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문제 정의
- 또한 폐수처리장에서 Bacillus 또는 포자 발아를 통한 오염물질 제거의 가능성을 시사한다. 특히 내생포자형성 세균의 생활사와 유기물 분해능력을 이해하고 Bacillaceae과에 속하며 분류학적 위치가 다른 Bacillus 균주들과 폐수처리장에서 주요 군집으로 분리된 균주를 대상으로 현장 실용성에 대한 연구가 진행되면 이들 군집의 폐수처리장 생태계에서의 역할에 대한 이해가 증대되고 폐수처리시설의 효율 개선에 도움이 될 것이다.
- 이어】, 본 연구에서는 내 생포자 형성과 발아단계를 중요한 특징으로 갖는 bacillus 의 두 가지 생활사에 따른 유기물 및 질소, 인 처리 능력에 관하여 알아보고자 하였다. 즉 Burk- holderia cepacia와 Bacillus의 유기물 제거능력을 알아보고, Bacillus의 영양세포와 내생포자의 제거능력을 비교하였다.
- 이에 본 연구에서는 Burkholderia cepacia와 6개의 Bacillus 균주 (KCTC 3627, KCTC 3007, A12, C21, F12, L1)를 배양하면서 MLSS, SCODcr, TN과 TP를 측정하여 Bacillus의 유기물 제거능력에 대해 알아보았다.
제안 방법
- 분리된 Bacillus sp.(C21, F12, N12)를 이용하여 영양세포 증식(replication)과 내 생포자의 발아(germination) 과정에서 유기물 제거능력 차이를 알아보았다. 배양과 측정 방법은 Burkholderia와 Bacillus의 유기물 제거 특성 비교실험과 동일하며, 포자 밀도는 포자 염색 방법으로 계수하였다.
- 85% NaCl 용액을 첨가하여 30°C에서 12시간 동안 진탕 배양하였다(starvation). 2% EDTA 용액에서 열처리와 냉각 (60°C↔30°C ↔4°C), 원심분리를 통한 세척 과정을 반복하면서 세포 밖으로 대량 분비되는 점액질의 세포외중합체(Exo polysaccharide) 를 제거하고 포자만을 수확하였다.20,13) 수확한 포자의 밀도는 nutrient agar plate에 도 말 배양하여 계수하거나 포자염색14)시료를 현미경 검경하여 확인하였다.
- 2% Nutrient Broth(CODa 2, 050 mg/L, TN 240 mg/L, TP 14 mg/L) 500 mL에 접종한 훅, 30°C 에서 150 rpm의 속도로 교반 배양하였다. 2시간 간격으로 배양액 30 mL을 분취하여 growth curve(optical density, 600 nm)를 측정하고, GF/C 여과지(Watman, England)로 MLSS를측정하고, 0.2 um syringe filter(Sartorius, Germany)로 여과한 시료의 SCODcr, TN, TP를 측정하였다(Qvis CS-200; C-mac, Korea). 또한, Nutrient agar plate에 도 말 배양하여 세균 밀도를 계수하거나, AODC(Acridine Orange Direct Count) 방법으로 17) 시료 1개 당 무작위로 10번(10 random fields) 이상 검경하여 균을 계수하였다.
- 분뇨처리장에서 분리한 Bacillus sp. C21, F12, N12 의 내생포자(10, spores/mL)와 영양세포(106 cells/mL)를 접종하고, 12시간 동안 세균의 성장(O.D)과 유기물(SCOD&) 및 질소(TN), 인(TP)의 제거능력을 측정하였다.내생포자를 접종한 경우 4시간부터 발아가 활발히 시작되었으며, 영양세포는 6시간에서 가장 빠른 성장 및 세포분열을 보였다(결 과 미제시).
- F12를 가지고 3회 반복 실험을 하였다. 대수기 성장단계의 영양세포를 접종(1()6 cells/mL)한 후 9〜12시간 동안 세균의 성장(O.D) 과 MLSS, 유기물(SCODc) 및 질소(TN), 인(TP)의 제거 능력을 측정하였다. 한 시간 동안의 미생 물량(MLSS) 당 유기물 제거율을 알아본 결과 Bacillus를 접종한 시료의 유기물 제거능력이 Burkholderia를 접종한 시료보다 뛰어남을 알 수 있었다 (Fig.
- 2 um syringe filter(Sartorius, Germany)로 여과한 시료의 SCODcr, TN, TP를 측정하였다(Qvis CS-200; C-mac, Korea). 또한, Nutrient agar plate에 도 말 배양하여 세균 밀도를 계수하거나, AODC(Acridine Orange Direct Count) 방법으로 17) 시료 1개 당 무작위로 10번(10 random fields) 이상 검경하여 균을 계수하였다.
- 이 배양액을 4 °C, 6, 500 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 Bacillus의 균체를 모았다. 수확한 Bacillus 균체를 포자 화 배지[Difco sporulation media: 0.8% Nutrient Broth, 13 mM KC1, 1 mM Ca(NO3)2, 1 mM MgSO4, 0.01 mM MnCl2, 1 gM FeSO4] 200 mL에 접종하였으며, 포자 생성 과정을 증진시킨다고 알려진 SiCh(최종농도 0.05 mM)을 포자화 배지에 첨가하였다 2,10)30℃에서 24시간 진탕배양한 후 85°C에서 15분 heat shock을 주고, 다시 30°C에서 24시간 진탕배양하여 영양분 부족과 열에 대한 stress로 포자화를 촉진시켰다.”) 또한, 다량의 포자를 빠른 시간 내에 획득하기 위해 Barbeau 등'12)의 plate filtration method를 병행하였다.
- 인 처리 능력에 관하여 알아보고자 하였다. 즉 Burk- holderia cepacia와 Bacillus의 유기물 제거능력을 알아보고, Bacillus의 영양세포와 내생포자의 제거능력을 비교하였다.
- 한편, 순수 배양된 미생물의 상태가 floc이 아닌 cell sus- pension일 가능성이 높아 SS 측정시 GF/C filter의 큰 공극으로 인하여 균체량의 정확한 측정이 어렵기 때문에 개체밀도에 따른 유기물비제거속도를 알아보았다. Burkholderia 와 Bacillus^ 105 cells/mL로 접종하고, 36시간 뒤 1节 cells/ mL로 개체 수가 비슷한 구간까지의 유기물비제거속도를 알아본 결과, 역시 Bacillus를 접종한 시료의 유기물 제거능력이 Bukholderia를 접종한 시료보다 뛰어남을 알 수 있었다 (Fig.
대상 데이터
- 4) Bacillus 균주로는 B3 system에서 보고되는 균주 중 Bacillus Group I에 속하는 Paenibacillus polymyxa(KCTC 3627) 균주와 Group II에 속하는 Bacillus megaterium(KCrTC 3007), B3 공법의 분뇨처리장으로부터 직접 분리한 Bacillus속 5개 균주 Bacillus sp.(A12, C21, F12, LI, N12)를 선정하여 실험하였다. 분리균주는 위상차현미경(Nikon, Japan)으로 포자 확인 후 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통해 Bacillus 균주임을 확인 하였다.
- 유기물 제거 실험을 위한 대조군 실험의 표준균주로 그람음성균이며, 유기물 및 난분해성 오염물질의 분해로 널리 알려져 있는 Burkholderia cepacia(KCTC 2966)를 이용하였다.4) Bacillus 균주로는 B3 system에서 보고되는 균주 중 Bacillus Group I에 속하는 Paenibacillus polymyxa(KCTC 3627) 균주와 Group II에 속하는 Bacillus megaterium(KCrTC 3007), B3 공법의 분뇨처리장으로부터 직접 분리한 Bacillus속 5개 균주 Bacillus sp.
이론/모형
- 유기물 제거능을 조사하기 위하여 MLSS, SCODcr, TN, TP 를 Standards Methods와'' 수질오염공정시험방법에16)따라 처리, 분석하였다.
- 05 mM)을 포자화 배지에 첨가하였다 2,10)30℃에서 24시간 진탕배양한 후 85°C에서 15분 heat shock을 주고, 다시 30°C에서 24시간 진탕배양하여 영양분 부족과 열에 대한 stress로 포자화를 촉진시켰다.”) 또한, 다량의 포자를 빠른 시간 내에 획득하기 위해 Barbeau 등'12)의 plate filtration method를 병행하였다.
- (C21, F12, N12)를 이용하여 영양세포 증식(replication)과 내 생포자의 발아(germination) 과정에서 유기물 제거능력 차이를 알아보았다. 배양과 측정 방법은 Burkholderia와 Bacillus의 유기물 제거 특성 비교실험과 동일하며, 포자 밀도는 포자 염색 방법으로 계수하였다.
성능/효과
- 일반적인 폐수처리장에서 Burkholderia는 유기물 및 난분해성 오염물질의 분해로 널리 알려져 있기 때문에 Burkhol deria cepacia를 대조군으로 하여 Bacillus 유기물 제거 특성을 조사하였다 B3 공법에서 보고되는 균주 Paenibacillus pofymyxa^ Bacillus megateriztm 의 표준균주, B3 공법의 분뇨처리장으로부터 분리된 Bacillus 균주 A12, C21, "을 1" cells/mL이 되도록 접종하고 48시간 뒤에 개체수와 제거된 SCODcr, TN, TP를 측정한 결과, 시간당 유기물 제거율은 B3 공법의 분뇨처리장으로부터 분리된 Bacillus 균주 C21 이 가장 높았으며, 모든 Bacillus 균주가 Burkholderia cepacia 보다 유기물비제 거 속도(specific removal rate)가 높았다(Table 1). B3 공법의 분뇨처 리장으로부터 분리된 Bacillus 균주인 A12는 가장 높은 비제거 속도를 보였다.
- 20)내생포자는 두꺼운 펩티도 글리칸 층을 뚫고 용출되며, 용균 과정에서 방출되는 독성물질로 병원균 등의 세포벽에 타격을 줄 수 있어 폐수처리 시설에서 위생적인 관점에서도 유리할 것으로 생각되며, 발아(germination)과정이 4 시간 정도로 매우 빨리 일어나기 때문에 이용성도 우수할 것이다.
- B3 공법의 분뇨처리장으로부터 분리된 5균주 모두 호기성 그람 양성세균이었으며, 위상차현미경 및 포자염색으로 내생포자를 확인할 수 있었다.
- Burkholderia 와 Bacillus^ 105 cells/mL로 접종하고, 36시간 뒤 1节 cells/ mL로 개체 수가 비슷한 구간까지의 유기물비제거속도를 알아본 결과, 역시 Bacillus를 접종한 시료의 유기물 제거능력이 Bukholderia를 접종한 시료보다 뛰어남을 알 수 있었다 (Fig. 2).
- 평균적으로 Bacillus?} Bu지하zolderia보다 2~5배 이상 미생물량(MLSS) 또는 개체당 유기물, 질소, 인 제거능력이 뛰어남을 알 수 있었다.
- 또한, 4개의 Bacillus 균주(KCTC 3007, C21, F12, N12) 모두에서 내생포자가 영양세포보다 유기물, 질소인 제거능력이 1.8 배 이상 우수했다.
- 본 연구 결과는 현장실무자들의 경험과 부합되는 결과로 유기물 및 질소, 인제거에 대한 Bacillus와 내 생포자의 중요성을 알 수 있었다. 향후 폐수처리장에서 Bacillus 공법 혹은 포자 발아 공법을 통한 오염물질 제거에 대한 가능성을 시사하며, 효율성이 입중되는 공정에서 Bacillus 균주의 분리, 배양 및 유기물 제거에 관한 지속적인 연구가 필요하다.
- 본 연구에서 Bacillus 균주는 Bwkholderia보다 유기물 제거능력과 질소인 제거능력이 뛰어날 뿐만 아니라, stationary phase에 도달하면서 EPS의 다량 생성과 침강성의 증가가 관찰되었으므로 침전지에서의 수확과정과 반송슬러지에서 내생포자의 안정성 등 폐수처리시설에 적용할 경우의 장점을 확인할 수 있었다.
- (A12, C21, F12, LI, N12)를 선정하여 실험하였다. 분리균주는 위상차현미경(Nikon, Japan)으로 포자 확인 후 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통해 Bacillus 균주임을 확인 하였다.
- 실험 결과, Bacillus가 Bnrkholderia보다 유기물 제거능력과 질소, 인 제거능력이 2-5배 이상 뛰어남을 알 수 있었다. 또한, 4개의 Bacillus 균주(KCTC 3007, C21, F12, N12) 모두에서 내생포자가 영양세포보다 유기물, 질소인 제거능력이 1.
- 3(a)).질소와 인의 경우에도, 내 생포자를 접종한 시료에서 영양세포보다 모두 4배 이상 비제거 속도가 뛰어남을 알 수 있었다(Fig. 3(b), (c)).
- D) 과 MLSS, 유기물(SCODc) 및 질소(TN), 인(TP)의 제거 능력을 측정하였다. 한 시간 동안의 미생 물량(MLSS) 당 유기물 제거율을 알아본 결과 Bacillus를 접종한 시료의 유기물 제거능력이 Burkholderia를 접종한 시료보다 뛰어남을 알 수 있었다 (Fig. 1).
후속연구
- Bacillus 영양세포의 성장단계와 내 생포자 발아 단계의 유기물 제거기작에 대해 자세히 알려진 바가 없으며, 실험 조건에 따라 상반된 결과가 도출될 가능성도 있으나, 본 연구 결과는 Bacillus가 우점된 공정의 현장실무자들의 경험과 부합되는 결과로 향후 내 생포자의 중요성과 다수 종으로 구성된 군집의 상호관계에 관한 연구가 더 필요할, 것으로 생각된다. 또한 폐수처리장에서 Bacillus 또는 포자 발아를 통한 오염물질 제거의 가능성을 시사한다.
- 특히 내생포자의 발아율은 환경조건과 함께 접종량의 영향을 받는다는 보고가 있으므로 향후 실험에서 충분한 발아 시간과 적절한 접종량의 고려가 필요할 것이다. 그러나 본 실험에서는 내생포자와 영양세포의 개체 수를 비슷하게 하여 동일한 배지에서 여러 종의 Bacillus를 통해 실험을 하였고, 모든 균주에서 내 생포자가 영양세포보다 높은 제거율을 보였기 때문에 내 생포자의 제거능력이 뛰어남은 Bacillus 분류군 전체의 특징 중 하나라 볼 수 있을 것이다.
- 10,19)그러므로 영양세포와 내생포자에게 모두 동일한 배지, 온도, 산소 공급 환경에서 유기물 제거 정도를 측정함으로써 환경 조건과 개체 수의 영향에 대한 확인이 필요하다. 특히 내생포자의 발아율은 환경조건과 함께 접종량의 영향을 받는다는 보고가 있으므로 향후 실험에서 충분한 발아 시간과 적절한 접종량의 고려가 필요할 것이다. 그러나 본 실험에서는 내생포자와 영양세포의 개체 수를 비슷하게 하여 동일한 배지에서 여러 종의 Bacillus를 통해 실험을 하였고, 모든 균주에서 내 생포자가 영양세포보다 높은 제거율을 보였기 때문에 내 생포자의 제거능력이 뛰어남은 Bacillus 분류군 전체의 특징 중 하나라 볼 수 있을 것이다.
- 또한 폐수처리장에서 Bacillus 또는 포자 발아를 통한 오염물질 제거의 가능성을 시사한다. 특히 내생포자형성 세균의 생활사와 유기물 분해능력을 이해하고 Bacillaceae과에 속하며 분류학적 위치가 다른 Bacillus 균주들과 폐수처리장에서 주요 군집으로 분리된 균주를 대상으로 현장 실용성에 대한 연구가 진행되면 이들 군집의 폐수처리장 생태계에서의 역할에 대한 이해가 증대되고 폐수처리시설의 효율 개선에 도움이 될 것이다.
- 알 수 있었다. 향후 폐수처리장에서 Bacillus 공법 혹은 포자 발아 공법을 통한 오염물질 제거에 대한 가능성을 시사하며, 효율성이 입중되는 공정에서 Bacillus 균주의 분리, 배양 및 유기물 제거에 관한 지속적인 연구가 필요하다.
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