mn-SOD 생성 억제), 미백(세포 내 멜라닌 생성억제) 그리고 항염(IL-la, IL-6, COX-IL, total NO 생성억제) 효과를 고루 나타내었다. 5번 분획이 1번 분획과 비교하여 모든 실험(항산화, 미백 그리고 항염)에서 강한 효과를 나타내었다.
후속연구
- 나타내는 것을 알 수 있었다. 1번과 5번 분획들로부터 활성 성분 분리 및 성분 물질 구조 확인 등에 대한 보다 다양한 추가 실험 및 연구가 필요하다고 사료된다.
- 이번 연구로 암대극 추출물이 항산화, 미백 그리고 항염 효과를 가진 기능성 화장품 원료로 개발이 가능할 것으로 사료된다.
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