[논문]Apigenin과 대사물 isovitexin에 의한 인체 대장암세포의 세포활성 억제효과에 있어서의 EGR-1의 역할 연구

문유석; 최뢰광; 양현

doi:10.5352/jls.2007.17.1.110

Apigenin과 대사물 isovitexin에 의한 인체 대장암세포의 세포활성 억제효과에 있어서의 EGR-1의 역할 연구
Involvement of Early Growth Response Gene 1 (EGR-1) in Growth Suppression of the Human Colonic Tumor Cells By Apigenin and Its Derivative Isovitexin 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.17 no.1 = no.81, 2007년, pp.110 - 115

문유석 (부산대학교 의학전문대학원 미생물학 및 면역학교실) , 최뢰광 (부산대학교 의학전문대학원 미생물학 및 면역학교실) , 양현 (부산대학교 의학전문대학원 미생물학 및 면역학교실)

초록
AI-Helper

Tumor suppressor 유전자로알려진 early growth response gene 1 (EGR-1)에 있어 항산화 천연물인 apigenin과 그대사물인 isovitexin에 의한 장관 상피성 종양세포에 대하여 항종양 역할을 규명하였다. Apigenin 과 isovitexin은 대장암세포에서의 EGR-1 단백질의 발현을 9-12시간의 노출에 의해 농도 의존적으로 증가하였다. 또한 신호전달측면에서 이런 apigenin에 의한 EGR-1 유전자의 유도가 U0126 화합물에 의해 완벽하게 저해 받는 것으로 보아 ERK1/2 MAP kinase pathway의 이 신호전달계에서의 관여를 보여주었다. 본 연구에서 apigenin에 의해 농도 의존적으로 대장암세포의 세포활성의 저해를 MTT assay를 통해 보였고, 또한 EGR-1 siRNA를 transfectien한 세포의 경우 이런 apigenin에 의한 세포활성의 저해효과를 완화하였다. 따라서 apigenin에 의한 항종암세포 세포활성 억제에 있어 EGR-1의 중요성을 보여 준다. 이런 EGR-1에 의해 유도되는 유전자중 대표적으로 NAG-1 유전자의 경우 apigenin과 isovitexin에 의해 24-48시간에 발현이 증가하였다. 결론적으로 암세포 증식억제활성이 있고 apoptosis 유도효과가 있는 NAG-1의 유도에 의해 대장암 세포의 세포활성이 억제된 것으로 의미되고 향후 apigenin 유도의 NAG-1유전자에 의한 암세포증식의 억제기전에 대한 명확한 연구가 요구된다.

Abstract ▼ AI-Helper

It has been previously described that transcription factor early growth response gene product 1 (EGR-1) functions as a tumor suppressor gene. This study was conducted to demonstrate that EGR-1 induction by phytochemical apigenin and its derivative isovitexin can mediate the growth suppression of the intestinal epithelial tumor cells. Apigenin and isovitexin induced EGR-1 gene expression both in the dose and time-dependent manners. Moreover the induction was relatively late around 9-12 hr after treatment of HCT-116 cells, while several anti-inflammatory agent such as NSAIDS and catechins elicit the ECR-1 gene expression at much earlier time about 1-3 hr after treatment. In terms of signal transduction, ERK1/2 was critical for apigenin-induced EGR-1 gene expression and its promoter activation. When EGR-1 gene expression was blocked with EGR-1 small interference RNA, the cytotoxicity of apigenin in the human epithelial cells was attenuated, suggesting the involvement of EGR-1 in the anti-tumoric activity of apigenin. To link the EGR-1 induction to EGR-1-regulated gene products in colon cancer, NSAID-Activated Gene 1 (NAG-1) was demonstrated to be elevated by apigenin and isovitexin at 24-48 hr after treatment. Taken together, apigenin-activated ERK1/2 mediated EGR-1 gene induction, which was associated with suppression of the cellular viability by apigenin compound.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

Apigenin의 대장암세포에 대한 독성효과는 다양한 논문을 통해서 증명 되어 지고 있다[EU4, 25]. 본 연구는 이런 암세포 활성 저하에 있어서의 EGR-1 단백질의 관련성을 조사하였다. 특히 EGR-1 small interference RNA를 이용하여 EGR-1 을 발현을 저해 시킨 후 apigenin에 의한 암세포 활성 저해 효과를 비교하였을 때, EGR-1 가 저해된 세포주에서의 세포 활성 저해가 훨씬 완화되었다 (Fig.
본 연구는 천연물 flavonoid 중 apigenin과 곡물의 배아 및 왕겨에 다량 존재하는apigenin 대사물인 isovitexin의 의하여 상피성 종양세포 HCT-116 대장암세포에서의 EGR-1 유전자의 발현에 대하여 분석하고 이 유전자에 의한 대표적 표적 단백질 중 NAG-1과 이에 따른 세포활성에 대한 효과를 연구하였다.

가설 설정

Fig 4. A, Effect of apigenin on the cellular viability of HCT-116 cells. Cells were exposed to each dose of apigenin for 24 hr.
Fig 2. A. Effect of apigenin on MAP Kinases in the colon tumor cells. HCT-116 cells were exposed to apigenin (50 mM) for the indicated time.

제안 방법

3-(4/5"dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethox- yphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS)을 이용하여 발색반응을 분석하였다. 세포주 (2 X l04/well)를 96-well plate에서 화합물을 처리 하였고 처리 시간이 경과한 후 각 well당 50 ml MTS를 투입하여 2시간 반응 시킨 후 배지를 버려내고 각 well에 DMSO 100 ml을 넣고 20분간 반응 시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
IB). Apigenin과 iso- vitexin에 의한 EGR-1 유전자의 발현유도효과를 대장암세포에서 관찰하였고 이는 다른 항염증성 특히 COX 저해성 약물 및 천연물에서 보이는 EGR-1 양상과는 다른 유도 kinetics를 보인다. 따라서 이에 따른 유전자발현의 신호전달계의 분석이 요구된다.
, Sunnyvale, CA)를 이용해서 측정하였다. Firefly luciferase activitye renilla luciferase activity에 대해서 일반화 하였고 활성은 다음의 상대치로 표시하였다 (firefly luciferase activity / renilla luciferase activity).
상층액은 이후 실험을 위해서 -80 ℃에 보관하였다. Luciferase activity는 duabmode luminometer (Model TD-20/20z Turner Designs Co., Sunnyvale, CA)를 이용해서 측정하였다. Firefly luciferase activitye renilla luciferase activity에 대해서 일반화 하였고 활성은 다음의 상대치로 표시하였다 (firefly luciferase activity / renilla luciferase activity).
Luciferase reporter gene의 transfection을 위해서 각 well 당 L5 mg firefly luciferase reporter plasmid와 0.15 mg renilla luciferase, pRL-null vector (Promega, Madison, WI) 를 4.5 ml Trans-LTl reagent에 혼합하여 6 well culture plate에 처리하였다. Transfection후 24시간뒤 세포는 화합물에 24시간 노출하였다, Firefly 와 대조구인 renilla luciferase를 동시에 transfection 하는 Dual-luciferase reporter assay system (Promega)을 이용해서 정량하였다, 모든 tranfection 효율은 50내지 60%정도를 유지하였고 이 효율은 pMX enhanced GFP vector-1- 이용해서 transfection 후 동시에 확인하였다.
Transfection후 24시간뒤 세포는 화합물에 24시간 노출하였다, Firefly 와 대조구인 renilla luciferase를 동시에 transfection 하는 Dual-luciferase reporter assay system (Promega)을 이용해서 정량하였다, 모든 tranfection 효율은 50내지 60%정도를 유지하였고 이 효율은 pMX enhanced GFP vector-1- 이용해서 transfection 후 동시에 확인하였다. Stable cell lines을 추가로 만들기 위하여 48시간뒤 1000 mg/ml G418 (Invitrogen, Carlsbad.CA) 로서 선별을 가하였다. 선별은 monolayer colonies 가 형성될때까지 하며 안정된 trans- fectants 는 500 mg/ml G418의 일반배양액에서 유지한다.
5 ml Trans-LTl reagent에 혼합하여 6 well culture plate에 처리하였다. Transfection후 24시간뒤 세포는 화합물에 24시간 노출하였다, Firefly 와 대조구인 renilla luciferase를 동시에 transfection 하는 Dual-luciferase reporter assay system (Promega)을 이용해서 정량하였다, 모든 tranfection 효율은 50내지 60%정도를 유지하였고 이 효율은 pMX enhanced GFP vector-1- 이용해서 transfection 후 동시에 확인하였다. Stable cell lines을 추가로 만들기 위하여 48시간뒤 1000 mg/ml G418 (Invitrogen, Carlsbad.
세포는 EGR-1 (Dharmacon, Lafayette, CO)의 siRNA를 lipofectamine 2000 (Invitrogen, CaHsbad.CA)으로 처리하여 manufacturer's protocol (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 따라 transfection 하였다. 모든 처리반응 시간은 72 시간이었다.
세포는 Trans-LTl transfection reagent (Mirus, Madison, WI)를 이용중]]서 제조자 프로토콜에 따라 transfection을 수행하였다. Luciferase reporter gene의 transfection을 위해서 각 well 당 L5 mg firefly luciferase reporter plasmid와 0.
한가지 예로서 p53 단백질의 경우 apigenin에 의하여 단백질의 반감기가 증가되는 효과가 있다[19]. 이를 바탕으로 isoflavone 계통의 화합물의 EGR-1 유도에 대한 신호전달 체계를 연구하였다. 또한 농도실험에서 12시간 노출에서 50-100 mM apigenin에 의해 EGR-1 이 발현이 최고점이었다 (Fig.

대상 데이터

HCT 116 세포주는 미국 유형 배양 콜랙션 (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD) 에서 구매하여 McCoy's 5A media (10 % FBS, 50 unit/ml penicillin (Sigma, St. Louis, MO), 50mg/ml streptomycin (Sigma, St. Louis, MO)에 5% CO₂ humidified incubator at 37도에서 배양하였다 세포수와 생존활성 (viability)은 trypan blue (Sigma) dye exchi£ion을 이용해서 hemacytometei상에서 측정하였다. 화합물 노출 실험 중에는 혈청이 없는 배지를 이용하였다.
05% (TEST) 로 blocking 후 각각의 일차항체로 2시간 상온에서 반응 후 3회 TBST 로 세척 후 horseradish-conjugated secondary antibody로 1시간 상온 반응후 3회 세척 후 ECL Chemiluminescent substrate (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로 발색 현상하였다. 각 일차항체는 rabbit polyclonal anti-human Actin antibody (Santacruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 토끼 polyclonal anti-p-MAPKs, anti-Egr-1 항체 (Cell signaling technology, Beverly, MA)를사용하였다.
데이타는 SigmaStat for windows (Jandel Scientific, San Rafael, CAZ USA)를 이용해서 분석하였다. 두그룹의 데이터 비교는 Student's I test를 하였고, multiple groups 비교는 ANOVA를 실시한다.
세포는 차가운 PBS로 세척후 수동 분해 버퍼 (Promega) 로 분해물을 준비하였다, 12,000 g에서 4 분간 원심분리후 상층 효소액을 assay에 이용하였다. 상층액은 이후 실험을 위해서 -80 ℃에 보관하였다.
화합물 노출 실험 중에는 혈청이 없는 배지를 이용하였다. 저해제 등은 Calbiochem (EMD biosciences, Inc. La Jolla, CA)에서구매하였다.
Louis, MO)에 5% CO₂ humidified incubator at 37도에서 배양하였다 세포수와 생존활성 (viability)은 trypan blue (Sigma) dye exchi£ion을 이용해서 hemacytometei상에서 측정하였다. 화합물 노출 실험 중에는 혈청이 없는 배지를 이용하였다. 저해제 등은 Calbiochem (EMD biosciences, Inc.

데이터처리

CAZ USA)를 이용해서 분석하였다. 두그룹의 데이터 비교는 Student's I test를 하였고, multiple groups 비교는 ANOVA를 실시한다.

이론/모형

Apigenin에 의하여 상피성 종양에 대한 세포활성의 효과를 MTS assay를 통해 실시하였다. 특히 HCT-116 세포에 대하여 농도 의존적으로 세포활성이 억제되었다 (Fig.

성능/효과

3). 결론적으로 apigenin에 의해 활성화된 ERK MAP kinase가 직접적으로 EGR-1의 발현과 전사활성화에 관여되어 지는 것으로 사료되어 진다.
2A). 그 활성화 kinetics 또한 매우 다르게 나타났는데 p38과 JNK의 경우 4시간 이후는 현저히 감소되었으나, ERK MAP kinase의 경우는 노출시 킨 9시간 동안 장기적으로 활성화 되었다. 따라서 ERK가 EGR-1 발현에 관련 되는 중심 신호전달자라는 가정 하에 ERK의 신호전달계를 저해하는 U0126을 동시 처리시 현저하게 apigenin에 의해 유도된 EGR-1의 발현이 현저하게 억제 되었다 (Fig.
그 활성화 kinetics 또한 매우 다르게 나타났는데 p38과 JNK의 경우 4시간 이후는 현저히 감소되었으나, ERK MAP kinase의 경우는 노출시 킨 9시간 동안 장기적으로 활성화 되었다. 따라서 ERK가 EGR-1 발현에 관련 되는 중심 신호전달자라는 가정 하에 ERK의 신호전달계를 저해하는 U0126을 동시 처리시 현저하게 apigenin에 의해 유도된 EGR-1의 발현이 현저하게 억제 되었다 (Fig. 2B). 이러한 결과들을 바탕으로 직접 EGR-1 유전자의 5-nntranslatedregion (UTR)의 luciferase 리포터를 이용해서 apigenin 의한 EGR-1 promoter activity에 대한 효과를 분석한 결과 api-genine 매우 낮은 농도 (1-2 mM)에서도 EGR-1 promoter를 활성화 할 수 있었고, ERK 의 신호전달계를 저해하면 거의 완전하게 EGR-1 promoter activity를 감소시켰다 (Fig.
본 실험에서 HCT-116 세포에서의 MAP Kinase의 인산화를 비교하였을 때 주요 kinase 인 JNK, ERK, p38 MAP kinase 모두가 활성화 되었다. 특히 ERK의 인산화가 뚜렷하게 나타났다 (Fig.
2B). 이러한 결과들을 바탕으로 직접 EGR-1 유전자의 5-nntranslatedregion (UTR)의 luciferase 리포터를 이용해서 apigenin 의한 EGR-1 promoter activity에 대한 효과를 분석한 결과 api-genine 매우 낮은 농도 (1-2 mM)에서도 EGR-1 promoter를 활성화 할 수 있었고, ERK 의 신호전달계를 저해하면 거의 완전하게 EGR-1 promoter activity를 감소시켰다 (Fig. 3). 결론적으로 apigenin에 의해 활성화된 ERK MAP kinase가 직접적으로 EGR-1의 발현과 전사활성화에 관여되어 지는 것으로 사료되어 진다.
따라서 apigenin에 의한 세포활성저해는 상당부분 EGR-1에 의해 매개된다는 것을 알 수 있다. 이런 EGR-1 매개의 세포독성효과의 연결 단백질을 분석하는 중 EGR-1에 의해 조절되는 세포증식억제 및 pro-apoptotic의 NAG-1 단백질이 24시간에서 현저하게 증가 되었으며 48시간에 현저히 증가되는 현상을 보였다 (Fig. 5A, 5B). 따라서 이런 지속적인 NAG-1의 발현은 현저한 종양세포활성의 저하에 관여 될 수 있다는 것을 암시한다.

후속연구

하지만 선행의 연구들에 있어서 EGR-1 이 직접적으로 NAG-1 을 유도하는 것은 밝혀져 있지 않고 대부분 초기에 일시적으로 유도되는데 비하여 apigenin의 경우 9-12시간의 비교적 후기의 발현이 며 이는 24-48시간에 나타나는 NAG-1 발현의 시 간대 에 더욱 직접적으로 영향을 미칠 가능성이 클 것으로 사료 된다. 따라서 향후 동물실험을 통하여 유전자 발현을 분석하고 EGR-1 이 직접적으로 대장암의 진행과 연관되는 것을 밝히는 것이 요구되어 진다.

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