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문제 정의
- 따라서 본 연구는 국내 분리 PCV2를 이유자돈에 감염 시켜 PMWS 재연성을 확인하고, 국내 분리 porcine parvovirus(PPV) 와 porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)와의 혼합감염을 통해 PCV2 단독감염 군과의 PMWS 발현 정도를 비교하고 감염 돈 군에 대한 임상증상, 육안 및 병리조직 학적 소견을 통해 국내 PMWS 특이 병변을 확인하고자 하였다. 또한 면역조직화학염색 법 (immunohistochemistry: IHC)과 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 이용하여 조직 내 PCV2 항원분포를 조사하여 국내에서 발생하고 있는 PMWS에 대한 병인론을 밝히고, 국내 분리 PCV27} 면역계에 미치는 영향을 분석하고자 하였다.
- 특이 병변을 확인하고자 하였다. 또한 면역조직화학염색 법 (immunohistochemistry: IHC)과 중합 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 이용하여 조직 내 PCV2 항원분포를 조사하여 국내에서 발생하고 있는 PMWS에 대한 병인론을 밝히고, 국내 분리 PCV27} 면역계에 미치는 영향을 분석하고자 하였다.
- 본 연구는 국내 분리 PCV2에 의한 이유자돈의 병원성과 병인론을 규명하고자 실시하였다.
- 본 연구는 국내에서 분리한 PCV2의 병원성을 확인하고 PCV2 단독감염과 국내 분리 PPV와 PRRSV의 혼합감염을 통해 PMWS 발병양상을 병리학적으로 비교 평가함으로써 PCV2 감염에 의한 PMWS의 병인론을 밝히고자 하였다. PCV2 단독감염군에서는 특징적인 임상 증상, 병리학적 소견이 관찰되지 않았으며, 아주 미약한림프절의 림프구 괴사만이 관찰되었고 전 두수에서 건강한 상태를 유지하였다.
- 즉, PMWS의 발생기전은 돼지의 면역계의 반응과 밀접한 관련이 있을 것으로 추측된다. 이 같은 사실에 근거하여 본 연구에서도 각 군에 대하여 PCV2 감염에 따른 면역계의 변화를 관찰하고자 IL-la, 1L-2R, IL-8 mRNA 발현을 전두수의림프절에 대해 조사하였다. IL-la는 단핵구계 세포와 B 림프구에서 분비되어 B와 T 림프구의 활성을 촉진하는 cytokine으로 PMWS 감염돈의 경우, PBMC와 림프절에서 분비가 감소되는 양상을 보인다는 보고가 있다.
제안 방법
- 24두의 이유자돈은 6두씩 4개군으로 나누었으며 무처치대조군, PCV2 단독감염군, PCV2/PRRSV 혼합감염군, PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군으로 실험개시일에 각각의 바이러스 접종액을 1 ml 씩 비강내 1회 접종하였다.
- PCV1과 PCV2를 구별할 수 있는 primer는 Pograni- chnyy 등 [15]의 빙법으로 제작하여 이유자돈의 각 장기에 대해 유전자 검사를 실시하였다.
- Primer design: IL-la, 1L-2R, IL-8, IL-10, GAPDH (housekeeping gene) primer는 real-time PCR을 위해 TaKaRa(Japan) 에 디자인과 합성을 의뢰하여 Table 1과같이 제작하여 사용하였다.
- RNA 추출 및 RT-PCR: 전신림프절은 pooling하여 RNeasy Mini Kit(Qiagen, USA)로 추출하였으며, RNA 1 jig과 OligodT primer 1 jj, g(lnvitrogen, USA)을 RT-PCR mixture(Omniscript RT-PCR kit; Qiagen, USA)에 첨가하여 cDNA를 작성하였다.
- 각 군의 이유자돈 림프절에 대한 cytokine expression 을 비교 . 분석한 결과, 실험개시 3주에서 IL-la의 발현은 무처 치 대조군과 PCV2 단독감염군 사이에서는 큰 변화가 없었으나, PCV2/PRRSV 혼합감염군과 PCV2/ PRRSV/PPV 혼합감염군에서는 유의성 있게 감소되는양상을 나타내었다.
- 각 군의 이유자돈은 공격접종 후 3주와 6주에 부검을 실시하여 장기의 병변을 관찰하였고 병리조직학적 소견을 관찰하기 위하여 노〕, 척수, 폐, 심장, 간장, 비장, 신장, 회장, 편도, 전신림프절을 채취하여 10% 중성 포르말린에 고정한 후 일반적인 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매하고 3~4 jim 두께의 조직 절편을 제작하여 hematoxylin 과 eosin(H&E) 염색 후 광학현미경하에서 관찰하였다.
- Steven Sorden; Iowa State University, USA)를 1 : 10, 000으로 희석하여 42℃ 에 서 32분간 처리한 다음 biotinylated anti-rabbit IgG (Dako, USA) 이차항체에 20분간 반응시켰고, DABMap kit(Ventana Medical Systems, USA)N로 발색시켰다. 대조염색은 Mayer's hematoxylin(Ventana Medical Systems, USA)과 Bluing solution(Ventana Medical Systems, USA) 으로 염색하여 광학현미경으로 검경하였다.
- 실험접종 전 두수에 대한 항체 수준을 검사하기 위하여 PCV2와 PRRSV는 간접형광항체 검사기법으로, PPV 는 혈구응집억제 반응(hemagglutination inhibition test)으로 혈청검사를 수행하였다.
- 일차 항체는 rabbit anti-PCV2 antibody(Dr. Steven Sorden; Iowa State University, USA)를 1 : 10, 000으로 희석하여 42℃ 에 서 32분간 처리한 다음 biotinylated anti-rabbit IgG (Dako, USA) 이차항체에 20분간 반응시켰고, DABMap kit(Ventana Medical Systems, USA)N로 발색시켰다. 대조염색은 Mayer's hematoxylin(Ventana Medical Systems, USA)과 Bluing solution(Ventana Medical Systems, USA) 으로 염색하여 광학현미경으로 검경하였다.
대상 데이터
- PCV2 이D368 stmine 국내에서 PMWS로 진단된 돼지의 림프절에서 분리하였으며, PCV2 접종액은 PCV1 free PK-15 cell line에 11대 계대배양하여 1.0 x 107 TCID»/ml로 농축하여 사용하였다.
- PPV VRI-stmine 유산태아에서 분리된 바이러스로 swine testis cell line에 4대 계대배양하여 1.0 x 104 TC1D5q/ ml로 실험에 사용하였다.
- PRRSV 03D026 straine 국내에서 PRRS로 진단된 돼지의 폐에서 분리하였으며, PRRSV 접종액은 분리된 바이러스를 MA-104 cell line에 3대 계대배양하여 1.0 x 105 TCID»/ml로 실험에 사용하였다.
- 국내 분리 PCV2의 이유자돈에서의 병원성 시험을 실시하기 위해 21일령 이유자돈 24두를 PCV2 단독감염 군, PCV2/PRRSV 혼합감염군, PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군으로 나누어 실험에 사용하였다.
- 실험동물은 삼원교잡종인 21일령 이유자돈 수컷 24두를 사용하였고, PRRSV는 eneme-linked immunosorbent assay(ELlSA), PPV는 혈구응집반응(hemagglutination test), PCV2는 간접형광항체검사법 (indirect fluorescent antibody test)을 이용하여 항체검사를 실시하였으며 각 바이러스에 대한 항체가가 음성인 실험동물을 농장에서구입하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 통계분석: 상대정량값은 cytokine gene의 threshold cycle(Ct) 값에 housekeeping gene의 threshold cycle(Ct) 값을 나눈 값으로 하였으며, 본 실험에서 얻어진 자료는 AN OVA test(GraphPad Instat 3.0 version; GraphPad Software, USA)를 이용하여 분석하였고 대조군과의 유의성은 95% 수준에서 실시하였다.
성능/효과
- IHC와 PCR을 이용하여 전 군의 이유자돈 장기에 대해 PCV2 항원과 핵산의 분포를 조사한 결과에서 PCV2 단독감염군은 1두의 편도와 림프절에서만 PCV2 핵산이 검출되었으나, PCV2 항체가는 전두수에서 나타났다. 이는 바이러스혈증 상태에서 전신 장기로 PCV2가 침입하지 못한 것을 의미한다.
- PCR 기법을 이용하여 각 군의 이유자돈 장기에 대한 PCV2 특이 핵산을 검출한 결과, PCV2 단독감염군은 1 두, PCV2/PRRSV 혼합감염군은 5두의 림프장기에서 PCV2 특이 핵산이 검출되었다. PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군은 전 두수에서 림프장기와 폐에서 PCV2 특이 핵산이 검줄되었다.
- 7 & 8). PCV2 단독감염군에서는 PCV2 특이 항원이 검출되지 않았으나, PCV2/PRRSV 혼합감염군에서는 5두에서, PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군은전두수에서 PCV2 항원이 검출되었으며 1두에서는 뇌를 포함한 모든 장기에서 PCV2 특이 항원이 검출되었다 (Table 5).
- PCV2 특이 항체를 이용한 IHC 결과, PCV2 항원 분포는 림프장기와 폐에 집중되어 있었으며, 주로 조직구, 다핵거대세포 등의 단핵구계 세포의 세포질 내에 분포하고 있었다(Fig. 7 & 8). PCV2 단독감염군에서는 PCV2 특이 항원이 검출되지 않았으나, PCV2/PRRSV 혼합감염군에서는 5두에서, PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군은전두수에서 PCV2 항원이 검출되었으며 1두에서는 뇌를 포함한 모든 장기에서 PCV2 특이 항원이 검출되었다 (Table 5).
- PCV2 항원과 핵산을 조사한 결과에서 PCV2 단독감염 군은 편도와 림프절에서만 PCV2 핵산이 검출된데 반하여 PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군의 개체에서는 전신 장기에 PCV2 항원과 핵산이 확인되었다.
- PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군은 위축, 거친 피모, 기침 등의 전형적인 PMWS 임상증상이 관찰되었으나(Fig. 1), PCV2 단독감염군과 PCV2/PRRSV 혼합감염군은 일부의 개체에서 거친 피모, 기침 등의 경미한 증상만이 관찰되었다. 무처치 대조군에서는 아무런 임상증상이 관찰되지 않았다(Table 2).
- PCV2 항체 양성을 보였다. PRRSV는 PCV2/ PRRSV 혼합감염군과 PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군에서 항체 양성반응이 관찰되었고, PPV는 PCV2/PRRSV/ PPV 혼합감염군에서 1, 024배 이상의 높은 항체 역가를 보였으며 다른 군에서는 모두 음성이었다.
- 각 군에 대한 Cytokine mRNA 발현을 조사한 결과, PCV2/PRRSV 혼합감염군과 PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군에서 IL-la, 1L-2R, IL-8이 무처치대조군에 비해 감소하였고 이러한 cytokinee] 변화는 T cell의 감소와 함꼐 전반적인 면역계의 억제와도 관련이 있을 것으로 사료된다.
- 각 군의 이유자돈에서 PCV2, PRRSV PPV에 대한 혈청검사를 실시한 결과, PCV2 단독감염군, PCV2/PRRSV 혼합감염군, PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군의 전 두수에서 PCV2 항체 양성을 보였다. PRRSV는 PCV2/ PRRSV 혼합감염군과 PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군에서 항체 양성반응이 관찰되었고, PPV는 PCV2/PRRSV/ PPV 혼합감염군에서 1, 024배 이상의 높은 항체 역가를 보였으며 다른 군에서는 모두 음성이었다.
- 각 군의 임상증상은 주로 위축과 호흡기증상으로 나타났으며, PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군에서 PMWS가관찰되었다. 또한 육안소견에서도 PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군의 돼지에서 전신림프절의 종대와 폐의 퇴축부전이 관찰되었고 병리조직학적 소견으로도 PCV2 특이봉입체의 관찰, 육아종성 림프절염, 림프구의 소실 등의 전형적인 PMWS 병변이 관찰되었다.
- 또한, PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군의 1두에서는 뇌를 포함한 전신 장기에 PCV2 항원이 분포하고 있었고 동일 군의 다른 돼지에 비해 현저하게 위축되어 있었으며 병리조직학적 소견에서도 PCV2 특이 봉입체가 관찰되었다. 따라서, 조직 내 PCV2 항원분포 결과를 통하여 PCV2에 의한 PMWS는 PRRSV와의 혼합감염 보다는 PRRSV/PPV와의 혼합감염이 이루어졌을 때 발병함을 알 수 있었다. 이는 PCV2의 항원이 림프구계 장기에서만 관찰될 시에 준임상형으로 경과되는 반면, 폐, 간, 신장 등의 실질장기에서 검출될 때에 PMWS의 임상 형으로 발전한다는 보고 [14, 16, 1기와도 일치하는 것이다.
- 이는 국내에서 발생하는 전형적인 PMWS 는 PCV2 단독감염보다는 다른 원인체와의 혼합감염에 의해 유도되고 있음을 시사하는 것이며, 림프장기, 폐, 신장, 간 등의 실질장기에 PCV2가 침투한 후에 PMWS로진행됨을 알 수 있었다. 또한 PCV2 감염과 다른 원인체와의 혼합감염에 의한 B와 T 림프구 유래 cytokine의 발현 감소와 그에 따른 면역억제가 PMWS의 발생과 진행에 밀접한 관련이 있을 것으로 판단되었다.
- 또한 육안소견에서도 PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군의 돼지에서 전신림프절의 종대와 폐의 퇴축부전이 관찰되었고 병리조직학적 소견으로도 PCV2 특이봉입체의 관찰, 육아종성 림프절염, 림프구의 소실 등의 전형적인 PMWS 병변이 관찰되었다.
- 반면, PCV2/PRRSV 혼합감염군 또는 PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군은 대부분 이유자돈의 림프장기와 폐에 PCV2 항원과 핵산이 분포하고 있어 PCV2가 장기내로 침입하였음을 확인할 수 있었다. 또한, PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군의 1두에서는 뇌를 포함한 전신 장기에 PCV2 항원이 분포하고 있었고 동일 군의 다른 돼지에 비해 현저하게 위축되어 있었으며 병리조직학적 소견에서도 PCV2 특이 봉입체가 관찰되었다. 따라서, 조직 내 PCV2 항원분포 결과를 통하여 PCV2에 의한 PMWS는 PRRSV와의 혼합감염 보다는 PRRSV/PPV와의 혼합감염이 이루어졌을 때 발병함을 알 수 있었다.
- 이는 바이러스혈증 상태에서 전신 장기로 PCV2가 침입하지 못한 것을 의미한다. 반면, PCV2/PRRSV 혼합감염군 또는 PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군은 대부분 이유자돈의 림프장기와 폐에 PCV2 항원과 핵산이 분포하고 있어 PCV2가 장기내로 침입하였음을 확인할 수 있었다. 또한, PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군의 1두에서는 뇌를 포함한 전신 장기에 PCV2 항원이 분포하고 있었고 동일 군의 다른 돼지에 비해 현저하게 위축되어 있었으며 병리조직학적 소견에서도 PCV2 특이 봉입체가 관찰되었다.
- 본 연구를 통해 국내에서 분리된 PCV2는 이유자돈에단독으로 감염 되 었을 때 에는 무증상을 보였으나 PRRSV 또는 PPV와의 혼합감염이 되었을 때에는 경미한 증상을 보이거나, 전형적인 PMWS 증상을 유발하는 것으로 평가되었다. 이는 국내에서 발생하는 전형적인 PMWS 는 PCV2 단독감염보다는 다른 원인체와의 혼합감염에 의해 유도되고 있음을 시사하는 것이며, 림프장기, 폐, 신장, 간 등의 실질장기에 PCV2가 침투한 후에 PMWS로진행됨을 알 수 있었다.
- [3, 4, 6, 10]. 본 연구에서 1L-2R 발현은 PCV2를 감염시킨 군들에서 무처치 대조군에 비해 감소되는 양상을 보였는데, 이는 림프절의 손상으로 인한 T 림프구의 소실을 간접적으로 시사하는 결과라고 할 수 있다. IL-8의 발현은 실험개시 3주에 PCV2 단독감염군과 무처치 대조군에서 비슷한 발현양상을 보여 감염의 초기단계일 것으로 생각되나, PCV2/PRRSV 혼합감염군과 PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군에서는 유의차 있게 감소하여 다른 바이러스와의 혼합감염으로 인하여 임상증상이 심화되었을 것으로 판단된다.
- [3]. 본 연구에서 IL-10 발현은 실험개시 3주와 6주의 모든 군에서 유의성이 없었다. 이는 Darwich 등[3]이 PMWS 감号 돈의 흉선위축 및 소실과 관련하여 IL-10이 과도 발현된다는 결과와 차이를 나타내었으나, 본 연구에서는 림프절에 국한하여 1L-10 발현을 확인한 것으로 흉선에서의 발현양상과 차이를 보인 것으로 사료된다.
- [3, 4, 6, 10]. 본 연구에서 실험개시 3주에 PCV2/PRRSV 혼합감염군과 PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군은 대조군과 PCV2 단독감염군에 비해 발현이 감소되는 양상을 보였으며, 6주에서는 PCV2를 감염시킨 전 군에서 감소되었다. IL-la의 감소는 단핵구계 세포에서 PCV2가 증식하여 기능을 제대로 수행하지 못했을 것으로 생각되어지며, 병리조직학적 소견에서도 림프절 germinal center의 괴사는 B 림프구의 감소를 동반하여 IL-la의 발현을 감소시켰을 것으로 사료된다.
- 비교 . 분석한 결과, 실험개시 3주에서 IL-la의 발현은 무처 치 대조군과 PCV2 단독감염군 사이에서는 큰 변화가 없었으나, PCV2/PRRSV 혼합감염군과 PCV2/ PRRSV/PPV 혼합감염군에서는 유의성 있게 감소되는양상을 나타내었다. IL-2R의 발현은 PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군에서만 감소되는 양상이 관찰되었다.
- IL-8의 발현은 실험개시 3주에 PCV2 단독감염군과 무처치 대조군에서 비슷한 발현양상을 보여 감염의 초기단계일 것으로 생각되나, PCV2/PRRSV 혼합감염군과 PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군에서는 유의차 있게 감소하여 다른 바이러스와의 혼합감염으로 인하여 임상증상이 심화되었을 것으로 판단된다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때, PCV2의 감염이 림프절의 기능변화를 초래하여 면역억제를 유발하였을 것으로 생각되며 PRRSV 또는 PPV와의 혼합감염이 면역계를 더욱 억제하여 PMWS 발생을 초래하였을 것으로 사료된다.
- 이상의 연구 결과, 국내 분리 PCV2는 PRRSV 또는 PPV와의 혼합감염에 의해 PMWS의 병변이 심하게 진행되며, PCV2에 의해 면역계의 변화를 초래해 더욱 심한 병증을 유발할 것으로 판단된다.
- 또한 각 장기 내에서 PCV2 항원이 검출되어 PMWS로 진단할 수 있는 3가지 기본 조건에 부합되는 돼지는 PCV2/PRRSV/PPV 혼합감염군에서만 관찰되었다. 이와 같은 결과는 PMWS의발병 요건에서 PCV2/PRRSV/PPV의 혼합감염이 PMWS 의 발병을 위하여 매우 중요한 요소임을 강력히 시사함은 물론, PMWS의 발생에 있어 PPV의 역할과 관련하여, PPV가 림프계 조직에서 증식하여 면역세포의 기능을 억제함으로써 PCV2의 증식을 촉진하는 것으로 생각된다 [1, 8], 또한 PRRSV도 면역 력 저하를 일으키는 바이러스로 알려져 있어 PMWS의 발현은 여러가지 바이러스가 복합적으로 감염되면 더 잘 발생할 것으로 사료된다. 이는 PCV2 단독감염군에서 특이적인 육안소견 및 병리학적 소견이 없었고 PCV2/PRRSV 혼합감염군에서는 경미한 병리학적 소견이 관찰된 것으로 보아 추측할 수 있다.
- 관찰되었다. 폐는 간질성 폐렴, 기관지주위 섬유화와 림프소절의 증식 이 관찰되었고(Fig. 3 & 4), 전신림프절은 다핵거대세포와 조직구의 침윤이 특징적인 육아종성 림프절염이관찰되었으며, 림프소절의 geminal center 부위에 림프구의 괴사와 소실도 뚜렷이 관찰되었고 1두에서는 전형적인 PCV2 특이 호염성 세포질 내 봉입체가 관찰되었다(Fig. 5 & 6). 기타 장기의 소견으로 다발병소성 비화농성 간질성 신염, 비화농성 심근염, 비화농성 뇌염 등의 소견이 관찰되었다(Table 4).
후속연구
- 있다. 따라서, 바이러스뿐 아니라 이들 세균과의 연관성, 환경적 스트레스, 그리고 백신과 같이 면역계에 변화를 줄 수 있는 잠재적인 요인 등에 대해서 추가적인 연구가 있어야 할 것이다.
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