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문제 정의
- 계내금 효소의 온도 안정성을 알아보기.위해 40, 50, 60, 70℃에서 계내금 효소액을 10분 동안 예열시킨 후 4℃에서 방치한 후 반응이 종료된 효소의 활성도를 측정하였다.
- 선택, 육성하고 있다. 계내금은 소화제로 많이 이용하고 있으며, 예비실험 결과 단백질 함량이 높아 산업적 효용 가치가 높은 효소제로 개발 가능성이 있으므로 본 논문에서는 계내금에서 단백질 분해 효소를 정제하고, 그 정제 효소의 특징을 조사하였다.
- 이 외에 固澀止遺 효과가 있어 遺尿, 遺精을 치료하고, 通 淋利尿하여 石淋을 치료하며, 淸熱止煩하여 煩 熱을 없애고, 散結消瘀하여 度癖, 癥痂, 經閉, 眼翳, 小兒 疳積을 치료하는 효능이 있다勿 계내금을 분석한 결과, ventriculin이 함유되어 있어서 胃液分泌를 촉진하며, keratin에는 糖蛋白質을 일부 함유하고 있다는 보고 5와 본 연구실에서 수행한 실험 결과, 계내금은넓은 범위의 온도와 pH 영역에서 매우 안정된 반응을 보였으며, 특히 대부분의 효소가 중성 영역에서 최적 활성을 갖는데 비해 계내금 조효소액은 耐酸性 효소였으며, 내염성도 강하게 나타났다. 따라서 본연구에서는 본초학적 규격의 기본 연구인 계내금 추출물의 효소학적 특성을 밝힌 선행 연구를 기본으로계내금의 약재 진위와 양품 검사에 활용할 수 있는 구체적 연구를 위해 계내금에서 유래하는 내산성 단백질 분해 효소를 정제하고, 그 정제 효소의 특성을 조사하였기에 보고하는 방이다.
제안 방법
- 5H2O, ZnS04 . 7H2O, MnSO4 - 4H2O, MgSO4 - 7H2O, FeS04의 금속 염류를 대상으로 10-3 M에서 효소 활성도를 조사하였다. 각 금속 염류 용액의 조제는 상기 농도의 용액을 pH 3(HC1 로조절)의 증류수에 용해하였다.
- 위해 40, 50, 60, 70℃에서 계내금 효소액을 10분 동안 예열시킨 후 4℃에서 방치한 후 반응이 종료된 효소의 활성도를 측정하였다. pH에 대한 계내금 효소의 안정성을 조사하기 위해 McDvaine buffer의 0.1 M citric acid와 0.2 M Na2HPO4를 이용하여 pH를 1.0~8.0 으로 조절한 후 각각의 pH buffer 1 mL과 계내 금효 소액 1 mL을 혼합하여 40℃에서 3시간 처리한 후 pH(l N HC1 로 조절)를 약 2~3까지 낮춘 후 효소 활성도를 측정하여 활성의 변화를 조사하였다.
- 각 금속 염류 용액의 조제는 상기 농도의 용액을 pH 3(HC1 로조절)의 증류수에 용해하였다. 각각의 금속 염류 용액과 계내금 효소액을 예열시킨 후 기질을 가하여 효소 반응을 시켰으며, 비색도를 측정하여 활성 값을 나타내었다. 이때 대조구는 효소만이 기질에 반응했을 경우와 금속 이온만이 기질에 반응했을 경우를 비교 조사하였다.
- 계내금 조효소액을 10, 000 rpm에서 10분간 원심분리하고, 상등액인 효소 시료 95 m止을 취하여 5~ 25% ammonium sulfate로 포화시키면서 각 단계의 침전물을 증류수에 녹여 분획하고, 활성을 측정하였 - 다. 즉정 결과 15% ammonium sulfate 분획이 가장 높은 활성을 나타내었으며, 위에서 분획한 침전물을 20 mL 의 증류수에 녹이고, 20 mM sodium acetatefpH 4.
- 계내금 효소 활성에 미치는 기질 농도의 영향을 알아보기 위해 Jeong9)의 방법을 변형하여 casein 용액 농도를 0.5, 1.0, 1.5, 2.0%(w/v)로 조제한 후 casein 농도 변화에 따른 계내금 효소 활성도를 즉정하였다. 계내금 효소의 기질에 대한 특이성을 조사하기 위해 egg albumin, azocasein, elastin, collagen, casein 등의 단백질을 사용하여 0.
- 0%(w/v)로 조제한 후 casein 농도 변화에 따른 계내금 효소 활성도를 즉정하였다. 계내금 효소의 기질에 대한 특이성을 조사하기 위해 egg albumin, azocasein, elastin, collagen, casein 등의 단백질을 사용하여 0.6%의 기질 농도에서 각각의 효소 활성을 비교하였다.
- 계내금 효소의 등전점 (pl ; isoelectric point)은 isoelectric focusing(IEF)에 의해 측정하였으며, pH 3~10용 13% acrylamide gel 상에 정제된 효소와 pl 표준 단백질을 주입하여 전기 영동한 후 silver staining하여 등전점을 확인하였다. 이때 IEF 표준 곡선 작성을 위한 표준 단백질은 IEF Mix 4.
- 59) 등을 사용하였다. 계내금 효소의 반응속도는 casein 을 0.1 M Mcllvaine buffer(pH 2.5) 에 녹여 casein의 농도를 mL 당 1~ 10 mg로 조절하고, 5.5 unit의 효소량을 가하여 5 0℃에서 10분간 반응시켜 초기 분해 속도를 측정하고, 기질 농도와의 관계를 Lineweaver-Burk식에 적용하여 기질에 대한 효소 친화성을 나타내는 Km 값과 최대 반응 속도를 나타내는 Vmax 값을 구하였다.
- 4). 계내금 효소의 반응속도는 계내 금단 백질 분해 효소의 활성에 미치는 기질 농도의 영향을 조사하여 각 기질의 농도에 따른 활성을 측정한 후 그 값을 Lineweaver-Burk ploting 하여 나타내었으며, Km치는 48 mg/mL, Vmax 값은 2 mg/min이었다(Fig. 5).
- 5) 완충 용액에서 ultra filtration membrane(MWCO l, 000Da)°] 부착된 Amicon Diaflo System을 사용하여 4笆에서 24시간 투석하였다. 계내금 효소의 정제는 유리칼럼에 10 cm 높이로 SP-Sepharose룰 채우고, 90% 50 mM sodium acetate(pH 4.5), 10% 50 mM sodium acetate, IN NaCl, pH 45로 평형화시킨 후 농축된 효소 시료를 주입하고 50 mM sodium acetate, IN NaCl, pH 4.5 를 60분간 0~100%로 선형구배를 주어 용출시켰다. 용출시킨 분획을 모아 전기영동을 실시하였으며, 크로마토그래피를 이용한 정제 과정에서는 280 nni의흡광도로 단백질 농도를 표시하였다.
- 계내금에서 추출한 단백질 분해 효소를 정제하고, 그 특성을 조사한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 5 를 60분간 0~100%로 선형구배를 주어 용출시켰다. 용출시킨 분획을 모아 전기영동을 실시하였으며, 크로마토그래피를 이용한 정제 과정에서는 280 nni의흡광도로 단백질 농도를 표시하였다. 계내금 효소의 단백질의 함량 측정은 Bio-rad社의 protein assay kit를 사용하였으며, bovine serum albumin을 표준품으로 commassie brillant blue G-250이 단백질과 결합하여 붉은 색이 푸른색으로 변하고, 최대 흡수 파장이 옮겨지는 것을 이용하는 Bradford 등刁의 방법으로 정량하였다.
- 계내금 효소의 온도 안정성을 알아보기.위해 40, 50, 60, 70℃에서 계내금 효소액을 10분 동안 예열시킨 후 4℃에서 방치한 후 반응이 종료된 효소의 활성도를 측정하였다. pH에 대한 계내금 효소의 안정성을 조사하기 위해 McDvaine buffer의 0.
- 각각의 금속 염류 용액과 계내금 효소액을 예열시킨 후 기질을 가하여 효소 반응을 시켰으며, 비색도를 측정하여 활성 값을 나타내었다. 이때 대조구는 효소만이 기질에 반응했을 경우와 금속 이온만이 기질에 반응했을 경우를 비교 조사하였다.
- 즉정 결과 15% ammonium sulfate 분획이 가장 높은 활성을 나타내었으며, 위에서 분획한 침전물을 20 mL 의 증류수에 녹이고, 20 mM sodium acetatefpH 4.5) 완충 용액에서 ultra filtration membrane(MWCO l, 000Da)°] 부착된 Amicon Diaflo System을 사용하여 4笆에서 24시간 투석하였다. 계내금 효소의 정제는 유리칼럼에 10 cm 높이로 SP-Sepharose룰 채우고, 90% 50 mM sodium acetate(pH 4.
- 의 precision standard maker(broad range) 를 사용하였다. 효소의 분자량은 동일한 조건에서 전기 영동한 표준 단백질의 이동거리와 효소 단백질의 이동거리를 비교하여 산출하였다. 이때 사용한 표준 단백질은 trisphosphate isomerase(M.
- 투석막은 Spectrum 제품 중 MWC0(m olecular weight cut-off, USA) 1,000 Da을 사용하였고, 전기영동용 표준 단백질은 Bio-Rad kit를, IEF용표준 단백질과 gel filtration용 표준 단백질은 Sigma kit를 사용하였다. 효소의 생화학적 특성 분석에 이용한 시약은 모두 Sigma社 제품을 사용하였고, 유리 아미노산 분석용 시약은 특급시약을, 기타 실험용 시약 및 용매는 특급 및 일반 시약을 사용하였다.
대상 데이터
- 계내금으로부터 얻은 단백질 분해 효소 정제에 사용한 SP-Sepharose는 Pharmacia(Sweden) 제품을, 유리 컬럼은 Millipore(2.2 x 30cm, USA) 제품을 사용하였다. 투석막은 Spectrum 제품 중 MWC0(m olecular weight cut-off, USA) 1,000 Da을 사용하였고, 전기영동용 표준 단백질은 Bio-Rad kit를, IEF용표준 단백질과 gel filtration용 표준 단백질은 Sigma kit를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 기기는 분광 광도계(model 160 1, Shimadzu Co., Japan), 동결 건조기 (27SW, Sam won Co., Korea), 열풍 건조기 (HB-501, Hanbak Co., Korea), 전기영동장치(Hoefer, Phamacia Co., Sweden), 색차계 (Chromameter CR-300, Minolta Co., Japan), pH 측정기 (model 691, Metrohm Co., Swiss), IEF(Phamacia Co., Sweden) 등을 사용하였다.
- 실험에 사용한 계내금은 풍산제약사(한국산)에서구입하였으며, 계내금 조효소액 제조는 계내금 분말 25 g과 시판 사과식초(S식품, 총산 6.82, pH 2.42) 500 mL을 균질기 (HF-93S, SMT Co., Japan)를 사용해 250 rpm에서 10분 교반한 후 40℃ water bath(HB-21, Han bak Co., Korea)에서 150 rpm으로 9시간 동안 진탕하면서 효소를 추출하였다. 계 내금 추출액을 여과지(Whatman No.
- 등전점을 확인하였다. 이때 IEF 표준 곡선 작성을 위한 표준 단백질은 IEF Mix 4.91-9.59 로 P-lactoglobulin A(pl 4.93), carbonic anhydrase II (pl 6.41), carbonic anhydrase I (pl 6.59), myoglobin(pl 8.12), trypsin precusor(pl 8.23), cytochrome C(pl 9.59) 등을 사용하였다. 계내금 효소의 반응속도는 casein 을 0.
- 효소의 분자량은 동일한 조건에서 전기 영동한 표준 단백질의 이동거리와 효소 단백질의 이동거리를 비교하여 산출하였다. 이때 사용한 표준 단백질은 trisphosphate isomerase(M.W. 26, 600), myoglobin(M.W. 18, 400), lysozyme(M.W. 14, 300), aprotinin(M.W. 6, 200) 등을 사용하였다.
- 2 x 30cm, USA) 제품을 사용하였다. 투석막은 Spectrum 제품 중 MWC0(m olecular weight cut-off, USA) 1,000 Da을 사용하였고, 전기영동용 표준 단백질은 Bio-Rad kit를, IEF용표준 단백질과 gel filtration용 표준 단백질은 Sigma kit를 사용하였다. 효소의 생화학적 특성 분석에 이용한 시약은 모두 Sigma社 제품을 사용하였고, 유리 아미노산 분석용 시약은 특급시약을, 기타 실험용 시약 및 용매는 특급 및 일반 시약을 사용하였다.
이론/모형
- 용출시킨 분획을 모아 전기영동을 실시하였으며, 크로마토그래피를 이용한 정제 과정에서는 280 nni의흡광도로 단백질 농도를 표시하였다. 계내금 효소의 단백질의 함량 측정은 Bio-rad社의 protein assay kit를 사용하였으며, bovine serum albumin을 표준품으로 commassie brillant blue G-250이 단백질과 결합하여 붉은 색이 푸른색으로 변하고, 최대 흡수 파장이 옮겨지는 것을 이용하는 Bradford 등刁의 방법으로 정량하였다.
- 계내금 효소의 활성 측정은 Folin 비색법6)을 사용하였다. 기질로는 2.
성능/효과
- 1. 계내금 단백질 분해 효소를 정제하여 최종 효소 총활성도, 단백질 함량 및 비활성도가 각각 2.223 units, 0.72 mg, 3, 087.5 units/mg protein이었으며, 조효소액에 비해 14.5배의 정제도, 9.8%의 정제 수율을 보였으며, 분자량이 약 18 kDa 정도의 단일 단백질로 구성된 momomer임을 확인하였다.
- 2. 계내금 단백질 분해 효소의 등전점은 pl 8.97(pH 2.3) 이었고, Km치는 48 mg/mL, Vmax 값은 2 mg/min이었으며, 각종 금속 이온이 계내금 효소에 미치는 영향을 조사한 결과, 대부분의 금속 이온들이 계내금 효소의 활성에 큰 영향을 미치지 않았지만 Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mn2+은 계내금 효소의 활성을 오히려 조금 증가시키는 것으로 나타났다.
- 3. 계내금 단백질 분해 효소의 온도 및 pH에 대한 안정성은 60℃ 이하와 pH 6.0까지는 80% 이상의 활성을 유지하여 넓은 온도 범위와 pH 영역에서 매우 안정한 것으로 나타나 산업적으로 활용 가치가 매우 높은 효소였다.
- 4. 계내금 단백질 분해 효소의 기질 영향은 casein의 농도가 1.5%까지는 효소 활성이 농도에 비례하여 증가하여 1.5%에서 가장 높게 나타났다. 기질 특이성에 대한 실험 결과, 계내금 효소는 일반적인 효소가 잘 분해하지 못하는 섬유상 단백질인 콜라겐 단백질에 대해 특이적으로 기질 특이성이 높은 것으로 밝혀졌다.
- 각종 금속 이온이 계내금 효소에 미치는 영향을 조사한 결과, 대부분의 금속 이온들이 계내금 효소의 활성에 큰 영향을 미치지 않았지만, Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mn2+은 계내금 효소의 활성을 오히려 조금 증가시키는 것으로 나타났다(Table 3).
- 6). 계 내금 효소의 pH에 대한 안정성을 실험한 결과, pH 4.0 이하에서 활성이 매우 높았으나, pH 4.0 이상으로 증가함에 따라 계내금 효소의 활성이 서서히 감소하였으나 여전히 80%의 높은 활성을 보였다(Fig. 7).
- 2, 3). 계 내금으로부터 얻은 조효소액을 각 단계별 정제 과정 중 효소 활성 및 단백질 함량을 조사한 결과, 초기 단계의 조효소액 총활성도, 단백질 함량 및 비활성도 는 각각 15.35% units, 70.58 mg, 217.56 units/mg protein 이었다. 효소 정제의 최종단계인 SP-Spharose 후의 효소의 총활성도, 단백질 함량 및 비활성도는 각각 2.
- 계내금 단백질 분해 효소는 15% ammonium sulfate 침전시킨 후 SP-Spharose로 분리하고, Amic on system으로 농축한 후 SDS-PAGE 전기영동을 실시하여 단일밴드를 찾았으며, 효소 정제후 총활성도, 단백질 함량 및 비활성도는 각각 2.223 units, 0.72 mg, 3, 087.5 units/mg protein이었으며, 조 효소액에 비해 14.5배의 정제도와 9.8% 정제 수율을 보였다.
- 계내금 단백질 분해 효소의 등전점인 pl 값은 8.97로 나타났는데, 이 결과는 곤충 병원성 곰팡이에서 분리한 protease 정제 효소의 pl 값이 9.5라는 연 구m 결과와 일치하였으며, 분자량은 약 18 kDa으로단일 단백질이었다.
- 계내금 효소에게 미치는 기질 영향을 알아보기 위해 0.5~2.0%의 casein 용액을 사용하여 효소 활성을 측정한 결과, casein의 농도가 1.5%까지는 효소 활성이 증가하여 1.5%에서 가장 높게 나타났다(Fig. 8). 본 연구에 사용된 계내금 단백질 분해 효소의 기질 특이성에 대한 실험결과를 살펴보면, 계내금 효소는 일반적인 효소가 잘 분해하지 못하는 섬유상 단백질인 collagen 단백질에 대해 기질 특이성이 매우 높은 것으로 밝혀졌으며, hemoglobin이나 azocas ein 단백질에 대한 분해력은 나타나지 않았다(Table 2).
- 계내금 효소의 분자량 측정을 위해 표준 단백질과 계내금 정제 효소를 SDS- PAGE 전기영동에 의한 분자량 측정 결과, 모두 단일 밴드를 확인하였으며, 분자량이 약 18 kDa 정도의 단일 단백질이었다. 따라서 .
- 5%에서 가장 높게 나타났다. 기질 특이성에 대한 실험 결과, 계내금 효소는 일반적인 효소가 잘 분해하지 못하는 섬유상 단백질인 콜라겐 단백질에 대해 특이적으로 기질 특이성이 높은 것으로 밝혀졌다.
- 0 에서 효소 활성이 비교적 안정하다고 보고 하였다. 본 실험에 사용한계 내금 단백질 분해 효소는 일반적으로 미생물이 생성하는 acid protease와는 달리 넓은 pH 영역에서 그 활성이 안정됨으로 산업적인 효용 가치가 충분한 내산성 단백질 분해 효소로 확인되었다.
- 8). 본 연구에 사용된 계내금 단백질 분해 효소의 기질 특이성에 대한 실험결과를 살펴보면, 계내금 효소는 일반적인 효소가 잘 분해하지 못하는 섬유상 단백질인 collagen 단백질에 대해 기질 특이성이 매우 높은 것으로 밝혀졌으며, hemoglobin이나 azocas ein 단백질에 대한 분해력은 나타나지 않았다(Table 2).
- 본 연구의 계내금 효소는 casein의 농도 1.5%까지는 효소 활성이 농도에 비례하여 증가하여 1.5% 에서 가장 높게 나타났다. 이는 Aspergillus oryzae 가 생산하는 protease가 casein의 농도 0.
- 온도가 계내금 효소에 미치는 영향을 조사한 결과, 40℃에서 3시간 경과한 후 서서히 효소의 활성이 줄어들었으며, 60℃는 3시간 경과 후에도 약 30% 정도 활성이 감소되었지만, 70X:에서는 약 1시간 후부터 70%정도 활성이 감소하였다(Fig. 6). 계 내금 효소의 pH에 대한 안정성을 실험한 결과, pH 4.
- 또한 健運하여 瀉痢나 反胃吐 食의 증상도 치료하며, 단맛으로 和緩하고 약간 차가운 약성으로 淸熱하여 解毒消腫하는 효능이 있어 走馬牙疳, 喉閉乳蛾, 입 속의 瘡을 치료한다. 이 외에 固澀止遺 효과가 있어 遺尿, 遺精을 치료하고, 通 淋利尿하여 石淋을 치료하며, 淸熱止煩하여 煩 熱을 없애고, 散結消瘀하여 度癖, 癥痂, 經閉, 眼翳, 小兒 疳積을 치료하는 효능이 있다勿 계내금을 분석한 결과, ventriculin이 함유되어 있어서 胃液分泌를 촉진하며, keratin에는 糖蛋白質을 일부 함유하고 있다는 보고 5와 본 연구실에서 수행한 실험 결과, 계내금은넓은 범위의 온도와 pH 영역에서 매우 안정된 반응을 보였으며, 특히 대부분의 효소가 중성 영역에서 최적 활성을 갖는데 비해 계내금 조효소액은 耐酸性 효소였으며, 내염성도 강하게 나타났다. 따라서 본연구에서는 본초학적 규격의 기본 연구인 계내금 추출물의 효소학적 특성을 밝힌 선행 연구를 기본으로계내금의 약재 진위와 양품 검사에 활용할 수 있는 구체적 연구를 위해 계내금에서 유래하는 내산성 단백질 분해 효소를 정제하고, 그 정제 효소의 특성을 조사하였기에 보고하는 방이다.
- 1). 활성 peak가 큰 효소 분획을 모아 Amicon system으로 농축한 후 SDS-PAGE 전기영동을 실시하여 단일밴드를 찾았으며, 이로써 계 내금으로부터 추출한 조효소액에서 순수한 단백질 분해 효소가 완전히 정제되었음을 확인하였다(Fig. 2, 3). 계 내금으로부터 얻은 조효소액을 각 단계별 정제 과정 중 효소 활성 및 단백질 함량을 조사한 결과, 초기 단계의 조효소액 총활성도, 단백질 함량 및 비활성도 는 각각 15.
- 56 units/mg protein 이었다. 효소 정제의 최종단계인 SP-Spharose 후의 효소의 총활성도, 단백질 함량 및 비활성도는 각각 2.223 units, 0.72 mg, 3, 087.5 units/mg protein이었으며, 조효소액에 비해 14.5배의 정제도를 나타내었으며, 정제 수율은 9.8%였다 (Table 1).
후속연구
- 또한 Jeng 등® 은 멸치에서 분리한 protease는 K+이온을 첨가한 경우 1 mM의 농도에서는 protease 활성이 약간 저해되었으나, 10 mM 첨가에서는 활성이 다소 증가하였으며, Mg2+ 이온과 Cu2+ 이온은 첨가량이 높을 수록 활성이 증가하였다는 연구와 유사한 경향을 보여본 계내금 효소는 금속 이온에 매우 안정하여 다양한 산업 현장에서 활용 가능성이 높은 유용한 효소 자원으로 밝혀졌다. 본 연구에 사용된 계내금 단백질 효소의 기질 특이성에 대한 실험 결과, 일반적인 효소제는 콜라겐에 제한적인 작용은 하지만, 변성되지 않은 콜라겐 분자의 독특한 triple helical region 의 peptide bond를 거의 분해하지 못하는 것으로 보고坳되어 있는데 본 실험에 사용된 계내금 단백질분해 효소는 콜라겐 기질 특이성이 매우 높은 것으로 보아 단백질 분해 효소 중 collagenase라 유추되며, 부가적인 연구가 요구된다.
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