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문제 정의
- 백색부후 균에 의한 난분해성물질들의 분해에는 lignin peroxidase, manganese dependent peroxidase, laccase 등의 리그닌 분해효소가 관여하는데(15), 이들의 기질 특이성이 낮아 다양한 방향족 화합물들을 분해할 수 있으며 특히 여러가지 물질들을 동시에 분해할 수 있다. 또한 백색부후균은 PAHs와 같은 난분해성 물질의 생분해에 있어 높은 분해율을 보이고 있으며, 본 연구에서는 분해율을 높이기 위해 분자적 접근방법으로 난분해성 물질의 분해에 관여하는 효소의 활성을 증가시키기 위해 효소유전자를 클로닝 하여 만든 형질전환체를 확보하고 야생형 균주와 생분해능을 비교함으로써 백색부후균의 생분해능 증대의 가능성에 대해 연구하였다.
- 오래 전부터 이러한 난분해성 물질의 분해에 있어 백색부후균을 이용한 사례들이 보고되기 시작하였고 분해 세균과 비교할 때 생분해에 다양한 장점을 갖기 때문에 최근까지 백색부후균을 이용한 난분해성물질의 생분해 연구는 활발히 진행되고 있다(2). 본 연구에서는 백색부후균의 난분해성 물질의 분해에 관여하는 효소를 과발현시킨 형질전환체와 야생형균주의 분해능 비교를 통해 형질전환을 통한 난분해성 물질의 보다 효율적인 분해 가능성을 증명하고자 연구를 진행하였다..
- 형질전환체 T. versicolor MrPl의 우수한 생분해능이 실제 토양에서도 유지되는지 알아보기 위해 토양환경에서의 생분해 능을 조사하였다. 멸균 토양에서는 T.
제안 방법
- versicolor MrPle 3. 18, 24, 38, 32와 21% 생분해하였다(Fig. 2). Phenanthrenee pH 3, 4, 5, 6과 7 조건에서 대조군에 의해 각각 12.
- 50 mg/L phenanthrene이 첨가된 20 ml YMG 액체배지에 T. versicolore 형질전환체 T. versicolor MrPl의 접종물을 0.5 ml 접종하고 온도(15~40℃), pH(3.O~8.O), 교반(130 rpm 진탕, 정치)을 달리하고 또한 5 mM veratryl ale아과 5 mM tryptophan을 각각 또는 함께 첨가하여 백색부후균의 phenanthrene 생분해에 미치는 영향을 조사하였다.
- 각각의 균주별로 생분해능의 증가를 위해 최적화한 환경 조건을 바탕으로 장기간의 배양기간 동안 생분해 양상과 균사체량의변화를 알아보기 위해 Kirk's basal salts medium의 변형배지에서 20일간 배양하며 분해양상과 균체량을 측정하였다. 20일간의 배양 기간 동안 균사체량의 증가는 형질전환체인 T.
- 강원대학교 내에서 토양(loam soil}을 채취하여 직경 2 mm의 채로 토양을 걸러 토양 100 g을 250 ml 비이커에 담고 채토건조법으로 토양의 함수량을 측정한 후 토양 수분보유능의 50~ 60%의 토양수분를 유지시키고 3(TC에서 20일간 배양한 후 Kayali-Sayadi 등(10)의 방법에 따라 잔류 phenanthrene을 정량하였다. 토양에서 phenanthrene의 추출은 100 g의 토양에 100㎖ 의 n-hexane을 첨가한 후 1시간동안 sonication을 시킨 뒤 유기용매를 따로 분리하여 10배 농축한 후 HPLC로 분석하였다.
- 6 mm 의 역상컬럼 (Phenomenex, USA)을 사용하였고 이동상은 gradient 조건으로 15분까지는 50% acetonitrile을 15분에서 25분까지는 100% acetonitrile을 흘려주었으며 25분부터 30분까지는 50% aceto-nitrile을 사용하였다. 농축한 시료는 pore 크기 0.45 ㎛의 syringe filter로 여과한 후 20]니를 autosampler (Waters 717 plus) 를 이용하여 주입하고 flow ratee 1 ml/min로 하여 254 nm 파장에서 UV dector를 사용하여 분석하였다.
- 분리된 methylene chloride 10 ml을 잔류 phenanthrene의즉정을 위해 회전진공증발기를 이용하여 0.5 ml로 농축하고 HPLC (Waters, Breeze Model, USA)를 이용하여 분석하였으며 분석 조건은 다음과 같다. 컬럼은 Gemini 5g C18 150X4.
- 생분해능을 증대시키기 위하여 생분해 조건을 최적화하는 실험을 진행하였다. 먼저 YMG배지에서 배양방법(정치, 130 rpm 진탕)을 달리하여 2일간 생분해 실험을 수행한 결과 형질전환체 T.
- 1 %의 생분해능을 나타냈다. 온도가 phenanthrene 생분해에 미치는 영향에 대해서는 대조군은 15, 20, 25, 30, 35와 40℃ 조건에서 phenanthrene을 각각 10, 20, 25, 29, 14와 4% 생분해하였으며 T. versicolor MrPle 3. 18, 24, 38, 32와 21% 생분해하였다(Fig.
- 조사된 phenanthrene의 생분해 최적조건을 바탕으로 Kirk's basal salts medium의 변형배지에 phenanthrenee 50 mg/L 첨가한 후 20일간 배양하면서 phenanthrene의 분해량과 균체량의 변화를 측정하였다. 대조군과 T.
- 토양에서 phenanthrene의 추출은 100 g의 토양에 100㎖ 의 n-hexane을 첨가한 후 1시간동안 sonication을 시킨 뒤 유기용매를 따로 분리하여 10배 농축한 후 HPLC로 분석하였다.
대상 데이터
- PAHs의 한 종류로서 환경에 많이 존재하며 PAHs 오염의、지표로 사용되는 phenanthrene (4)을 대상으로 강원대학교 미생물 생리학 실험실로부터 분양받은 Trametes versicolor (구름버섯)의 형질전환체들인 T. versicolor MrPl 과 MrP13 (manganese repressed peroxidase 과발현 균주) 및 T. versicolor MnP2-6 (manganese dependent peroxidase 과발현 균주)과 야생형 균주와 비교해 phenanthrene 생분해 우수균주를 선별하였다. YMG배지에서 6일간의 배양기간 동안 phenanthrene에 대한 분해능이 우수한 균주는 T.
- Trametes versicok”.의 유전체 내로 각각 다시 삽입시켜서 MnP를 과발현시킨 MnP2-6와 MrP를 과발현시킨 Mrpl과 MrP13 균주(12, 20)를강원대학교 미생물생리학 실험실로부터 분양받았다 .
- 5 ml로 농축하고 HPLC (Waters, Breeze Model, USA)를 이용하여 분석하였으며 분석 조건은 다음과 같다. 컬럼은 Gemini 5g C18 150X4.6 mm 의 역상컬럼 (Phenomenex, USA)을 사용하였고 이동상은 gradient 조건으로 15분까지는 50% acetonitrile을 15분에서 25분까지는 100% acetonitrile을 흘려주었으며 25분부터 30분까지는 50% aceto-nitrile을 사용하였다. 농축한 시료는 pore 크기 0.
이론/모형
- 백색부후균의 분해효소 중의 하나인 manganese dependent peroxidase (MnP)와 manganese repressed peroxidase (MrP)의 효소 유전자인 nwzp와 tnrp를 제한효소-매개 삽입 법 (restriction enzyme-mediated integration)을 이용하여 구름버섯 Trametes versicok”.의 유전체 내로 각각 다시 삽입시켜서 MnP를 과발현시킨 MnP2-6와 MrP를 과발현시킨 Mrpl과 MrP13 균주(12, 20)를강원대학교 미생물생리학 실험실로부터 분양받았다 .
성능/효과
- 배양하며 분해양상과 균체량을 측정하였다. 20일간의 배양 기간 동안 균사체량의 증가는 형질전환체인 T. versicolor MrPl이 야생형 대조군 균주에 비해 높았으며 (Fig. 5), 그에 따라 phenanthrene의 생분해능 또한 우수하였는데 T. versicolor MrPl 과 대조군은 각각 91.2과 59.4%까지 분해하였으며 T. versicolor MrPle 대조군에 비해 30.8% 더 우수한 생분해능을 나타내었다 (Fig. 4). Phenanthrene의 생분해는 MrPl과 대조군 모두 배양 10 일까지 증가한 후 더 이상 증가하지 않는 양상을 나타내었는데생분해에 따른 유기산 등의 독성 대사산물의 축적 때문인 것으로 추정된다.
- T. versicolore 형질전환체 T. versicolor MrPl에 대한 phenanthrene 생분해 연구 결과 형질전환체 T. versicolor MrPl는 여러 조건에서 우수한 생분해능을 나타내었다. 이러한 결과는 난분해성 물질의 생분해에 있어 분자적 방법을 이용한 형질전환체의 사용이 실험실내 뿐만 아니라 실제 환경에서까지 특히 초기 생분해 능을 증가시킬 수 있다는 근거를 제시하였으며 이와 같은 연구를 바탕으로 생분해능의 증대를 위한 다양한 형질전환체의 개발과 생분해능의 증대를 위한 다양한 조건들을 확립해 나가야 할 것이다.
- 4%)을 나타내었다. Veratryl alcohol과 tryptophan을 5 mM 첨가하면 모든 실험조건에서 phenanthrene의 생분해능이 11-20.9% 증가되었고 T. versicolor MrPl의 생분해능은 대조군보다 11-24% 더 높았다. 특히 veratryl alcohol과 tryptophan을 동시에 처리한 경우 대조군은 12.
- YMG 액체배지에서 phenanthrene을 기질로 하여 배양조건을 달리하여 2일간의 생분해 실험을 수행한 결과 정치배양에서는 형질전환체 T. versicolor MrPl이 3.7%, 대조군은 7.8%의 생분해 능을 보였으나 진탕배양에서 T. versicolor MrPle 39.4%, 대조군은 28.1 %의 생분해능을 나타냈다. 온도가 phenanthrene 생분해에 미치는 영향에 대해서는 대조군은 15, 20, 25, 30, 35와 40℃ 조건에서 phenanthrene을 각각 10, 20, 25, 29, 14와 4% 생분해하였으며 T.
- versicolor MnP2-6 (manganese dependent peroxidase 과발현 균주)과 야생형 균주와 비교해 phenanthrene 생분해 우수균주를 선별하였다. YMG배지에서 6일간의 배양기간 동안 phenanthrene에 대한 분해능이 우수한 균주는 T. versicolor MrPl 이었으며 대조군인 야생형 균주에 비해 특히 배양 초기에 높은 분해율을 보였다(Fig. 1). 백색부후 균인 Phanerochaete chrysosporiume 배양 27일 만에 첨가된 phenanthrene< 70-100% 분해한다고 보고되었고(15), Pleurotus ostreatns는 배양 11일째에 첨가한 phenanthrene의 94%를 제거한다고 알려졌다(3).
- 이러한 결과는 비멸균 토양에 존재하는 다양한 미생물과의 상호작용으로 인해 phenanthrene의 생분해가 촉진된 것으로 사료된다. 구름버섯 형질전환체에 의한 토양에서의 생분해는 혐기적 조건하에서 phenanthrene의 생분해 시 20일간 90% 정도 분해한 결과(5)보다 우수하였으며 배양^지에서의 결과와 유사하게 phenanthrene의 초기 생분해가 야생형 대조군보다 높았다. 배 양 후반부에 형 질전환체와 대조군 토양의 생분해가 유사해진 것 또한 다른 분해미생물들의 생분해 및 secondary population에 의한 분해산물의 제거로 인한 결과로 추정된다 (1).
- 다핵방향족 탄화수소인 phenanthrene을 50 mg/L의 농도로 YMG 액체 배지에 첨가하고 대조군인 야생형 T. versicolore T. versicolor의 형질전환체들을 접종하여 3일 동안 배양한 결과 대조군, T. versicolor MrPl, MrP13과 MnP2-6은 각각 40, 80, 75 와 19%의 phenanthrene 생분해를 나타냈고 T. versicolor MrPl 은 대조군보다 40% 정도 phenanthrene 제거능이 더 우수하였다 (Fig. 1). 배양 6일째에는 T.
- 측정하였다. 대조군과 T. versicolor MrPl 모두 10일째까지 각각 59.4와 91.2%의 phenanthrene 제거를 나타내었고 그 이후부터 배양 종료까지의 생분해는 크게 증가하지 않았다(Fig. 4). 동일한 배양조건에서 즉정한 균체량도 T.
- 4). 동일한 배양조건에서 즉정한 균체량도 T. versicolor M1P1 이 더 높게 측정되었다(Fig. 5).
- 9%의 phenanthrene 생분해능이 증가되었다. 두 균주에 의한 phenanthrene 생분해에 tryptophan0] veratryl ale 아 1이 보다 3-5% 정도 생분해능을 더 증가시키는 것으로 나타났다(Fig. 3).
- versicolor MrPl의 phenanthrene 생분해 시료에 첨가하여 그 효과를 조사하였다. 두 첨가물에 의해 £ versicolor MrPl의 생분해능은 대조군보다 8.5% 더 증가하였다. 뿐만 아니라 두 균류에 의한 phenanthrene 생분해에 tryptophan이 veratryl alcohol보다 3-5% 정도 생분해능을 더 증가시키는 것으로 나타났으며(Fig.
- 진행하였다. 먼저 YMG배지에서 배양방법(정치, 130 rpm 진탕)을 달리하여 2일간 생분해 실험을 수행한 결과 형질전환체 T. versicolor MrPl과 대조군 모두 진탕배양 시에 25~30% 분해율이 증가하였다. 이러한 결과는 PHAs의 호기적 대사 과정에서 monooxygenase와 dioxygenase를 이용한 초기 벤젠고리의 산화를 위해 산소가 절대적으로 필요하다는 것을 보여준다(8).
- versicolor MrPl의 우수한 생분해능이 실제 토양에서도 유지되는지 알아보기 위해 토양환경에서의 생분해 능을 조사하였다. 멸균 토양에서는 T. versicolor MrPl과 대조군은 5 일부터 10일 사이부터 분해가 시작되어 각각 95.7과 94.3% 분해하였으며(Fig. 6), 비멸균 토양에서는 T. versicolor MrPle 멸균토양보다 일찍 phenanthrene 분해가 일어났으며, 5일째에 T. versicolor MrPl과 대조군은 각각 60과 52% 분해하였으며 형질전환체의 분해율이 8% 정도 높았다. 하지만 10일 동안의 배양 결과 96.
- 1). 배양 6일째에는 T. versicolor의 야생형과 MrPl 및 NrP13과의 분해능 차이가 줄어들었지만 T. versicolor Mr Pl의 분해능이 야생형보다높았다.
- 배양온도를 최적화하기 위해 위와 동일한 조건으로 실험을 수행한 결과 대조군은 Han 등(9)의 결과와 동일하게 25와 3 CTC에서 phenanthrene 생분해가 모두 잘 일어났으며 T. versicolor MrPle 35와 40℃ 조건에서도 대조군의 25와 30℃에서의 생분해 능과 비슷한 높은 분해능을 나타내어 전체적으로 야생형에 비해 높은 온도에서 생분해가 잘 일어나는 것으로 변화되었다(Fig. 2). 따라서 높은 온도에서의 생분해에 이런 형질전환체의 이용이 보다 유리할 것으로 생각된다.
- 배지 환경에서 형질전환체 T. versicolor MrPle 야생형 대조군 균주에 비해 우수한 phenanthrene 초기 분해능을 나타냈다. 실제 토양에서도 대조군에 비해 T.
- 따라서 높은 온도에서의 생분해에 이런 형질전환체의 이용이 보다 유리할 것으로 생각된다. 배지의 초기 pH가 생분해에 미치는 영향을 조사한 결과 중성(pH 7.0) 조건을 제외한 모든 조건에서 T. versicolor MrPl의 생분해능이 대조군보다 높았지만 오차범위를 크게 벗어나지 못하는 정도였으며, pH 6.0에서 최고생분해 능(31.4%)을 나타내었는데 이 경향은 Han 등⑼의 보고와 일치하였다.
- versicolor MrPle 야생형 대조군 균주에 비해 우수한 phenanthrene 초기 분해능을 나타냈다. 실제 토양에서도 대조군에 비해 T. versicolor MrPl의 우수한 분해능이 유지되는지 알아보기 위해 실험한 결과 멸균 토양과 비멸균 토양에서 각각 95.7과 96.3%의 높은 phenanthrene 제거를 보였으며 (Figs. 6 and 7) 멸균 토양에 비해 비멸균 토양에서의 생분해가 더 빨리 진행되었다. 이러한 결과는 비멸균 토양에 존재하는 다양한 미생물과의 상호작용으로 인해 phenanthrene의 생분해가 촉진된 것으로 사료된다.
- 백색부후 균인 Phanerochaete chrysosporiume 배양 27일 만에 첨가된 phenanthrene< 70-100% 분해한다고 보고되었고(15), Pleurotus ostreatns는 배양 11일째에 첨가한 phenanthrene의 94%를 제거한다고 알려졌다(3). 이에 비하여 T. versicolor MrPl과 T. versicolor MrPl3은 3일의 짧은 기간 동안 75~80% 이상의 높은 phenanthrene 생분해능을 보였으며 이 형질전환체들은 다른 분해 균주들보다 우수한 phenanthrene 생분해 능력을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있다. T.
- 6% 제거되었다. 중성 (pH 7.0) 조건을 제외한 모든 조건에서 T. versicolor MrPl의 생분해능이 대조군보다 높았으며, pH 6.0에서 최고 생분해 능(31.4%)을 나타내었다. Veratryl alcohol과 tryptophan을 5 mM 첨가하면 모든 실험조건에서 phenanthrene의 생분해능이 11-20.
- versicolor MrPl의 생분해능은 대조군보다 11-24% 더 높았다. 특히 veratryl alcohol과 tryptophan을 동시에 처리한 경우 대조군은 12.4%, 형질전환체 T. versicolor MrPle 20.9%의 phenanthrene 생분해능이 증가되었다. 두 균주에 의한 phenanthrene 생분해에 tryptophan0] veratryl ale 아 1이 보다 3-5% 정도 생분해능을 더 증가시키는 것으로 나타났다(Fig.
후속연구
- versicolor MrPl3은 3일의 짧은 기간 동안 75~80% 이상의 높은 phenanthrene 생분해능을 보였으며 이 형질전환체들은 다른 분해 균주들보다 우수한 phenanthrene 생분해 능력을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있다. T. versicolor 야생형 균주는 배양 6일째에 형질전환체들과 유사한 분해율을 나타내었지만 접종미생물은 특히 초기 분해에 중요한 역할을 하므로(1) 형질전환체의 초기 생분해능은 실제 난분해성 오염물질의 제거에 중요한 역할을 할 수 있을 것이다.
- versicolor MrPl는 여러 조건에서 우수한 생분해능을 나타내었다. 이러한 결과는 난분해성 물질의 생분해에 있어 분자적 방법을 이용한 형질전환체의 사용이 실험실내 뿐만 아니라 실제 환경에서까지 특히 초기 생분해 능을 증가시킬 수 있다는 근거를 제시하였으며 이와 같은 연구를 바탕으로 생분해능의 증대를 위한 다양한 형질전환체의 개발과 생분해능의 증대를 위한 다양한 조건들을 확립해 나가야 할 것이다.
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