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문제 정의
- 이에 본 연구는 대농갱이를 대상으로 우량의 순계 형질을 단기간 내 확보하고 아울러 본 종의 유전학적 성 결정 기구를 규명하기 위한 연구의 일환으로 대농갱이 자성발생성 이배체 유도를 위한 최적 조건을 구하고자 하였다.
제안 방법
- 자외선 조사가 완료된 정자 시료를 회수하여 대농갱이 난과의 인공수정을 상기와 같이 실시 하였다. 각 자외선 농도에서의 Hertwig 효과를 확인하기 위해 자성발생성 반수체의 생존율과 반수체 증후군(haploid syndrome)의 출현 빈도를 조사하였다. 반수체 증후군 발생빈도와 생존율은 최초 처리 난 수에 대한 각각의 백분율로 계산하였다.
- 건식법에 의해 알과 정자를 수정시켰으며 25±0.5°C로 부화시켰다.
- 대농갱이, Leiocassis ussuriensis의 유전육종학적 연구의 일환으로 자성발생성 이배체 유도 기법을 최적화하였다. 대농갱이 반수체 유도를 위해 다양한 농도의 자외선 조사를 통해 대농갱이 및 동자개 정자의 유전학적 불활성화 실시하였으며 최적 자외선 처리 조건은 4,800 ergs/mm2로 나타났고, 이 때 Hertwig effect와 함께 97% 이상의 반수체 유도가 가능하였다.
- 대농갱이의 산란 유도를 위하여 인간 융모막성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin, hCG; Sigma, USA)을 20,000 IU/kg으로 복강에 주사하고 18시간 경과 후부터 2시간 간격으로 복부를 가볍게 눌러 성숙난을 얻었다. 대농갱이 수컷은 복부를 절개 후, 정소를 적출하여 세절 후 정액을 수집하였으며, 수집된 정액은 0.
- 동자개, 대농갱이 및 미꾸라지 정자에 의한 대농갱이 자성발생성 이배체 유도를 위해 동자개 및 미꾸라지 정자의 자외선불활성화 조건을 Hertwig 효과 분석과 함께 조사하였다. 수집된 정액을 0.
- 각 자외선 농도에서의 Hertwig 효과를 확인하기 위해 자성발생성 반수체의 생존율과 반수체 증후군(haploid syndrome)의 출현 빈도를 조사하였다. 반수체 증후군 발생빈도와 생존율은 최초 처리 난 수에 대한 각각의 백분율로 계산하였다. 3반복의 처리를 통해서 각 구간의 평균 값을 구하였다.
- 수행된 각 처리 그룹에 대하여 부화 직전의 생존율을 백분율로 평가하여 최적 처리 조건을 구하였으며 이 때 각 처리 조건 별 3 반복구를 설정하여 분석하였다. 부화 직후 각 처리군에서 얻어진 개체들의 반수체 증후군 출현 빈도의 평가, 세포 크기 측정 또는 인 형성 부위(nucleolar organizing region)의 은 염색(silver staining) 분석을 통해 이배체 복원 빈도를 평가하였다.
- 불활성된 정자를 이용 대농갱이 난과 수정시켰으며 수정 후 3, 5, 7분 후에 각각 30, 40 및 50분간 4°C 또는 6°C로 저온 처리하였다.
- 상기 Hertwig effect 분석 결과에 의거하여 100% 반수체 증후군과 가장 높은 생존율을 보이는 적정 자외선 농도(4,800 erg/mm2)를 이용하여 동자개 정자를 불활성화 처리하였다. 불활성된 정자를 이용 대농갱이 난과 수정시켰으며 수정 후 3, 5, 7분 후에 각각 30, 40 및 50분간 4°C 또는 6°C로 저온 처리하였다.
- 동자개와 미꾸라지의 정액도 대농갱이 수컷의 방법과 동일하게 준비하였다. 수정은 건식법으로 하였으며, 수정 후 사육수로 세란한 후 petri dish에 수정난을 부착시킨 채 부화를 유도하였다.
- 동자개, 대농갱이 및 미꾸라지 정자에 의한 대농갱이 자성발생성 이배체 유도를 위해 동자개 및 미꾸라지 정자의 자외선불활성화 조건을 Hertwig 효과 분석과 함께 조사하였다. 수집된 정액을 0.85% 생리식염수로 50배 비율로 희석 후, 희석된 정액을 각 petri dish 바닥에 1 mm 두께가 되도록 도포하였고 UV-lamp (Sankyo Denki, Japan)를 사용하여 자외선을 조사(irradiation)하였으며 균일한 자외선 조사를 위해 자동 교반기를 이용하였다. 자외선 조사는 1,200 erg/mm2 단위로 1,20010,800 erg/mm2 구간에서 수행하였다.
- 5°C 항온 부화조에서 부화를 유도하였다. 수행된 각 처리 그룹에 대하여 부화 직전의 생존율을 백분율로 평가하여 최적 처리 조건을 구하였으며 이 때 각 처리 조건 별 3 반복구를 설정하여 분석하였다. 부화 직후 각 처리군에서 얻어진 개체들의 반수체 증후군 출현 빈도의 평가, 세포 크기 측정 또는 인 형성 부위(nucleolar organizing region)의 은 염색(silver staining) 분석을 통해 이배체 복원 빈도를 평가하였다.
- 자외선 4,800 ergs/mm2로 조사된 동자개 정자를 이용, 자성 발생성 이배체 유도를 위해 수정 후 3, 5 및 7분에 각각 30, 40°C 및 50분간 4°C와 6°C에서 저온 처리를 실시하였다.
- 자외선 조사는 1,200 erg/mm2 단위로 1,20010,800 erg/mm2 구간에서 수행하였다. 자외선 조사가 완료된 정자 시료를 회수하여 대농갱이 난과의 인공수정을 상기와 같이 실시 하였다. 각 자외선 농도에서의 Hertwig 효과를 확인하기 위해 자성발생성 반수체의 생존율과 반수체 증후군(haploid syndrome)의 출현 빈도를 조사하였다.
- 자외선 조사는 1,200 erg/mm2 단위로 1,20010,800 erg/mm2 구간에서 수행하였다.
- 처리가 종료된 수정난은 수온 25.0±0.5°C 항온 부화조에서 부화를 유도하였다.
대상 데이터
- 대농갱이의 산란 유도를 위하여 인간 융모막성 성선 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin, hCG; Sigma, USA)을 20,000 IU/kg으로 복강에 주사하고 18시간 경과 후부터 2시간 간격으로 복부를 가볍게 눌러 성숙난을 얻었다. 대농갱이 수컷은 복부를 절개 후, 정소를 적출하여 세절 후 정액을 수집하였으며, 수집된 정액은 0.85% 생리식염수로 10배 비율로 희석하여 수정에 사용하였다. 건식법에 의해 알과 정자를 수정시켰으며 25±0.
- 본 실험에 사용된 대농갱이는 충남 부여의 백마강에서 수집된 성숙된 개체를 친어(암컷 20.8±2.2 cm, 119.3±17.6 g 및 수컷 31.8±3.2 cm, 250.1±26.7 g)로 사용하였다.
- 이종간 자성발생성 이배체 유도를 위해 사용한 동자개(Pseudobagrus fulvidraco) 수컷은 충청남도 서산시 간척지 저수지에서 어획되는 것 중에서 성숙한 개체를 친어로 사용하였다. 역시 정자 공여자로 이용한 미꾸라지(Misgurnus mizolepis)는 순천향대학교 해양생명공학과 분자육종학 연구실에서 유지하고 있던 수컷 친어를 이용하였다.
- 7 g)로 사용하였다. 이종간 자성발생성 이배체 유도를 위해 사용한 동자개(Pseudobagrus fulvidraco) 수컷은 충청남도 서산시 간척지 저수지에서 어획되는 것 중에서 성숙한 개체를 친어로 사용하였다. 역시 정자 공여자로 이용한 미꾸라지(Misgurnus mizolepis)는 순천향대학교 해양생명공학과 분자육종학 연구실에서 유지하고 있던 수컷 친어를 이용하였다.
데이터처리
- 반수체 증후군 발생빈도와 생존율은 최초 처리 난 수에 대한 각각의 백분율로 계산하였다. 3반복의 처리를 통해서 각 구간의 평균 값을 구하였다.
- Vertical bars represent standard deviations based on three replicate examinations. Due to large variations among egg batches, no statistically significance was detected based on ANOVA at P = 0.05.
성능/효과
- 4°C 처리에서 관찰된 바와 같이 조사된 모든 최초처리 시점에서 40분간의 저온 처리가 가장 높은 생존율을 나타내었고 이중 수정 3분 또는 5분 후 40분간 처리가 수정 7분 후 처리보다 높게 나타났다(P<0.05).
- 대농갱이 암컷×동자개 수컷간 잡종 교배군(무처리 대조군)의 부화 직전 생존율은 67%로 나타났다. 그러나 반수체 유도를 위해 자외선 처리를 수행한 그룹들의 경우 1,2002,400 ergs/mm2 범위에서는 조사량이 증가할수록 생존율이 낮아지다가, 자외선 조사량이 3,6004,800 ergs/mm2구간에서는 다시 생존율이 높아졌으며 그 이상의 자외선 범위에서 유사한 생존율을 보였다(Fig. 1). 반수체 유도율은 자외선 조사량이 증가할수록 높아지는 경향을 보여 1,200 ergs/mm2 이상의 조건에서는 평균 98%로 높게 나타났다.
- 대농갱이, Leiocassis ussuriensis의 유전육종학적 연구의 일환으로 자성발생성 이배체 유도 기법을 최적화하였다. 대농갱이 반수체 유도를 위해 다양한 농도의 자외선 조사를 통해 대농갱이 및 동자개 정자의 유전학적 불활성화 실시하였으며 최적 자외선 처리 조건은 4,800 ergs/mm2로 나타났고, 이 때 Hertwig effect와 함께 97% 이상의 반수체 유도가 가능하였다. 반수체 대농갱이는 전형적인 반수체 증후군(haploid syndrome)을 보였으며, 반수체 대농갱이를 이배체로 복원시키기 위해 4°C 또는 6°C 에서 인공 수정 후 3, 5 및 7분 후에 30, 40 및 50분 간의 처리를 수행한 결과, 가장 높은 생존율(38.
- 대농갱이 암컷×대농갱이 수컷 실험에서 보다 특징적인 Hertwig effect가 관찰되었다.
- 대농갱이 암컷×동자개 수컷간 잡종 교배군(무처리 대조군)의 부화 직전 생존율은 67%로 나타났다.
- , 2006). 또한 정상 형질의 자성발생성 이배체 개체들의 인 형성 부위(NOR)의 은 염색 분석을 실시한 결과 대농갱이 이배체와 마찬가지로 1~2개의 NOR 염색을 나타내었으며 반면 반수체 증후군을 보이는 실험군은 세포 당 오직 1개의 인 형성 부위만이 관찰되어 이배체 그룹과 구별되었다(Fig. 5).
- 무처리 대조군의 생존율은 평균 58%였으며, 자외선을 조사한 실험에서는 1,2003,600 ergs/mm2 범위에서는 조사량이 증가할수록 생존율이 낮아졌으나, 자외선 조사량이 4,800 ergs/mm2에서는 가장 높은 57%의 생존율을 보였다가(P<0.05) 다시 생존율이 낮아져 6,00010,800 ergs/mm2 범위에서는 거의 유사한 생존율을 보여 전형적인 Hertwig effect를 나타내었다.
- 6%)이 관찰되었다. 반면 수정 7분 후 50분간 저온 처리 조건이 수행된 실험구의 생존율(평균 7.5%)이 가장 낮게 나타났다(Fig. 4a). 부화 후 반수체 증후군을 포함한 기형률, 즉 정상 이배체 형질을 보이지 못하는 모든 개체들의 백분율을 각 실험구 별로 분석한 결과 저온처리를 수행하지 않은 두 대조군 모두에서 2% 미만으로 나타났으나 자성발생성 처리군에서는 기형 개체의 빈도가 유의적으로 증가하였다 (P<0.
- 반수체 대농갱이는 전형적인 반수체 증후군(haploid syndrome)을 보였으며, 반수체 대농갱이를 이배체로 복원시키기 위해 4°C 또는 6°C 에서 인공 수정 후 3, 5 및 7분 후에 30, 40 및 50분 간의 처리를 수행한 결과, 가장 높은 생존율(38.6%)과 이배체 복원률(87.9%)은 수정 5분 후 4°C 에서 40분간 처리 조건에서 관찰되었다.
- 1). 반수체 유도율은 자외선 조사량이 증가할수록 높아지는 경향을 보여 1,200 ergs/mm2 이상의 조건에서는 평균 98%로 높게 나타났다. 그러나 사용한 난 및 정자 시료간의 비교적 높은 편차로 인해 통계적인 뚜렷한 유의차는 관찰되지 않았다(P>0.
- (2001)이 메기, Silurus asotus의 자성발생이배체 유도를 위해 처리한 4°C에서 수정 후 5분 후 40분간 처리한 조건과 일치하였다. 본 실험에서 유도된 자성발생성 이배 체들은 세포 크기 및 NOR 분석에서 정상 이배체 대농갱이의 형질과 차이를 나타내지 않았고 수컷으로 사용한 동자개의 형질 혼입에 관한 특이적인 증거는 관찰되지 않았다. 뿐만 아니라 선발된 자성발생성 이배체 개체들을 대상으로 수행한 염색체 분석에서도 역시 일반 대농갱이 이배체의 염색체(2n = 52)와 차이를 나타내지 않았다(data not shown).
- , 1999). 본 실험을 통해 대농갱이 자성발생 이배체 유도를 위해 대농갱이, 동자개 및 미꾸라지 정자를 평가한 결과, 대농갱이 및 동자개 정자 불활성화의 적정 자외선 조사 농도는 모두 4,800 erg/mm2를 포함하는 구간으로 판명되었고, 자외선 조사된 정자와의 인공 수정을 통해 부화 가능한 대농갱이 반수체 유도가 이루어 졌다. 각 어종 마다 정자 불활성화를 위한 적정 처리 자외선 농도는 종 특이적으로 나타나는 것으로 알려져 있으며 Im et al.
- 본 연구 결과, 동자개 정자를 이용한 이종간 교배에 의한 자성발생성 이배체 유도의 경우 역시, 본 연구 결과 대농갱이×동자개 유전형이 배체(embryo) 생존률에 있어 일반 대농갱이 암수간 교배군과 거의 차이를 나타내지 않는 것으로 나타나, 종 특이적인 형질 표지를 이용한 자성발생성 이배체의 분석은 가능하지만 생존 능력을 표지로 이용한 자성발생성 이배체의 단순 선발은 불가능하였다.
- 본 연구결과 대농갱이의 자성발생성 이배체 복원 효율은 3~7분 사이의 최초 처리 시점보다는 처리 지속 기간(30~50분) 및 처리 온도(4°C 및 6°C)에 의해 보다 많은 영향을 받는 것으로 나타났다.
- , 2000). 본 연구에서도 역시 대농갱이 및 동자개 정자의 유전적 불활성화를 위해 자외선 조사가 효과적으로 이용될 수 있음을 증명하였고, 특히 어류 정자의 자외선 조사 처리에서 나타나는 전형적인 Hertwig 효과 역시 관찰됨으로써 정확한 유전물질만의 불활성화가 달성되었음을 시사하고 있다.
- 05). 부화 직전의 생존율의 경우 최초 처리 시점과 상관 없이 대부분 처리군에서 40분 처리군이 가장 우수한 성적을 나타내었고, 특히 이중 최초처리가 수정 5분 후에 수행된 실험구에서 가장 높은 생존율(평균 38.6%)이 관찰되었다. 반면 수정 7분 후 50분간 저온 처리 조건이 수행된 실험구의 생존율(평균 7.
- 부화 후 반수체 증후군을 포함한 기형률, 즉 정상 이배체 형질을 보이지 못하는 모든 개체들의 백분율을 각 실험구 별로 분석한 결과 저온처리를 수행하지 않은 두 대조군 모두에서 2% 미만으로 나타났으나 자성발생성 처리군에서는 기형 개체의 빈도가 유의적으로 증가하였다 (P<0.05).
- 온도처리를 4°C로 수행한 각 실험군의 부화직전 생존율에 있어 대조군인 대농갱이군은 87.3±1.8%이었으며, 잡종 대조군인대농갱이 암컷×동자재 수컷 교배군은 88.9±2.5%로서 유의적인 차이는 관찰되지 않았다(P<0.05).
- 이에 생존율 및 기형률을 고려 시 대농갱이의 제 2극체 방출 억제를 위한 최적 저온 처리조건은 수정 후 5분, 4°C에서 40분간 수행하는 것으로 나타났다.
- 반면 미꾸라지 정자를 이용한 실험에서는 정상적인 발생이 이루어지지 않아 무처리 대조군 및 반수체 처리군 모두에서 부화 직전까지 생존한 배체가 관찰되지 않았다. 자성발생성 이배체 유도를 위한 실험에서 자외선이 조사된 처리군 및 대조군의 부화 직전 난막을 제거한 외형을 분석한 결과 종래 반수체 어류에서 관찰되는 공통적인 특징들(체장이 짧은 몸통, 미분화된 두부, 작은 난황낭 및 난황낭과 몸통 전반부 사이의 큰 강소 존재 등)을 보임으로서 전형적인 반수체 증후군 증세를 나타내었다(Fig. 3).
- 자성발생성 이배체 유도를 위해 실시한 저온 자극 처리는 생존율의 유의적인 감소를 야기시켰으며 모든 실험구에서 대조군의 50% 이하로 나타났다(P<0.05).
- 자성발생성 이배체처리군들 중에서는 최초처리가 수정 7분 후에 이루어진 그룹에서 상대적으로 높은 기형률(45.7%)이 관찰되었고, 반면 수정 5분 후 40분간 저온 처리가 가해진 실험구에서 정상개체 출현 빈도(평균 기형률 13.1%)가 가장 높았다(P<0.05) (Fig. 4a).
후속연구
- 이에 본 연구를 통해 대농갱이의 인공처녀생식의 일환인 자성발생성 이배체 유도 조건을 확립하였으며 향후 본 연구결과를 바탕으로 자성발생성 이배체의 여타 양식관련 형질(생존율, 성장, 성숙 여부)의 평가, 그리고 본 종의 유전학적 성 결정 기구 규명을 위한 자성발생성 이배체들의 성비 분석이 이루어져야 할 것이다.
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