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문제 정의
- 길경은 중국산과 한국산에 함유되어 있는 사포닌들의 양에 차이가 있으며, 중국 산에는 사포닌의 대부분이 platycodin。이고, 한국산에는 platycodin D, platycoside E, polygalacin D2, platycodin D3, platycodin D2 등이 많이 함유되어 있다(20). 그러므로 본 연구에서는 한국산 길경 추출물이 인슐린 작용을 향상시키는 인슐린 민감성 효과, 인슐린처럼 작용하는 인슐린성 물질로서의 효과, 포도당 자극에 의한 인슐린 분비능, 베타세포에서의 IRS-2 발현, 그리고 a-glu- coamylase의 억제제로의 효과가 있는 지 여부를 조사하였다.
- 본 연구에서 인슐린 민감성 물질을 탐색하는데 3T3-L1 지방세포를 사용한 이유는 3T3-L1 지방세포는 in vivo에 존재하는 대사성 피이드백 루프에 관련된 복잡한 문제와 연루되어 있지 않으면서 인슐린 수용체와 GLUT-4를 세포막에 가지고 있어 인슐린에 민감하게 반응하기 때문이다. 인슐린을 처리하면 3T3-L1 지방세포의 세포막에 인슐린이 결합하고 이것은 일련의 인슐린 신호전달체계인 IRS-1TPI3 kinaserAkt의 과정을 증폭시킨다.
- 본 연구에서는 3T3-L1 지방세포에 소량의 인슐린인 1 ng/mL과길경 분획물들을 처리하였을 때 50ng/mL 인슐린을 처리한 것과 같은 정도로 포도당의 흡수를 증가시키는 지를 조사하였다. 저농도(0.
- 그러나 민간요법에서 당뇨병 치료에 사용되고 있는 한약 재중에서도 아직까지 항당뇨 효과가 밝혀진 것은 많지 않고, 특히 어떤 기전으로 혈당을 낮추는지에 대한 연구는 많이 수행되지 않았다. 본 연구팀은 동의보감에서 당뇨병의 처방에 많이 사용하는 100여 종의 약초들을 중심으로 in vitro에서 항당뇨 특성을 가진 약재를 탐색하였다. 본 연구팀이 연구한 한약재 중에서 대황, 맥문동, 둥굴레 뿌리의 분획물에는 인슐린 민감성 물질이 함유되어있는 것을 .
제안 방법
- 향상시키거나, 5) a-glucoamylase 활성을 억제하는 물질로 작용하는 지 여부를 조사하였다. 길경 추출 분획물은 인슐린 성물 질로 작용하지 않았다.
- , Valencia, CA, USA)를 사용하여 quantitative real-time PCR를 iCycler PCR instrument(Bio-Rad Laboratories)에서 수행하여 IRS2, glucokinase와 PDX-1의 발현의 변화를 조사하였다. PCR 결과로부터 각각의 유전자의 상대적인 정량분석은 internal control인 cyclophilin에 대한 조사하고자 하는 유전자의 PCR의 생성물의 비로 계산하였다.
- , Austin, TX, USA)으로 합성하였다. QuantiTect SYBR Green PCR kit(Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)를 사용하여 quantitative real-time PCR를 iCycler PCR instrument(Bio-Rad Laboratories)에서 수행하여 IRS2, glucokinase와 PDX-1의 발현의 변화를 조사하였다. PCR 결과로부터 각각의 유전자의 상대적인 정량분석은 internal control인 cyclophilin에 대한 조사하고자 하는 유전자의 PCR의 생성물의 비로 계산하였다.
- 길경 1kg에 70% 에탄올 10L을 넣고 2 시간 열수로 2회 반복 주줄한 후 거즈로 여과하고 450 xg로 원심분리 (Megafhge 1.0R, Waltham, MA, USA)하여 상등액을 회전진공 농축기 (Buchi R-114, Haverhill, MA, USA)로 35P에서 감압농축한 후 동결건조(Ilshin Freeze dryer, Yangju-si, Korea)하여 분말 주줄시료를 만들었다. 열수분말추출시료 1g을 증류수 10mL에 현탁시켜 현탁액으로 만든 후, amberlite XAD-4 gel을 충진한 유지 컬럼 (직경: 30 mm; 길이: 300 mm)으로 정제하였다.
- 측정하였다. 길경 분획물을 Min6 세포에 8시간 동안 처리한 후 PBS로 세척하고, total RNA를 Trizol 용액 (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY, USA)을 이용하여 분리하였다. cDNA는 분리한 total RNA에 oligo dT primer로 사용하여 RET- ROscript kit(Ambion Inc.
- 길경 추출물 분획이 포도당 흡수에 미치는 영향을 조사하기 위해서 길경 추출물 분획을 DMSO에 1 mg/mL으로 녹인 후 이것을 PBS에 0.5와 5ug/mL로 희석시켜 두 가지 농도에서 포도당흡수 정도를 측정하였다. 길경의 각 분획에 인슐린 민감성 제재가 함유되어 있는 지의 여부를 조사하기 위해서 3T3-L1 지방세포에 인슐린 1 ng/mL과 함께 각 분획을 넣고 1시간 동안 배양한 후에 포도당 흡수 정도를 인슐린 50ng/mL을 처리한 결과와 비교하였다.
- 5와 5ug/mL로 희석시켜 두 가지 농도에서 포도당흡수 정도를 측정하였다. 길경의 각 분획에 인슐린 민감성 제재가 함유되어 있는 지의 여부를 조사하기 위해서 3T3-L1 지방세포에 인슐린 1 ng/mL과 함께 각 분획을 넣고 1시간 동안 배양한 후에 포도당 흡수 정도를 인슐린 50ng/mL을 처리한 결과와 비교하였다. 대조군으로 인슐린 0, 1 그리고 50 ng/mL을 사용하였고, 모든 실험은 3회 반복하였다.
- 이때 DMEM을 2일에 한번씩 교환하였다. 길경의 분획물에 인슐린성 물질이 함유되어 있는 지 여부는 5일 동안 배양한 후에 생성된 중성 지방 양을 측정하여 3T3-L1 섬유아세포가 지방세포로 분화되는 정도를 측정하였다. 중성지방의 농도는 중성 지방 측정 kit(Young Dong Pharm.
- 길경의 각 분획에 인슐린 민감성 제재가 함유되어 있는 지의 여부를 조사하기 위해서 3T3-L1 지방세포에 인슐린 1 ng/mL과 함께 각 분획을 넣고 1시간 동안 배양한 후에 포도당 흡수 정도를 인슐린 50ng/mL을 처리한 결과와 비교하였다. 대조군으로 인슐린 0, 1 그리고 50 ng/mL을 사용하였고, 모든 실험은 3회 반복하였다. 처리한 분획층이 인슐린의 작용에 관계없이 detergent로 작용하여 세포막을 파괴시켜 포도당흡수를 증가시키는 것을 배제하기 위해서 인슐린이 Ong/niL에서분리한 물질과 함께 포도당 흡수를 측정하였을 때 기저 (basal) 값보다 높은 것은 포도당 흡수를 증가시킨다고 해도 인슐린 민감성 제재로서의 작용이 없는 것으로 간주하였다(13, 14).
- 반응 후 생성되는 유리 포도당 양을 측정하여 a-glucoamylase의 활성을 측정하였다. 대조군은 길경 분획층의 용매인 DMSO만을 처리한 것에서 생성되는 유리 포도당 양으로 결정하였다. 결과는 DMSO만을 처리하였을 때 생성되는 유리 포도당 양에 비해 길경 분획층을 넣었을 때 유리 포도당의 생성이 감소되는 정도를 백분율(%)로 계산하였다.
- 민간요법에서 항당뇨 및 항비만 효과가 있는 것으로 알려진 길경의 항당뇨 효과가 있는 지 여부를 in viro에서 조사하기 위해서 길경을 70% 에탄올로 추출한 후 메탄올과 물을 섞은 용액으로 단계별로 XAD-4 column으로 분획하였다. 본 연구에서는 1) 3T3-L1 섬유아세포와 지방세포에서 길경의 추출 분획물이 인슐린처럼 작용하는 인슐린성 물질이거나, 2) 인슐린 작용을 향상시키는 인슐린 민감성 물질이거나, 또는 3) 포도당 자극에 의한 인슐린 분비를 향상시키거나, 4) 베타세포의 기능과 양을 증가시키는데 관여하는 유전자인 IRS-2, glucokinase, PDX-1의 mRNA 발현을 향상시키거나, 5) a-glucoamylase 활성을 억제하는 물질로 작용하는 지 여부를 조사하였다.
- 2 M 초산 용액을 넣어주었다. 반응 후 생성되는 유리 포도당 양을 측정하여 a-glucoamylase의 활성을 측정하였다. 대조군은 길경 분획층의 용매인 DMSO만을 처리한 것에서 생성되는 유리 포도당 양으로 결정하였다.
- 0R, Waltham, MA, USA)하여 상등액을 회전진공 농축기 (Buchi R-114, Haverhill, MA, USA)로 35P에서 감압농축한 후 동결건조(Ilshin Freeze dryer, Yangju-si, Korea)하여 분말 주줄시료를 만들었다. 열수분말추출시료 1g을 증류수 10mL에 현탁시켜 현탁액으로 만든 후, amberlite XAD-4 gel을 충진한 유지 컬럼 (직경: 30 mm; 길이: 300 mm)으로 정제하였다. 이때 용출액은 메탄올의 양을 증량 시켜 극성을 변화시키면서 H2O(PR1), 20% 메탄올(PR2), 40% 메탄올(PR3), 60% 메탄올(PR4), 80% 메탄올(PR5), 및 100% 메탄올(PR6)으로 나누어 분획하여 감압농축 후 동결건조하여 사용하였다.
- flask에 완전히 채워질 때까지 배양하였다. 이 세포를 ttypsin처리하여 flask에서 떼어 낸 후 혈구계산기(haemacytometer)로 계산된 5X 103 cells/mL의 세포를 24 well plate의 각 well에 넣고 phosphate buffer saline(PBS)로 세척한 후 1% bovine serum albumin(BSA) 을 함유하고 있는 고농도 포도당 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM) 배지에서 유도분화물질 중 인슐린(lOeg/mL) 을제외한 0.25 pM의 dexamethasone(DEX, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)과 0.5 mM의 1 -methyl-3-isobutylxanthine(IBMX, Sigma- Aldrich)와 함께 길경 분획 물을 각각 100 |ig/mL 첨가하여 5일간 배양하였다. 이때 DMEM을 2일에 한번씩 교환하였다.
- 열수분말추출시료 1g을 증류수 10mL에 현탁시켜 현탁액으로 만든 후, amberlite XAD-4 gel을 충진한 유지 컬럼 (직경: 30 mm; 길이: 300 mm)으로 정제하였다. 이때 용출액은 메탄올의 양을 증량 시켜 극성을 변화시키면서 H2O(PR1), 20% 메탄올(PR2), 40% 메탄올(PR3), 60% 메탄올(PR4), 80% 메탄올(PR5), 및 100% 메탄올(PR6)으로 나누어 분획하여 감압농축 후 동결건조하여 사용하였다. 각각의 분획 층은 10% DMSO에 Img/mL로 녹인 후 soni- cator로 20초 동안 진탕하여 침전물 없이 모두 용해시켰다.
- 그러므로 이들은 PPAR-Y agonist로 작용하는 물질을 함유할 가능성이 매우 높다. 인슐린 을 분비하는 세포인 Min6 세포에서 포도당 자극에 의한 인슐린 분비를 향상시키는 지 여부를 조사하였는데 20, 80 그리고 100% 메탄올층은 포도당 자극에 의한 인슐린 분비를 증가시켰다. 그 기전은 인슐린 분비와 베타세포의 증식에 관여하는 유전자의 IRS2, glucokinase 그리고 PDX-1의 mRNA의 양을 증가시키는 것과 관련이 있다.
- 길경의 분획물에 인슐린성 물질이 함유되어 있는 지 여부는 5일 동안 배양한 후에 생성된 중성 지방 양을 측정하여 3T3-L1 섬유아세포가 지방세포로 분화되는 정도를 측정하였다. 중성지방의 농도는 중성 지방 측정 kit(Young Dong Pharm., Seoul, Korea)로 측정하였다. 대조군은 길경 분획층을 용해시킨 용매인 DMSO를 길 경 분획물 대신 첨가하여 배양하였다.
- 대조군으로 인슐린 0, 1 그리고 50 ng/mL을 사용하였고, 모든 실험은 3회 반복하였다. 처리한 분획층이 인슐린의 작용에 관계없이 detergent로 작용하여 세포막을 파괴시켜 포도당흡수를 증가시키는 것을 배제하기 위해서 인슐린이 Ong/niL에서분리한 물질과 함께 포도당 흡수를 측정하였을 때 기저 (basal) 값보다 높은 것은 포도당 흡수를 증가시킨다고 해도 인슐린 민감성 제재로서의 작용이 없는 것으로 간주하였다(13, 14).
대상 데이터
- , Seoul, Korea)로 측정하였다. 대조군은 길경 분획층을 용해시킨 용매인 DMSO를 길 경 분획물 대신 첨가하여 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 길경은 한국산 Platycodon grandiflonm의 뿌리(Platycodi radix)로 서울 경동시장에서 2003년 10월에 구입한 후한 국한의 학연 구원에서 엄격하게 감별하고 선정한 것을 사용하였고, 일련 번호를 붙이고 한국한의학연구원 표본실에 보관하고 있다.
- 본 연구에서 사용한 3T3-L1 섬유아세포는 생물학적 특성이 잘 밝혀져 있고, 인슐린과 같은 유도물질의 존재하에서는 지방세포로 분화되는 특성을 갖고 있어 분화를 촉진하는 물질인 인슐린과 유사한 물질(인슐린성 물질)의 존재 여부를 탐색하는 실험에 사용하였다. 3T3-L1 섬유아세포는 인슐린, DEX와 IBMX로 조성된 분화유도물질을 첨가하였을 때 지방세포로 전환된다(6, 7, 13).
- 각각의 분획 층은 10% DMSO에 Img/mL로 녹인 후 soni- cator로 20초 동안 진탕하여 침전물 없이 모두 용해시켰다. 열 수분 말 추출물 1g에서 PR1, PR2, PR3, PR4, PR5, PR6를 각각 286, 121, 310, 118, 108, 57mg를 획득하였다.
데이터처리
- 각 군사 이의 평균값의 유의적 차이는 Tukey test로 검정하였다. Positive control군은 DMSO과의 차이를 two-sample t-testS- 검증하였다. 모든 통계 처리의 유의성 검증은 p<0.
- 다양한 parameter에서 길경 주줄 분획물의 효과는 one-way ANOVA방법으로 통계적 유의성을 검증하였다. 각 군사 이의 평균값의 유의적 차이는 Tukey test로 검정하였다. Positive control군은 DMSO과의 차이를 two-sample t-testS- 검증하였다.
- 대조군은 길경 분획층의 용매인 DMSO만을 처리한 것에서 생성되는 유리 포도당 양으로 결정하였다. 결과는 DMSO만을 처리하였을 때 생성되는 유리 포도당 양에 비해 길경 분획층을 넣었을 때 유리 포도당의 생성이 감소되는 정도를 백분율(%)로 계산하였다.
- 다양한 parameter에서 길경 주줄 분획물의 효과는 one-way ANOVA방법으로 통계적 유의성을 검증하였다. 각 군사 이의 평균값의 유의적 차이는 Tukey test로 검정하였다.
- 모든 결과는 세 번 반복에 대한 평균과 표준편차로 계산하여 나타내었다. 다양한 parameter에서 길경 주줄 분획물의 효과는 one-way ANOVA방법으로 통계적 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 인슐린을 분비하는 세포인 Min6 세포에서 IRS2 발현의 증가 여부와 베타세포의 기능과 밀접한 관련이 있는 glucokinase와 베타세포의 증식에 관여하는 PDX-1의 발현을 real-time RT-PCR 방법으로 측정하였다. 길경 분획물을 Min6 세포에 8시간 동안 처리한 후 PBS로 세척하고, total RNA를 Trizol 용액 (Life Technologies, Inc.
성능/효과
- Total RNA extracted from islets was reverse transcribed to make cDNA, and mRNA levels of IRS2, PDX-1, glucokinase and cyclophilin were measured using primer sets for full length of IRS2, PDX-1, glucokinase and cyclophilin genes by realtime PCR. The results represented the ratio of mRNA levels of gene of interest (IRS2, PDX-1 and glucokinase) and those of housekeeping gene (cyclophilin). a, b, c'dValues on the bars with different superscripts (a, b, c, d) were significantly different at p < 0.
- 그러므로 PR2, PR5, 그리고 PR6들은 insulinotropic 작용을 하는 물질을 함유하고 있는 것으루 사료된다. 결과적으로 IRS2, glucokinase, PDX-1의 발현 증가는 베타세포의 기능을 향상시켜 포도당 자극에 의한 인슐린 분비를 향상시킨 것으로 사료된다.
- Ko 등(23)의 연구에서 분화유도물질이 첨가되지 않은 경우에는 엄나무 추출물을 1 와 10ug/mL의 농도로 처리하였을 때 대조군에 비해 두 농도에서 모두 통계적으로 유의하게 분화를 촉진시켰다. 또한 분화유도물질과 함께 분화유도물질을 첨가하였을 때도 1 ug/mL서 분화를 촉진시켜 인슐린성 물질로 작용한다는 것을 알 수 있었다. 또한 Kameda 등(24)은 인슐린은 지방세포에서 지방분해를 저해하고 지방합성을 촉진하는 호르몬으로 인슐린처럼 지방합성을 촉진시키든지 지방분해를 억제하는 물질을 인슐린성 물질이라고 정의하였고 , 로얄제리로부터 불포화지방산 trans-10-hydroxy-2-decanoic acid와 마황의 non-pseudoephedrine0] 인슐린성 물질임을 확인하였다.
- 즉, 길경 분획층 중 PR1, PR2와 PR6는 인슐린의 필요량을 20-50배 감소시킨다는 것을 알 수 있었다. 메탄올 0%과 20%에서 용출된 분획층에 인슐린 민감성 물질이 함유되어 있다는 것을 알 수 있었고, 인슐린 민감성 물질의 후보자들은 극성의 물질이라고 예측할 수 있다. 인슐린을 첨가하지 않고 길경 분획층만을 넣은 상태에서 포도당을 흡수하는 정도를 측정하였는데 그 값이 기저값과 유사하거나 오히려 낮아 분획물이 세포막을 투과적으로 만드는 detergent로 작용하여 비특이적으로 포도당의 흡수를 증가시키는 것은 아니라는 것을 확인하였다.
- Krenisky 등(21)은 페루 전통의약식물 Otholobium pubescens에서 bakuchiol을 분리하여 인슐린 민감성에 관여하고 있는 물질이라고 보고하였고, Hong 등(22)은 인삼, 천문동, 황금, 지골피, 황백, 맥문동으로 구성된 혼합처방이 3T3-L1 지방세포에서 포도당 흡수를 증가시켰다고 보고하였다. 본 연구팀의 연구 결과에 따르면, 대황에 함유된 sennosides, rheins and rhaponticin는 항당뇨 효과를 가지는 것을 발표하였는데 그 기전은 rhaponticin와 rheir으 3T3-L1 지방 세포에서 인슐린 자극에 의한 포도당 흡수를 증가시켰고, 특히 rhaponticin는 섬유아세포를 지방세포로의 분화를 촉진시키고, 지방 죽적을 증가시키는 것으로 보아 PPAR-y agonist인 rosiglita- zone과 유사한 작용을 하였다(13). 맥문동에 함유된 homoisoflavone 은 3T3-L1 지방세포에서 IRS-lTPL-kinase 신호전달을 향상시켜지방세포에서 포도당 흡수를 증가시?!다는 것을 밝혔다(14).
- 메탄올 0%과 20%에서 용출된 분획층에 인슐린 민감성 물질이 함유되어 있다는 것을 알 수 있었고, 인슐린 민감성 물질의 후보자들은 극성의 물질이라고 예측할 수 있다. 인슐린을 첨가하지 않고 길경 분획층만을 넣은 상태에서 포도당을 흡수하는 정도를 측정하였는데 그 값이 기저값과 유사하거나 오히려 낮아 분획물이 세포막을 투과적으로 만드는 detergent로 작용하여 비특이적으로 포도당의 흡수를 증가시키는 것은 아니라는 것을 확인하였다.
- 1에서 보여 준 것처럼 3T3-L1 지방세포에 처리한 인슐린 농도가 50 ng/mL까지는 인슐린 농도는 높아짐에 따라 포도당 흡수가 증가하였으나, 그 이상의 인슐린 농도에서는 포도당 흡수가 더 이상 증가하지 않았다. 즉, 50 ng/mL 인슐린 농도가 인슐린 수용체를 통한 인슐린 작용을 나타내는 최대 농도로 이 농도 이하에서는 인슐린 농도에 비례하여 인슐린 작용이 증가하지만 그 이상 증가하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 그러므로 저농도의 인슐린과 탐색하고자 하는 물질을 처리하였을 때 포도당의 흡수가 현저하게 증가하는 경우는 처리한 물질을 인슐린 민감성 물질로 간주할 수 있다.
- 그 중에서도 5ug/mL의 PR2를 처리하였을 때는 50ng/mL의 인슐린을 처리한 것과 유사하게 증가시켰고, rosiglitazone을 처리한 것만큼 증가시켰다. 즉, 길경 분획층 중 PR1, PR2와 PR6는 인슐린의 필요량을 20-50배 감소시킨다는 것을 알 수 있었다. 메탄올 0%과 20%에서 용출된 분획층에 인슐린 민감성 물질이 함유되어 있다는 것을 알 수 있었고, 인슐린 민감성 물질의 후보자들은 극성의 물질이라고 예측할 수 있다.
후속연구
- 그 기전은 인슐린 분비와 베타세포의 증식에 관여하는 유전자의 IRS2, glucokinase 그리고 PDX-1의 mRNA의 양을 증가시키는 것과 관련이 있다. 결론적으로 길경은 지방 세포의 분화를 촉진하는 물질, 인슐린 민감성을 향상시키는 물질 그리고 베타세포의 기능 과 증식을 촉진시키는 물질을 함유하고 있으므로 우리나라 및 아 시아의 사람들에서 많이 유발되는 비만을 동반하지 않은 당뇨병 및 인슐린 저항성의 치료와 예방에 중요한 역할을 할 것으로 사 료된다.
- 나머지 분획층을 처리한 경우는 DMSO만을 처리한 대조군에 비해 지방 세포로의 전환을 촉진하거나 억제 하지 않았다. 즉, 길경은 지방의 생성을 향상시키는 물질을 함유되어 있는 것을 알 수 있었고, 어떤 기전에 의해서 지방 합성이 향상되는 지에 대한 연구를 수행할 것이다(Table 1).
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