목적: 세포 주기 억제제인 flavopirldol이 후두암과 폐암 세포주에서 방사선으로 인한 아포토시스에 미치는 영향을 알아보고 세포 내 아포토시스 조절 물질들의 발현에 어떤 변화를 가져오는지 알아본다. 대상 및 방법: 사람 후두암 세포주인 AMC-HN3와 폐암 세포주인 NCI-H460을 배양하여 1) 아무 처치도 하지 않은 군, 2) 방사선 조사만 한 군, 3) flavopiridol 약물 처치만 한 군, 4) 방사선과 flavopriodol 동시 병합 치료를 한 군으로 나누어 비교하였다. 방사선 조사시 4 MV 선형가속기의 X-ray를 10 Gy 조사하였고 flavopiridol은 세포 배양액에 100 nM 농도로 희석하여 24시간 동안 투여했다. 치료를 시작한 시점으로부터 24시간 후에 네 군의 아포토시스율을 비교하였다. 아포토시스율은 유세포 분석기를 이용하여 sub-G1 세포의 분율로 구했다. 또한 네 군에서 cleaved caspase-3, cleaved PARP (poly(ADP-ribose) polymerase), p53, p21, cyclin D1, phosphorylated Akt (protein kinase B) 발현 양상을 비교하기 위해 면역단백분석을 시행하였다. 결 과: 방사선 단독 처치 또는 flavoplridol 단독 처치한 군에 비해 방사선과 flavopiridol을 동시 병합 치료한 군에서 아포토시스율이 증가하는 것을 두 가지 암세포주 모두에서 확인할 수 있었다. 면역단백분석에서도 cleaved caspase-3, cleaved PARP 발현이 동시 병합 치료 군에서 높게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 두 세포주 모두에서 flavopiridol에 의해 cyclin D1 발현이 감소되는 것을 확인하였으나 flavopiridol이 p53, p21 발현에 미치는 영향은 세포주에 따라 다르게 나타났으며 Akt 발현은 두 세포주 모두에서 flavopiridol 투여에 의한 변화가 없었다. 결 론: 본 실험을 통해 사람 후두암 및 폐 암 세포주에서 flavoplridol이 방사선에 의한 아포토시스를 증가시킴으로써 방사선 치료 효과를 증진시킬 수 있음을 확인하였다. Flavopiridol이 p53, p21 발현에 미치는 영향은 세포주에 따라 다른 것으로 나타났으며 phosphorylated Akt 발현은 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
목적: 세포 주기 억제제인 flavopirldol이 후두암과 폐암 세포주에서 방사선으로 인한 아포토시스에 미치는 영향을 알아보고 세포 내 아포토시스 조절 물질들의 발현에 어떤 변화를 가져오는지 알아본다. 대상 및 방법: 사람 후두암 세포주인 AMC-HN3와 폐암 세포주인 NCI-H460을 배양하여 1) 아무 처치도 하지 않은 군, 2) 방사선 조사만 한 군, 3) flavopiridol 약물 처치만 한 군, 4) 방사선과 flavopriodol 동시 병합 치료를 한 군으로 나누어 비교하였다. 방사선 조사시 4 MV 선형가속기의 X-ray를 10 Gy 조사하였고 flavopiridol은 세포 배양액에 100 nM 농도로 희석하여 24시간 동안 투여했다. 치료를 시작한 시점으로부터 24시간 후에 네 군의 아포토시스율을 비교하였다. 아포토시스율은 유세포 분석기를 이용하여 sub-G1 세포의 분율로 구했다. 또한 네 군에서 cleaved caspase-3, cleaved PARP (poly(ADP-ribose) polymerase), p53, p21, cyclin D1, phosphorylated Akt (protein kinase B) 발현 양상을 비교하기 위해 면역단백분석을 시행하였다. 결 과: 방사선 단독 처치 또는 flavoplridol 단독 처치한 군에 비해 방사선과 flavopiridol을 동시 병합 치료한 군에서 아포토시스율이 증가하는 것을 두 가지 암세포주 모두에서 확인할 수 있었다. 면역단백분석에서도 cleaved caspase-3, cleaved PARP 발현이 동시 병합 치료 군에서 높게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 두 세포주 모두에서 flavopiridol에 의해 cyclin D1 발현이 감소되는 것을 확인하였으나 flavopiridol이 p53, p21 발현에 미치는 영향은 세포주에 따라 다르게 나타났으며 Akt 발현은 두 세포주 모두에서 flavopiridol 투여에 의한 변화가 없었다. 결 론: 본 실험을 통해 사람 후두암 및 폐 암 세포주에서 flavoplridol이 방사선에 의한 아포토시스를 증가시킴으로써 방사선 치료 효과를 증진시킬 수 있음을 확인하였다. Flavopiridol이 p53, p21 발현에 미치는 영향은 세포주에 따라 다른 것으로 나타났으며 phosphorylated Akt 발현은 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
Purpose: To investigate the flavopiridol effect on radiation-induced apoptosis and expression of apoptosisrelated genes of human laryngeal and lung cancer cells. Materials and Methods: A human laryngeal cancer cell line, AMC-HN3 and a human lung cancer cell line, NCI-H460, were used in the study. Th...
Purpose: To investigate the flavopiridol effect on radiation-induced apoptosis and expression of apoptosisrelated genes of human laryngeal and lung cancer cells. Materials and Methods: A human laryngeal cancer cell line, AMC-HN3 and a human lung cancer cell line, NCI-H460, were used in the study. The cells were divided into four groups according to the type of treatment: 1) control groups; 2) cells that were only irradiated; 3) cells treated only with flavopiridol; 4) cells treated with flavopiridol and radiation simultaneously. The cells were irradiated with 10 Gy of X-rays using a 4 MV linear accelerator. Flavopiridol was administered to the media at a concentration of 100 nM for 24 hours. We compared the fraction of apoptotic cells of each group 24 hours after the initiation of treatment. The fraction of apoptotic cells was detected by measurement of the sub-G1 fractions from a flow cytometric analysis. The expression of apoptosis-regulating genes, including cleaved caspase-3, cleaved PARP (poly (ADP-ribose) polymerase), p53, p21, cyclin D1, and phosphorylated Akt (protein kinase B) were analyzed by Western blotting. Results: The sub-G1 fraction of cells was significantly increased in the combination treatment group, as compared to cells exposed to radiation alone or flavopiridol alone. Western blotting also showed an increased expression of cleaved caspase-3 and cleaved PARP expression in cells of the combination treatment group, as compared with cells exposed to radiation alone or flavopiridol alone. Treatment with flavopiridol down regulated cyclin 01 expression of both cell lines but its effect on p53 and p21 expression was different according to each individual cell line. Flavopiridol did not affect the expression of phophorylated Akt in both cell lines. Conclusion: Treatment with flavopiridol increased radiation-induced apoptosis of both the human laryngeal and lung cancer cell lines. Flavopiridol effects on p53 and p21 expression were different according to the individual cell line and it did not affect Akt activation of both cell lines.
Purpose: To investigate the flavopiridol effect on radiation-induced apoptosis and expression of apoptosisrelated genes of human laryngeal and lung cancer cells. Materials and Methods: A human laryngeal cancer cell line, AMC-HN3 and a human lung cancer cell line, NCI-H460, were used in the study. The cells were divided into four groups according to the type of treatment: 1) control groups; 2) cells that were only irradiated; 3) cells treated only with flavopiridol; 4) cells treated with flavopiridol and radiation simultaneously. The cells were irradiated with 10 Gy of X-rays using a 4 MV linear accelerator. Flavopiridol was administered to the media at a concentration of 100 nM for 24 hours. We compared the fraction of apoptotic cells of each group 24 hours after the initiation of treatment. The fraction of apoptotic cells was detected by measurement of the sub-G1 fractions from a flow cytometric analysis. The expression of apoptosis-regulating genes, including cleaved caspase-3, cleaved PARP (poly (ADP-ribose) polymerase), p53, p21, cyclin D1, and phosphorylated Akt (protein kinase B) were analyzed by Western blotting. Results: The sub-G1 fraction of cells was significantly increased in the combination treatment group, as compared to cells exposed to radiation alone or flavopiridol alone. Western blotting also showed an increased expression of cleaved caspase-3 and cleaved PARP expression in cells of the combination treatment group, as compared with cells exposed to radiation alone or flavopiridol alone. Treatment with flavopiridol down regulated cyclin 01 expression of both cell lines but its effect on p53 and p21 expression was different according to each individual cell line. Flavopiridol did not affect the expression of phophorylated Akt in both cell lines. Conclusion: Treatment with flavopiridol increased radiation-induced apoptosis of both the human laryngeal and lung cancer cell lines. Flavopiridol effects on p53 and p21 expression were different according to the individual cell line and it did not affect Akt activation of both cell lines.
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문제 정의
'.끄) 따라서 이 신호전달 체계를 억제하는 약물은 암세포의 방사선에 대한 민감도를 높이고 아포토시스를 증가시킬 수 있을 것으로 생각되고 있다 본 실험에서는 flavopiridol이 Akt 활성화를 억제하지는 않는지 면역단백분석을 통해 확인해 보고자 하였는데 flavopiridol은 두 가지 세포주 모두에서 Akt 활성화에는 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
본 실험에서는 또한 세포 내에서 세포 주기 및 아포토시스 조절에 관여하는 p53, p21, cyclin D1 에 대한 면역단백 분석도 시행하여 flavopiridol이 이 물질들에 어떤 변화를 가져오는가 알아보고자 하였다. 이 중 cyclin 이은 이미 알려진 바와 같이 두 세포주 모두에서 flavopirid이에 의해 발현이 감소됨을 확인 할 수 있었다.
본 실험에서는 후두암 및 폐암 세포주를 사용하여 flavo- piridol이 방사선에 의한 아포토시스에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 정량적 분석을 위해 유세포 분석기를 사용하여 sub-Gl fraction을 구했을 때 방사선 단독 또는 flavo piridol 단독 처치한 경우보다 두 가지를 병합 치료 했을 때에 방사선에 의한 아포토시스가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 flavopiridol이 방사선으로 인한 암세포의 아포토시스에 미치는 영향을 알아보고 flavopiridol에 의해 세포 내 아포토시스 조절 물질의 발현에 어떠한 변화가 일어나는지 알아보고자 하였다.
제안 방법
1% Tween-20을 포함하는 Tris buffered saline (TBST)에 한 시간동안 처리하고 분석하고자 하는 각 단백질에 대한 1차 항체로 41에서 하룻밤동안 처리하였다. 다시 TBST로 세척하고 peroxidase가 접합되어있는 2차 항체로 1시간 동안 반응시킨 후 chemiluminescence system (Amersham Pharmacia Biotech, Piscatasay, NJ) 으로 발색시킨 후 band를 관찰하였다. 사용된 항체는 caspase-3(Cell Signaling Technology, Beverly, MA), PARP (Cell Signaling Technology), p53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), p21 (Santa Cruz Biotechnology), cyclin DI (BD biosciences, San Jose, CA), phospho-Akt (Ser 473) (Cell Signaling Technology), a-tubulin (Sigma, St.
면역단백분석으로 아포토시스 신호전달 과정의 마지막 단계에서 활성화되는 caspase-3와 PARP 발현을 조사하였다. AMC-HN3와 NCI-H460 두 가지 세포주 모두에서 방사선 또는 flavopiridol 단독 처치한 경우보다 방사선과 flavopiridol을 병합 치료했을 때에 capspase-3와 PARP가 더욱 활성화되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
방사선은 선형가속기 (Clinac 4/100, Varian, Palo Alto, CA) 를 이용해 10 Gy 선량의 4 MV의 X-ray를 조사하였다.
아포토시스가 유발된 세포군을 정량적으로 분석하기 위하여 유세포계측기 (FACS Calibur, Becton Dickinson, SanJose, CA)를 이용하였다. 처치가 끝난 세포를 회수하여 인산 완충액(phosphate buffered saline, PBS)으로 세척한 후 1% 농도로 PBS에 희석한 formaldehyde 용액에 고정시켰다.
, Bedford, MA)로 이동시켰다. 이를 5% 탈지유와 0.1% Tween-20을 포함하는 Tris buffered saline (TBST)에 한 시간동안 처리하고 분석하고자 하는 각 단백질에 대한 1차 항체로 41에서 하룻밤동안 처리하였다. 다시 TBST로 세척하고 peroxidase가 접합되어있는 2차 항체로 1시간 동안 반응시킨 후 chemiluminescence system (Amersham Pharmacia Biotech, Piscatasay, NJ) 으로 발색시킨 후 band를 관찰하였다.
대상 데이터
다시 TBST로 세척하고 peroxidase가 접합되어있는 2차 항체로 1시간 동안 반응시킨 후 chemiluminescence system (Amersham Pharmacia Biotech, Piscatasay, NJ) 으로 발색시킨 후 band를 관찰하였다. 사용된 항체는 caspase-3(Cell Signaling Technology, Beverly, MA), PARP (Cell Signaling Technology), p53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), p21 (Santa Cruz Biotechnology), cyclin DI (BD biosciences, San Jose, CA), phospho-Akt (Ser 473) (Cell Signaling Technology), a-tubulin (Sigma, St. Louis, MO) 등으로 생산회사가 추천하는 농도를 사용하였다.
약물 flavopiridol은 Aventis Pharmaceuticals (Bridgewater,NJ) 사로부터 무상제공 받았다. 분말상태의 약물을 실험에 사용하기 전에 DMSO에 1 mM 농도로 희석해 두었다가 세포에 투여 시 세포 배양액에 원하는 농도로 희석하여 투여했다.
5 “g/mL gentamycin 을 첨가한 DMEM (Join Bio Innovation, South Korea) 배지에서 온도 37°C, 5% 이산화탄소 조건에서 배양하였다. 인간 폐암 세포주인 NCI-H460은 American Tissue Culture Collection (ATCC)에서 구입했고 조직학적으로는 폐의 대세포암이었다. 이 세포주는 20% fetal bovine serum을 첨가한 DMEM에서 배양하였다.
인간후두암 세포주인 AMC-HN3는 조직학적으로는 중등도로 분화된 편평상피암이며, 울산의대 아산병원에서 무상으로 분양 받았다. 이 세포주는 10% fetal bovine serum (JRH Biosciences Inc.
데이터처리
유세포 분석기를 이용하여 sub-Gl fraction을 측정하여아포토시스율(평균 土 표준편차)을 구했다.
유세포 분석기를 이용해 구한 sub-Gl fraction은 3회 반복실험 결과를 평균(표준편차로 나타내었고 두 평균치의 비교는 Student's t-test 방법을 이용하였다.
성능/효과
조사하였다. AMC-HN3와 NCI-H460 두 가지 세포주 모두에서 방사선 또는 flavopiridol 단독 처치한 경우보다 방사선과 flavopiridol을 병합 치료했을 때에 capspase-3와 PARP가 더욱 활성화되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
Flavopiridol 단독 처치 후에 두 가지 세포주 모두에서 cyclin D1 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 방사선과 flavopiridol 동시 병합 치료 후의 cyclin D1 발현은 아무 처치도 하지 않은 경우나 방사선 단독 처치한 경우에 비해서 감소하였다.
그러나 NCI-H460 세포주는 Flavo piridol 처치가 p53 및 p21 발현에 변화를 주지 않았다. Flavopiridol은 두 세포주 모두에서 phosphorylated Akt 발현에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.
결론적으로 flavopiridol은 후두암 및 폐암 세포주에서 아포토시스를 증가시킴으로써 방사선 치료 효과를 증진시킬수 있음을 확인하였고, 세포 내 아포토시스 조절 물질에 대한 영향은 세포주에 따라 다르게 나타나는 것을 보았다. 아포토시스 조절 물질에 대한 영향은 향후 gene level에서의 좀 더 많은 연구가 필요하다고 본다.
Jung 등은 위암 및 대장암 세포주에서 flavopirid이이 방사선에 의한 p21 발현을 감소시키는 것으로 보고하였고 이러한 변화가 방사선에 의한 아포토시스 증가와 관련이 있을 것으로 추론한 바 있다11) 즉, 방사선을 조사했을 때 세포의 반응으로 p21 발현이 증가하여 세포 주기상 G1 기 정체(G1 arrest) 로 가는 것을 flavopiridol이 억제하여 방사선에 의한 아포토시스가 증가하는 것으로 생각할 수 있다. 그러나 같은 저자들도 p21 발현 감소 정도와 아포토시스 증가 정도가 꼭 일치하지 않는 것을 관찰하였고, 본 실험에서 NCI-H460 세포주에서는 p21 발현 감소가 관찰되지 않는 것으로 보아이 한가지만으로 flavopiridol 에 의한 아포토시스 증가를 모두 설명할 수는 없을 것으로 본다.
두 세포주 모두에서 방사선 조사 24시간 후에 P53 및 p21 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). Cyclin D1 은 NCI-H460 세포주에서는 방사선 조사 후에 증가했으나 AMC-HN3 세포주에서는 방사선 조사 후에도 아무 처치도 하지 않은 경우와 비교해 차이가 없었다.
정량적 분석을 위해 유세포 분석기를 사용하여 sub-Gl fraction을 구했을 때 방사선 단독 또는 flavo piridol 단독 처치한 경우보다 두 가지를 병합 치료 했을 때에 방사선에 의한 아포토시스가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 방사선에 의한 아포토시스 신호전달 체계의 맨 마지막 단계에서 활성화되는 caspase-3와 이의 substrate 인 PARP cleavage를 면역단백분석으로 조사했을 때 flavo- piridol이 방사선에 의한 아포토시스를 증가시킴을 다시 확인할 수 있었다.
1). 방사선과 Havopiridol 동시 병합치료((R+F)24) 후의 아포토시스율은 41.9±13.4%로서 방사선 단독 혹은 Flavopiridol 단독 처리 후의 아포토시스율보다 통계적으로 유의하게 더 증가하였다 (p<0.05).
2). 방사선과 flavopiridol 동시 병합치료 후의 아포토시스율은 27.1 ±2.2%로서 방사선 단독 처치 후의 아포토시스율과는 통계적으로 유의한 차이가 있었으나(p< 0.05) flavopiridol 단독 처치 후의 아포토시스율과는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 못했다(p=0.08).
예비 실험에서 두 가지 세포주에 대해 flavopiridol의 IC50 (세포 생존율이 50%가 되는 농도)를 구했을 때, AMC-HN3 와 NCI-H460에서 각각 85 nM, 110 nM이었다(상세 결과 생략). 따라서 본 실험에서는 flavopiridol 투여 시 100 nM 농도를 사용하였다.
알아보고자 하였다. 이 중 cyclin 이은 이미 알려진 바와 같이 두 세포주 모두에서 flavopirid이에 의해 발현이 감소됨을 확인 할 수 있었다. 그러나 P53과 p21 은 세포주에 따라 Flavopiridol 처치에 의한 변화가 다르게 나타났다.
하였다. 정량적 분석을 위해 유세포 분석기를 사용하여 sub-Gl fraction을 구했을 때 방사선 단독 또는 flavo piridol 단독 처치한 경우보다 두 가지를 병합 치료 했을 때에 방사선에 의한 아포토시스가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 방사선에 의한 아포토시스 신호전달 체계의 맨 마지막 단계에서 활성화되는 caspase-3와 이의 substrate 인 PARP cleavage를 면역단백분석으로 조사했을 때 flavo- piridol이 방사선에 의한 아포토시스를 증가시킴을 다시 확인할 수 있었다.
후속연구
아포토시스 조절 물질에 대한 영향은 향후 gene level에서의 좀 더 많은 연구가 필요하다고 본다. 또한 향후 본 저자들은 동물 실험을 통해 flavopiridol의 방사선 치료 효과 증진을 다시 확인할 계획이며, 방사선에 의한 DNA 손상 및 복구 기전에 flavopiridol0] 미치는 영향에 대해서도 추가적인 연구가 필요하다고 생각한다.
보았다. 아포토시스 조절 물질에 대한 영향은 향후 gene level에서의 좀 더 많은 연구가 필요하다고 본다. 또한 향후 본 저자들은 동물 실험을 통해 flavopiridol의 방사선 치료 효과 증진을 다시 확인할 계획이며, 방사선에 의한 DNA 손상 및 복구 기전에 flavopiridol0] 미치는 영향에 대해서도 추가적인 연구가 필요하다고 생각한다.
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