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문제 정의
- aureus의 coagiHase 혈청형과 유전자 변이에 관한 지속적인 연구는 거의 없는 실정이다. 저자들은 집단생활을 하는 건강한 학생들을 대상으로 주기적으로 비강에서 S. aureus의 분리율과 항생제 내성율을 조사하면서, 임상 검체에서 분리된 균주와 함께 coagulase 혈청형을 분석한 결과 흥미로운 변화를 관찰할 수 있었기에 소개하고자 한다.
제안 방법
- aureus의 일차 분리 동정은 보통 한천배지에 접종하여 자란 황색집락을 선택, 순수분리 배양하였고, 그람염색, coagulase 시험, catalase 시험, mannitol salt agar 시험으로 선별하였다. 선별된 S. aureus의 동정과 항생제 감수성 시험은 Dade Behring Dried Positive Combo Panel type 1A (MicroScan, Dade International Inc., USA)로 시험하였다. 임상검체에서 분리 동정된 S.
- , USA)로 시험하였다. 임상검체에서 분리 동정된 S. aureus는 위와 동일한 방법으로 재동정하여 확인하였다.
- 선별하였다. MacFarland No.0.5의 탁도로 세균부유액을 만든 후 면봉으로 Mueller-Hinton 배지상에 고르게 도말한 후 1 ㎍/ml oxacillin 디스크 (BBL, microbiology system, Cockeyville, MD, US A)을 놓고 35℃에서 18~24시간 배양하여 억제대의 직경이 10 mm 이하인 집락을 MRSA로 판정하였다. MRSA 로 판정된 균주에서 methicillin 내성 mecA 유전자를 확인하기 위하여 균체 DNA 추줄은 AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (BIONEER Co.
- aureus의 coagulase 혈청형 분석은 8종(Type I-VIU)의 항혈청 (Denka Seiken Co, Tokyo Japan)을 사용하여 Hwang 등(16)의 방법으로 분석하였다. 보통한천배지에 자란 한 집락을 5 ml Brain Heart Infusion broth (BHI)에 접종하여 37℃ shaking incubator에서 하루밤 배양한 후, 0.1 ml의 균배양액을 새로운 5ml BHI broth에 접종하여 4~5시간배양을 하여 균의 농도가 108 CFU/ml 되게 조정하여, 6,000Xg, 20분 동안 원심 분리하여 그상층액 을 분석 시 료로 사용하였다. Coagulase 기 질용액 으로는 Polyethylene glycol-Aminocarpronic acid-Fibrinogen (PAF) 를 사용하였다(16).
- Japan) 각각 10 μl 취하고, 시료 10 μl를 각 항혈청이 들어 있는 well에 가하여 가볍게 혼합한 다음 실온에서 5분 방치하였다. 그 다음으로 PAF 기질용액을 각 well에 20 μl 넣은 후 37℃ incubator에서 2시간이후 부터 30분 간격으로 형특이 coagulase와 항혈청간의 중화 반응에 의한 웅고억제반응 여부를 관찰하였다. 대조균주로는 Cowan I (IV형) 균주와 기존 균주를 사용하였다.
대상 데이터
- 부산시 소재 3개 종합병원의 임상검체에서 분리 동정된 methicillin 내성 S. aureus (MRSA) 408주(1994년 ~2005년)와 methicillin 감수성 S. aureus (MSSA) 61 주(2005년)를 수집하였고, 건강한 20대 남녀대학생 890명(1994년~2000년)과 유치원생 261 명(2005년)의 1, 151명을 대상으로 비강 검체에서 분리 동정된 MSSA 246주를 포함하여 총 715주를 실험균주로 사용하였다. 임상 균주가 분리된 검체의 종류는 농, 귀 분비물, 객담, 혈액, 뇨, 기타 순이었으며, 화농성 검체가 70%로 대부분을 차지하였다.
- 1 ml의 균배양액을 새로운 5ml BHI broth에 접종하여 4~5시간배양을 하여 균의 농도가 108 CFU/ml 되게 조정하여, 6,000Xg, 20분 동안 원심 분리하여 그상층액 을 분석 시 료로 사용하였다. Coagulase 기 질용액 으로는 Polyethylene glycol-Aminocarpronic acid-Fibrinogen (PAF) 를 사용하였다(16). U-microplate 각 well에 항혈청 8종(Type I-VUI, Denka Seiken Co.
- 그 다음으로 PAF 기질용액을 각 well에 20 μl 넣은 후 37℃ incubator에서 2시간이후 부터 30분 간격으로 형특이 coagulase와 항혈청간의 중화 반응에 의한 웅고억제반응 여부를 관찰하였다. 대조균주로는 Cowan I (IV형) 균주와 기존 균주를 사용하였다.
이론/모형
- , Seoul, KoreaX 이용하여 분리하였으며. Murakami 등(26) 의 방법에 따라 primer는 5'-AAAATCGATGGrAAAGGTTGC-3', S'-AGrrCTGCAGIACCGGAnTGC-S' (BIONEER Co. Ltd., Seoul, Korea)을 사용하여 중합효소연쇄반응에 의한 증폭산물인 533 bp 의 mecA 유전자를 확인하였다.
- S. aureus의 coagulase 혈청형 분석은 8종(Type I-VIU)의 항혈청 (Denka Seiken Co, Tokyo Japan)을 사용하여 Hwang 등(16)의 방법으로 분석하였다. 보통한천배지에 자란 한 집락을 5 ml Brain Heart Infusion broth (BHI)에 접종하여 37℃ shaking incubator에서 하루밤 배양한 후, 0.
- NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) 지침(27)에 따라 디스크 확산법으로 MRSA균주를 선별하였다. MacFarland No.
성능/효과
- Table 1과 같다. Coagulase II형이 34.1%로 가장 분리율이 높았으며, 다음으로 IV형(23.6%), VH형(14.8%), V형(12.4%), HI형 (8.8%), I형(2.8%), VUI형(1.4%), VI형(0.7%)의 순이었으며, 혈청형이 결정되지 않은 형(ND)이 1.4%를 차지하였다. 임상검체에서 분리된 methiciffin 내성 S.
- 4%를 차지하였다. 임상검체에서 분리된 methiciffin 내성 S. aureus (MRSA) 총 408균주의 coagulase 혈청형별 특성를 살펴보면(Table 2), 가장 분리율이 높은 혈청형은 II형(54.3%, 222/408)이었으며, 다음으로 IV형(24.7 %), m형(10.9%), V형(5.2%), VII형(2.7%), I형(1.2%), ND(0.7%) 순으로 나타났으며, VUI형은 분리되지 않았다. 연도별 각 형별 변화에서, II형의 경우 1994년: 53% (61/115), 1997년: 46.
- 8%) 순으로 나타났다. 이와같은 결과는 MRSA 균주에서의 coagulase 혈청형 특성과 상당한 차이가 있음을 확인 할 수 있었다. 건강인의 비강에서 분리된 MSSA균주의 연도별 변화를 살펴보면(Table 3), V형의 경우 1994년 7.
- 반면에 U형은 점차 감소하여 2005년 균주에서는 검출되지 않았다. 건강인의 비강에서 분리된 MSSA 균주와 임상검체에서 분리된 MSSA 균주의 coagulase 혈청형을 비교하기 위하여 임상균주 61(2005년)의 혈청형을 분석한 결과(Table 3), V형이 29.5%(18/61)로 가장 많았으며, II형은 분리되지 않았다. MSSA 균주에서 V형 증가와 II형의 분리율의 감소는 검체의 종류에 관계없이 coagulase 혈청형 특성을 나타내고 있음을 확인하였다.
- 5%(18/61)로 가장 많았으며, II형은 분리되지 않았다. MSSA 균주에서 V형 증가와 II형의 분리율의 감소는 검체의 종류에 관계없이 coagulase 혈청형 특성을 나타내고 있음을 확인하였다.
- aureus의 특성과 관련성이 있을 것으로 추정되어, 앞으로 분자 역학적 연구가 이루어져야 할 부분으로 생각된다. S. aureus 715주의 coagulase 혈청형을 Hwang 등(16)의 방법에 따라 분석한 결과, 간편하고, 경제적이며, 재현성 있는 결과를 얻었을 수 있음을 재확인하였다 . S.
- 10여 년 기간동안 임상검체와 건강인의 비강에서 분리된 S. aureus의 coagulase 혈청형를 분석하여 비교한 결과, methicillin 내성 균주와 methicillin 감수성 균주의 coagulase 혈청형의 큰차이가 있음을 확인하였고, 실험연도별 coagulase 혈청형의 변화를 관찰할 수 있었다. 특히 coagulase 항원성 변화에 따른 V형 균주의 증가와 methicilUn 내성 V형 균주의 출현 결과는 지역사희 감염과 연관된 새로운 MRSA 유행균주의 가능성을 시사하는 것으로 사료되며, SCCmec형 분석을 비롯하여 MRS A의 다양한 분자역학적 연구에 기초자료로 이용될 수 있으리라 기대한다.
후속연구
- MRSA의 새로운 변이종, 유행 균주 등에 관한 역학적 연구에 SCCmec type의 연구가 많이 이루어지고 있다(32). 본 연구결과에서 S. aureus coagulase 항원성 변화에 의한 V형의 증가와 methicillin 내성을 갖는 coagulase V형 균주의 출현은 숙주의 면역환경에 대처하기 위한 병원성균의 진화과정의 하나로 생각되어지며, 지역사회 감염 S. aureus의 특성과 관련성이 있을 것으로 추정되어, 앞으로 분자 역학적 연구가 이루어져야 할 부분으로 생각된다. S.
- aureus 715주의 coagulase 혈청형을 Hwang 등(16)의 방법에 따라 분석한 결과, 간편하고, 경제적이며, 재현성 있는 결과를 얻었을 수 있음을 재확인하였다 . S. aureus coagulase 혈청형 분석은 분자역학적인 방법인 random amplified polymorphism DNA analysis (RAPD) 연구에서 유의성 있는 결과를 얻었고(17), S. aureus 균주의 생물학적 특성의 기초자료로 활용될 수 있으리라 사료된다.
- aureus의 coagulase 혈청형를 분석하여 비교한 결과, methicillin 내성 균주와 methicillin 감수성 균주의 coagulase 혈청형의 큰차이가 있음을 확인하였고, 실험연도별 coagulase 혈청형의 변화를 관찰할 수 있었다. 특히 coagulase 항원성 변화에 따른 V형 균주의 증가와 methicilUn 내성 V형 균주의 출현 결과는 지역사희 감염과 연관된 새로운 MRSA 유행균주의 가능성을 시사하는 것으로 사료되며, SCCmec형 분석을 비롯하여 MRS A의 다양한 분자역학적 연구에 기초자료로 이용될 수 있으리라 기대한다.
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