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문제 정의
- p53은 DNA 손상 세포들의 고사를 야기하는 유전자들의 발현을 활성화시키고, '그 pRb는 E2F와 결합하여 G1 arrest를 야기함으로써 세포주기를 조절한다.13)식도암에서도 p53의 돌연변이, 과발현, 또는 pRb 유전자나 단백발현의 소실 등이 보고되었다“*) 이에 저자는 식도암에서 동시적 항암화학방사선치료전의내시경하 생검 조직을 면역 조직화학염색을 시행하여 MDM2, p53, pRb의 발현정도를 평가하고, 이들의 발현정도와 치료반응, 종양재발률, 생존율 등과의 연관성을 분석하여 이들이 치료반응과 예후를 예측할 수 있는 표지자가 될 수 있는지 알아보고자 하였다.
- 본 연구에서는 항암화학방사선치료에 종양반응을 미리예측할 수 있는 잠재적인 표지자로서 MDM2, p53, pRb를선택하였다. MDM2는 murine double minute 2 종양 유전자의 산물로 wild-type 또는 mutant p53과 강하게 결합하고? p53을 핵내에서 세포질로 끌어내 proteasome에 의해 분해되게 한다.
제안 방법
- 방사선치료 시작 시에는 전후 이문 조사야로 CT 소견과 바륨 조영상 종양의 크기를 참고하여 상하 5 cm, 좌우 2 cm 여유를 두었다. 36-40 Gy 시점에서 치료계획용 흉부 CT를 시행하여 3차원 입체조형방사선치료로써육안적 종양체적으로부터 상하 3 cm 전후 및 좌우 2 cm 여유의 임상적 표적체적에 14-18 Gy 추가하였다.
- 양성반응의 빈도와 강도를 종합하여 판정하였다. pRB염색의 강도는 no staining=O; less intense than normal epithelium =1; same intensity as nomal epithelium=2; and more intense than normal epithelium=3으로 규정하였고 2와 3을 양성세포로 간주하였다. MDM2와 p53 양성의 기준은 MDM2와 p53。] 강하게 발현된 양성대조군 종양세포와 비교하여 같은 정도로 염색이 된 경우를 양성으로 간주하였다.
- 각 슬라이드는 200배율로 관찰하였으며, 면역염색 정도는 양성반응의 빈도와 강도를 종합하여 판정하였다. pRB염색의 강도는 no staining=O; less intense than normal epithelium =1; same intensity as nomal epithelium=2; and more intense than normal epithelium=3으로 규정하였고 2와 3을 양성세포로 간주하였다.
- 내인성 peroxidase 반응을 차단하기 위해 메탄올과 3% 과산화수소수에 30분간 처리한 다음 조직항원과 항체간의 비특이적 결합을 억제하기 위해 blocking agent로 20분간 처리하였다. 각 슬라이드는human MDM2 (clone IF2, diluted 1 : 100, Oncogene Research Products, Cambridge, MA, USA), p53 (BP53-12, diluted 1 : 50, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle, UK), human pRB (clone Rbl, diluted 1 : 40, DACO, Glostrup, Denmark)에 대한 단일클론항체를 각각 사용하여 발현을 검색하였고, 음성대조군에는 비특이적 mouse IgGl을 사용하였다. MDM2, p53, pRb에 대한 양성 대조군은 각각 결장암 조직, 식도암 조직, 정상 식도점막을 이용하였다.
- 골수와 간, 신장기능이 적절한 환자를 대상으로 Cisplatin (75 mg/irf)을 매 주기 첫 날에, 5-fluorouracil (1000 mg/m2)을 매 주기 제 1~4 일에 정주하고 이를 4주 간격으로 4회 시행하며 첫 2회는 방사선치료와 병행하였다.
- 내시경으로 획득된 생검조직은 파라핀 포매되었고 각 증례 별로 4개의 4z/m 두께의 조직절편을 면역염색과 음성대조군을 위하여 준비하였다. 각 절편들은 염색 시 항원 노출을 향상시키기 위하여 파라핀을 제거한 후 citric acid buffer (10 mmol/)가 담긴 용기에 넣어 마이크로웨이브 오븐(700 W)에 12 분간 처치하였다.
- 각 절편들은 염색 시 항원 노출을 향상시키기 위하여 파라핀을 제거한 후 citric acid buffer (10 mmol/)가 담긴 용기에 넣어 마이크로웨이브 오븐(700 W)에 12 분간 처치하였다. 내인성 peroxidase 반응을 차단하기 위해 메탄올과 3% 과산화수소수에 30분간 처리한 다음 조직항원과 항체간의 비특이적 결합을 억제하기 위해 blocking agent로 20분간 처리하였다. 각 슬라이드는human MDM2 (clone IF2, diluted 1 : 100, Oncogene Research Products, Cambridge, MA, USA), p53 (BP53-12, diluted 1 : 50, Novocastra Laboratories Ltd.
- 병 리학적 종양반응을 평가하기 위하여 방사선치료종료 1 개월 전후에 내시경하 조직검사를 시행하고, 임상적 종양 반응은 방사선치료종료 1개월 전후에 흉부 (次와 식도 조영술을 시행하여 평가하였다. 이후 3개월 간격으로 CT 및 식도 조영술을 시행하고, 임상적으로 진행성 병변이나 재발이 의심될 때 조직검사나 CT를 시행하였다.
- 이 중 수술 후 방사선치료, 이 중원발 암, 방사선 단독치료, 고식적 목적의 방사선치료 등의 환자를 제외하고, 동시적 항암화학요법 2회 이상과 원발 암의 방사선량이 50 Gy 이상을 시행받은 환자로서 American Joint Committee on Cancer 병기”) I ~ IVa인 환자이며 방사선치료 전과 치료 후 조직검사가 가능하였던 총 51명의 환자를 대상으로 하였다. 병기 결정을 위해 문진, 이학적 검사, 전 혈구검사, 상부위장관내시경 土 내시경초음파, 흉부 및 복부 전산화단층촬영 (CT), 필요 시 PET 등을 시행하였다.
- 선형가속기 6- 또는 10-MV 엑스선을 이용하여 일일 1.8 ~2.0 Gy씩 주 5회 총 54 Gy를 원발병소에, 경부림프절이나 쇄골 상부림프절에는 병소의 크기에 따라 추가조사를 시행하였다. 방사선치료 시작 시에는 전후 이문 조사야로 CT 소견과 바륨 조영상 종양의 크기를 참고하여 상하 5 cm, 좌우 2 cm 여유를 두었다.
- 시행하여 평가하였다. 이후 3개월 간격으로 CT 및 식도 조영술을 시행하고, 임상적으로 진행성 병변이나 재발이 의심될 때 조직검사나 CT를 시행하였다. 조직검사상 종양세포가 보이지 않으면 병리학적 완전관해, 나머지를 비 완전 관해로 구분하였고, CT상 종양이 소실되었거나 식도 벽이 방사선치 료변화만으로 판독되고 정 상식 이 가 가능한 경 우를 임상적 완전관해, 나머지를 비 완전관해로 구분하였다.
- MDM2, p53, pRb에 대한 양성 대조군은 각각 결장암 조직, 식도암 조직, 정상 식도점막을 이용하였다. 이후 완충액(phosphate-buf- fered saline)으로 세척한 다음 2차 항체를 반응시키고, hema- toxylin으로 대조염색을 시행하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 전체 환자에서 면역조직화학 염색 정도에 따른 각 군별증례 수가 통계분석상 적절한 표본수가 되기 위하여 면역염색이 grade 0과 grade 1인 군을 합하여 저발현군으로, grade 2군을 고발현군으로 재 분류하여 분석하였다. MDM2 고발 현군은 10예(19.
- 이후 3개월 간격으로 CT 및 식도 조영술을 시행하고, 임상적으로 진행성 병변이나 재발이 의심될 때 조직검사나 CT를 시행하였다. 조직검사상 종양세포가 보이지 않으면 병리학적 완전관해, 나머지를 비 완전 관해로 구분하였고, CT상 종양이 소실되었거나 식도 벽이 방사선치 료변화만으로 판독되고 정 상식 이 가 가능한 경 우를 임상적 완전관해, 나머지를 비 완전관해로 구분하였다.
대상 데이터
- , Newcastle, UK), human pRB (clone Rbl, diluted 1 : 40, DACO, Glostrup, Denmark)에 대한 단일클론항체를 각각 사용하여 발현을 검색하였고, 음성대조군에는 비특이적 mouse IgGl을 사용하였다. MDM2, p53, pRb에 대한 양성 대조군은 각각 결장암 조직, 식도암 조직, 정상 식도점막을 이용하였다. 이후 완충액(phosphate-buf- fered saline)으로 세척한 다음 2차 항체를 반응시키고, hema- toxylin으로 대조염색을 시행하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 전체 환자의 중앙추적관찰기간은 26개월이었고, 연구종료시점에 51명 중 29명이 사망하였다. 사망원인으로는 18예는 진행성 또는 재발성 병변으로 사망하였고, 7 예는 동반된 내과적 질환으로, 3예는 구제수술 후 합병증으로, 나머지 1예는 뇌혈관질환으로 사망하였다. 전체환자의 1년 및 2년 생존율, 중앙생존기간은 각각 66.
데이터처리
- 비교는 log-rank test를 이용하였다. 다변량 분석은 Cox-proportional hazard model을 이용하였고, 모든 통계적 기법은 SPSS 14.0을 이용하였다. p-value가 0.
- 빈도분석에 Chi-square test와 Fisher's exact probability test 를 이용하였고, 생존율은 Kaplan-Meier method, 각 군간 생존율의 비교는 log-rank test를 이용하였다. 다변량 분석은 Cox-proportional hazard model을 이용하였고, 모든 통계적 기법은 SPSS 14.
성능/효과
- 709). Cox proportional hazards model을 이용하여 연령(65세 이하 vs. 초과), 종양의 위치(상부, 중앙부, 하부), 종양의 길이(5 cm 이하 vs. 초과), 병기(I~II vs. Ⅲ~IVa), MDM2 (저발현 vs. 고발현), p53 (저발현 vs. 고발현), pRb (저발현 vs. 고발현), 병리학적 완전관해여부, 임상적 완전 관해 여부 등 9개 요인들을 대상으로 종양특성 생존율에 대한 다변량 분석에서 병리학적 완전관해여부(RR 12.100, p <0.001, Fig. 1)와 병기 (RR 3.300, p=0.028) 만이 유의한 인자들이었다.
- 고발현군으로 재 분류하여 분석하였다. MDM2 고발 현군은 10예(19.6%)에서, p53 고발현군은 14예(27.5%)에서, 고발현군은 34예(66.7%)에서 나타났다(Table 2, Fig. 2). 이들의 발현양상과 임상적 의의에 대한 분석으로서 병기(I+II vs.
- 422). p53 저발현군과 고발현군의 종양 특성 2년 생존율은 각각 51.1% 대 72.4%로 역시 유의한 차이는 없었다(p=0.377). pRb 저발현군과 고발현군의 종양특성 2년 생존율은 각각 61.
- 찾을 수 없었다. 결과에 제시되지는 않았으나 면역염색이 grade 0인군을 저발현으로, grade 1+2인군을 고발 현군으로 재 분류하여 분석하였으나 역시 치료 결과와 의미 있는 상관관계는 보이지 않았고, 면역염색을 grade 0, 1, 2 등 세 군으로 분류하여 분석하여도 유의한 연관성은 찾을 수 없었다. 이는 내시경하 치료 전 조직생검이 종양 전체의 생물학적 특성을 대변하지 못할 수 있는 가능성과 전체 증례의 부족, 종양 및 치료 특성의 비균일성, 단기간의 추적관찰 기간 등 여러 요인이 복합적으로 작용되었을것으로 생각된다.
- 결론적으로 본 연구에서 MDM2, p53, pRb의 면역염색의결과 염색의 정도를 여러 기준으로 분류하여 분석하였으나 치료반응, 국소주변 재발률, 생존율 등과 모두 유의한상관관계는 찾을 수 없었다. 이들의 발현 정도와 연령, 종양의 위치, 종양의 길이, 병기, 병리학적 완전관해여부, 임상적 완전관해여부 등을 대상으로 한 다변량 분석에서 병리학적 완전관해여부와 병기 만이 유의한 인자들로 나타남으로써 결국 병기만이 치료 전의 유일한 예후 인자이었다.
- 본 연구에서 MDM2, p53, pRb의 면역조직화학염색의 결과, 치료반응, 국소주변 재발률, 생존율 등과 모두 유의한상관관계는 찾을 수 없었다. 결과에 제시되지는 않았으나 면역염색이 grade 0인군을 저발현으로, grade 1+2인군을 고발 현군으로 재 분류하여 분석하였으나 역시 치료 결과와 의미 있는 상관관계는 보이지 않았고, 면역염색을 grade 0, 1, 2 등 세 군으로 분류하여 분석하여도 유의한 연관성은 찾을 수 없었다.
- 찾을 수 없었다. 이들의 발현 정도와 연령, 종양의 위치, 종양의 길이, 병기, 병리학적 완전관해여부, 임상적 완전관해여부 등을 대상으로 한 다변량 분석에서 병리학적 완전관해여부와 병기 만이 유의한 인자들로 나타남으로써 결국 병기만이 치료 전의 유일한 예후 인자이었다. 향후 본 연구에서의 발현인자들을 포함하여 잠재적인 예후 인자로서 새로운 다른 발현인자들을 발굴하고 보다 많은 증례 수를 대상으로 추적기간을 보강하여 이들을 재평가하는 연구가 요망된다.
- 사망원인으로는 18예는 진행성 또는 재발성 병변으로 사망하였고, 7 예는 동반된 내과적 질환으로, 3예는 구제수술 후 합병증으로, 나머지 1예는 뇌혈관질환으로 사망하였다. 전체환자의 1년 및 2년 생존율, 중앙생존기간은 각각 66.7%, 37.4%, 17 개월이었다. 전체환자의 1년 및 2년 종양특성 생존율은 각각 78.
후속연구
- 2, 3) 최근 동시적 항암 화학 방사선요법과 동시적 항암화학 방사선요법 후에 수술을 추가하여 비교하는 전향적 연구에 의하면 두 군간에 전체 생존율의 차이는 없었으나 수술 추가 군에서 무 재발기 간이향상되었다고 보고되었다” 그러나 유도항암화학 방사선요법에 완전관해를 보인 군은 수술의 추가로 생존율의 상승이 없었으며, 수술을 추가함으로써 얻은 생존율의 상승은 주로 부분관해 이하를 보인 환자들로 알려져 있다. 5)국소 진행된 식도암의 치료에서 항암화학 방사선요법 후 수술 추가 여부를 결정할 근거로 치료시작 후 일정 시점에서 내시 경하 조직검사 또는 영상적 평가로 치료반응을 평가해야 하나 이는 전체 종양의 치료반응을 정확히 대변할 수 없는 한계가 있다. 근치적 항암화학방사선요법으로 완전관해를 보일 수 있는 환자를 치료 전 미리 예측할 수 있는 표지자가 있다면 수술의 추가로 인한 합병증 또는 사망을 피하고 불필요한 의료비의 상승을 줄일 수 있다.
- 이들의 발현 정도와 연령, 종양의 위치, 종양의 길이, 병기, 병리학적 완전관해여부, 임상적 완전관해여부 등을 대상으로 한 다변량 분석에서 병리학적 완전관해여부와 병기 만이 유의한 인자들로 나타남으로써 결국 병기만이 치료 전의 유일한 예후 인자이었다. 향후 본 연구에서의 발현인자들을 포함하여 잠재적인 예후 인자로서 새로운 다른 발현인자들을 발굴하고 보다 많은 증례 수를 대상으로 추적기간을 보강하여 이들을 재평가하는 연구가 요망된다.
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