Trinitrobenzene sulfonic acid에 의해 유발된 랫드의 대장염에서 HemoHIM의 항염증 효과 Anti-inflammatory activities of a herbal preparation (HemoHIM) in colitis induced by trinitrobenzene sulfonic acid in rats원문보기
The cause and pathogenesis of inflammatory bowel disease remain unknown and no definitetherapy exists until now. The present study was conducted to investigate the anti-inflammatory effectsof a herbal preparation (HemoHIM) in colitis induced by 30 mg of trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)in rats. S...
The cause and pathogenesis of inflammatory bowel disease remain unknown and no definitetherapy exists until now. The present study was conducted to investigate the anti-inflammatory effectsof a herbal preparation (HemoHIM) in colitis induced by 30 mg of trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)in rats. Sprague-Dawley rats were divided into 5 groups. Each group was treated with 1 mg ofHemoHIM/ml of drinking water, 4 mg of HemoHIM/ml of drinking water, 50 mg of HemoHIM/kgof body weight (i.p. once every other day) or 10 mg/kg of HemoHIMof body weight (i.p. onceevery other day) from the next day. After 2 weeks, rats were sacrificed and morphologic featuresof colons were examined. Ulceration, adhesion, thickening and dilatation were noticed in the colonicmucosa after TNBS instillation. Intraperitoneal injection of HemoHIM (50 and 100 mg/kg of bodyweight) showed the anti-inflammatory effect on adhesion, thickening, dilatation, ulceration, and theinhibition effect on damage score by 72.7% and 90.9%, respectively. Histologically, the colon of TNBS-treated rat showed inflammatory cell infiltration by polymorphonuclear cells, multiple erosive lesionsignificant improvement in these symptoms. The results obtained suggest marked anti-inflamatoryactivity of the HemoHIM at the dose levels examined.
The cause and pathogenesis of inflammatory bowel disease remain unknown and no definitetherapy exists until now. The present study was conducted to investigate the anti-inflammatory effectsof a herbal preparation (HemoHIM) in colitis induced by 30 mg of trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)in rats. Sprague-Dawley rats were divided into 5 groups. Each group was treated with 1 mg ofHemoHIM/ml of drinking water, 4 mg of HemoHIM/ml of drinking water, 50 mg of HemoHIM/kgof body weight (i.p. once every other day) or 10 mg/kg of HemoHIMof body weight (i.p. onceevery other day) from the next day. After 2 weeks, rats were sacrificed and morphologic featuresof colons were examined. Ulceration, adhesion, thickening and dilatation were noticed in the colonicmucosa after TNBS instillation. Intraperitoneal injection of HemoHIM (50 and 100 mg/kg of bodyweight) showed the anti-inflammatory effect on adhesion, thickening, dilatation, ulceration, and theinhibition effect on damage score by 72.7% and 90.9%, respectively. Histologically, the colon of TNBS-treated rat showed inflammatory cell infiltration by polymorphonuclear cells, multiple erosive lesionsignificant improvement in these symptoms. The results obtained suggest marked anti-inflamatoryactivity of the HemoHIM at the dose levels examined.
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문제 정의
HemoHIM의 주요 구성 단미인 당귀, 천궁 및 백작약은 식품공전에 등재되어있는 무독성의 물질이며, 복합제로서도 독성 효과를 전혀 나타내지 않은 물질로 알려져 있다 [1]. 따라서 HemoHIMe 안전한 천연물 유래 항염증 효과 식품의 가능성을 제시하였다.
[9, 17, 27], 조직학적으로는 TNBS를 주입하고 2시간 후에 이미 점막 상피세포의 미란이 발생한다고 알려져 있으며 [27], 48시간 후에 이미 급성 궤양의 육안적 소견이 발견되고 약 2주후에 만성 염증으로 이행하는 정도가 심한 것으로 보고되었다 [9], 본 실험에서는 백서에 TNBS를 주입 하여 대장염을 유발시 켰으며 , 24시간 후 시료를 투여하기 시작하여 2주후 결과를 판정하였다. 따라서 본 실험은 TNBS에 의해 유발된 급성대장염의 치유 효과의 평가로 볼 수 있다.
이러한 관점에서, HIM-I로부터 면역조혈증진 효능이 더욱 강화된 새로운 생약복합조성물을 개발하고자 HIM-I에 그 조다 당 분획이 첨가된 HemoHIM을 제조하였다 [7]. 방사선 치료 암환자를 대상으로 HemoHIM의 효과를 검색하는 과정에서 환자치료 시 수반되는 염증의 발생억제 및 증상개선의 가능성이 제기되어 본 연구에서는 TNBS로유도된 대장염에 대한 HemoHIM의 항염증효과 유무를 파악하고자 하였다.
방사선 생체손상의 방호 및 회복을 위해서는 일차적인 조직의 방호뿐만 아니라 이차적인 면역 조혈계의 회복촉진이 더욱 중요하고 면역조혈기능이 다양한 생체질환의 예방 및 개선에 중추적인 작용을 한다. 이러한 관점에서, HIM-I로부터 면역조혈증진 효능이 더욱 강화된 새로운 생약복합조성물을 개발하고자 HIM-I에 그 조다 당 분획이 첨가된 HemoHIM을 제조하였다 [7]. 방사선 치료 암환자를 대상으로 HemoHIM의 효과를 검색하는 과정에서 환자치료 시 수반되는 염증의 발생억제 및 증상개선의 가능성이 제기되어 본 연구에서는 TNBS로유도된 대장염에 대한 HemoHIM의 항염증효과 유무를 파악하고자 하였다.
가설 설정
b: HemoHim (4 mg of solids/ml of drinking water) was given for 14 days after TNBS inflision.
d: HemoHim (100 ㎎/㎏ of body weight) was given i.p. once every other day for 14 days after TNBS inflision.
제안 방법
TNBS는 50%(v/v) unbuffered ethanol에 섞 어 25 mg/ml의 농도로 제조하고 랫드 마리당 30 mg을 주입하였다. TNBS 주입 1일 후 HemoHim을 경구투여(음수 ml 당 1 mg 또는 4 mg의 용량으로 14일간 투여) 또는 복강 내 주사(체중 kg당 50 mg 또는 100 mg의 용량으로 2일에 1회, 14일간 투여)하고 시험 개시 후 14일에 경추 탈골 법으로 실험동물을 도태시켰다.
이 중 acetic acid와 TNBS가 가장 널리 이용되었는데 최근에는 acetic acid보다 TNBS가 사람의 염증성 대장염에 유사한 병변을 일으킨다고 보고 된 바 있다. [9, 17, 27], 조직학적으로는 TNBS를 주입하고 2시간 후에 이미 점막 상피세포의 미란이 발생한다고 알려져 있으며 [27], 48시간 후에 이미 급성 궤양의 육안적 소견이 발견되고 약 2주후에 만성 염증으로 이행하는 정도가 심한 것으로 보고되었다 [9], 본 실험에서는 백서에 TNBS를 주입 하여 대장염을 유발시 켰으며 , 24시간 후 시료를 투여하기 시작하여 2주후 결과를 판정하였다. 따라서 본 실험은 TNBS에 의해 유발된 급성대장염의 치유 효과의 평가로 볼 수 있다.
대장을 적출하는 동안 주위 조직과의 유착 여부와 내강의 확장 여부를 관찰하였으며, 대장을 적출한 후 종축으로 절개하여 생리식염수로 세척하고, 점막의 비후 여부를 관찰하였다. 주위 조직과의 유착여부, 점막의 비 후 여부 등은 그 정도를 객관적으로 정할 수 없으므로 유착, 확장 및 비후 등이 확연한 경우에 한해 유무만을 평가하였다.
사용하였다. 동물의 사육은 온도 22 + 2℃, 상대습도 50 ±10%, 조명시간은 12시간(오전 8시 점등-오후 8 시 소등) 및 조도 200-300 lux로 설정된 시설에서 수행하였다. 순화기간을 거쳐 polycarbonate 사육상자에 3-4 마리씩 수용하였고 실험동물용 고형사료(삼양사료, 한국)와 정수장치를 통과한 수도수를 자유롭게 섭취하도록 하였다.
참고하여 각각 2용량을 적용하였다. 랫드를 마취시킨 후 외경 0.2 cm, 길이 8 cm의 polyethylene catheter를 항문으로 삽입하여 TNBS(2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid, Sigma, USA) 용액을 주입하여 대장염을 유발시켰다. TNBS는 50%(v/v) unbuffered ethanol에 섞 어 25 mg/ml의 농도로 제조하고 랫드 마리당 30 mg을 주입하였다.
HIM-I의 일부를 취하여 4배 부피의 100% 에탄올을 첨가하고 25℃ 이하에서 16시간 정치한 후, 원심분리하여 침전된 조다당 분획을 수거하였다. 수거한 조다당 분획의 일부를 이에 해당하는 HIM-I에 첨가하여 생약복합조성물 HemoHIM을 제조하였다. HemoHIMe 동결건조하여 실험적용시까지 냉동 저장하였다.
동물의 사육은 온도 22 + 2℃, 상대습도 50 ±10%, 조명시간은 12시간(오전 8시 점등-오후 8 시 소등) 및 조도 200-300 lux로 설정된 시설에서 수행하였다. 순화기간을 거쳐 polycarbonate 사육상자에 3-4 마리씩 수용하였고 실험동물용 고형사료(삼양사료, 한국)와 정수장치를 통과한 수도수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험동물은 Institute of Laboratory Animal Resources의 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animal'(1996, USA)에 준하여 취급하였다.
실험군은 TNBS 단독처리대조군, HemoHIM 경구투여군 및 HemoHIM 복강내 주사군으로 분류하였으며 HemoHIM 적용용량은 이전 시행된 연구의 결과 [1, 2] 를 참고하여 각각 2용량을 적용하였다. 랫드를 마취시킨 후 외경 0.
제조과정을 간단히 설명하면, 한약재 시장에서 구입한 생약재 3종 즉, 당귀(Danggui, Angelica gigas Nakai)의 뿌리, 천궁 (Chuanxiong, Cnidium offinale Makino)의 근경, 백작약 (Baishaoyao, Pae-onia japonlca Miyabe)의 뿌리를 동일한 무게비율로 혼합한 후 혼합 생약재 100 g당 증류수 1, 000 ml을 가하고 4시간 열탕 추출하였다. 추출물의 고형분을 제거하고 감압농축하여 생약복합물 HIM-I을 얻었다(수율은 35%).
관찰하였다. 주위 조직과의 유착여부, 점막의 비 후 여부 등은 그 정도를 객관적으로 정할 수 없으므로 유착, 확장 및 비후 등이 확연한 경우에 한해 유무만을 평가하였다. 대장의 육안적 손상 정도는 절개된 대장의 발적 유무, 궤양 유무 그리고 궤양의 크기에 따라 0에서 10까지 정하였다{Table 1) [26].
제조과정을 간단히 설명하면, 한약재 시장에서 구입한 생약재 3종 즉, 당귀(Danggui, Angelica gigas Nakai)의 뿌리, 천궁 (Chuanxiong, Cnidium offinale Makino)의 근경, 백작약 (Baishaoyao, Pae-onia japonlca Miyabe)의 뿌리를 동일한 무게비율로 혼합한 후 혼합 생약재 100 g당 증류수 1, 000 ml을 가하고 4시간 열탕 추출하였다. 추출물의 고형분을 제거하고 감압농축하여 생약복합물 HIM-I을 얻었다(수율은 35%). HIM-I의 일부를 취하여 4배 부피의 100% 에탄올을 첨가하고 25℃ 이하에서 16시간 정치한 후, 원심분리하여 침전된 조다당 분획을 수거하였다.
대장의 육안적 손상 정도는 절개된 대장의 발적 유무, 궤양 유무 그리고 궤양의 크기에 따라 0에서 10까지 정하였다{Table 1) [26]. 현미경적 소견의 관찰을 위해 대장을 중성포르말린으로 고정 한 후, 병변이 심한 부위에서 횡으로 약 1 cm 정도로 시료를 채취하고 절편을 제작하였으며 대조군이나 병변이 확실하지 않은 군에서는 다른 군에서 병변이 심하게 관찰되었던 항문에서 약 5 cm 상방에서 시료를 채취하고 절편을 제작하여 H-E염색을 시행하였다.
대상 데이터
미국 국립보건원(National Institute of Health)에서 분양받아 한국원자력연구소에서 사육한 7주령의 SD계 랫드를 사용하였다. 동물의 사육은 온도 22 + 2℃, 상대습도 50 ±10%, 조명시간은 12시간(오전 8시 점등-오후 8 시 소등) 및 조도 200-300 lux로 설정된 시설에서 수행하였다.
시험에 사용한 시료(HemoHM)는 주관연구기관인 한국 원자력연구소의 기술제공에 따라 제조된 완성시료를 (주)선바이오텍에서 공급 받아 사용하였다. 제조과정을 간단히 설명하면, 한약재 시장에서 구입한 생약재 3종 즉, 당귀(Danggui, Angelica gigas Nakai)의 뿌리, 천궁 (Chuanxiong, Cnidium offinale Makino)의 근경, 백작약 (Baishaoyao, Pae-onia japonlca Miyabe)의 뿌리를 동일한 무게비율로 혼합한 후 혼합 생약재 100 g당 증류수 1, 000 ml을 가하고 4시간 열탕 추출하였다.
데이터처리
모든 성적의 분석은 Graph PAD In Plot program(GPIP; Graph PAD software, USA)을 사용하였으며 Chi-square test 및 studenfs f-test를 이용하여 통계적 분석을 하였다.
성능/효과
TNBS 유발 대장염 대조군의 대장의 현미경적 소견으로 점막의 괴사 및 부종이 관찰되었고, 점막과 점막 밑 조직, 근육층에 걸쳐 광범위한 염증세포의 침윤이 관찰되었다(Fig. 2B). HemoHIM 경구투여군의 대장에서는 대조군에 비하여 점막세포의 재생과 점막과 점막 밑 조직의 부종과 염증세포침윤이 경미하였다(Fig.
1). 대장의 주위 조직과 유착은 모든 실험군에서 경미하거나 발생되지 않았으며 HemoHIM 복강내 주사 군에서 내강의 확장은 완화되었고 점막 비후 변화 또한 HemoHIM 처치군에서 개선되었다(Fig. 1, Table 2). 충혈 및 궤양 등의 대장 손상 정도를 보면, TNBS로 병변을 유발한 군에서 점수가 높아 심한 궤양이 생긴 것을 알 수 있었고, 경구투여의 경우 평균치에서는 50% 이상의 효과를 나타내나 개체차로 인하여 유의성은 없었으며, 복강내 주사군의 경우, 장해등급 평균치를 기준으로 50 mg 투여군에서는 72.
본 연구의 결과에서 HemoHIMe TNBS 유발 대장염 실험에서 항염증 반응을 나타냈다. 특히 복강내 주사 군은 물론, 경구투여 군에서도 손상경감 효과를 나타내어 우수한 항염증 후보식품 가능성이 확인되었다.
1, Table 2). 충혈 및 궤양 등의 대장 손상 정도를 보면, TNBS로 병변을 유발한 군에서 점수가 높아 심한 궤양이 생긴 것을 알 수 있었고, 경구투여의 경우 평균치에서는 50% 이상의 효과를 나타내나 개체차로 인하여 유의성은 없었으며, 복강내 주사군의 경우, 장해등급 평균치를 기준으로 50 mg 투여군에서는 72.7%, 100 mg 투여군에서는 90.9% 로 투여용량에 비례하여 유의성 있는 손상 경감 효과를 나타냈다(Fig. 2A-4A, Table 3).
항염증 반응을 나타냈다. 특히 복강내 주사 군은 물론, 경구투여 군에서도 손상경감 효과를 나타내어 우수한 항염증 후보식품 가능성이 확인되었다. HemoHIM 은 당귀, 천궁 및 백작약을 기본으로 하고 면역증진 및 조혈 효과를 보강한 복합제제 식품으로 개발되었다 [7], 구성 단미 중 당귀는 polyacethylene 성분이 염증 치료 효과가 있다고 알려진바 있으나 [4], 사물탕 및 구성 단미의 효과 검증 연구에서는 당귀 물 추출물의 항염증 효과는 관찰되지 않았다고 보고되었다 [6], 천궁은 최근 당뇨병 환자에 대한 효과 연구에서 항염증 작용이 확인되었으며 [16], 사물탕에 대한 연구에서도 항염증 효과가 입증되었다 [6], 백작약은 사물탕의 항염증효과에 주단 미로서의 작용을 나타낸다고 보고되었다 [6], 한편 당귀의 다당류분획이 알콜과 indomethacin에 의해 유발되는 위장관 장해에 대하여 항염증효과를 나타내어 점막 손상을 예방한다는 보고가 있었다 [5], HemoHIM의 구성 단미가 위와 같은 각각의 효능을 가지는 이유로 이들 3 가지의 구성 단미의 효능과 함께, 면역 증진 및 조혈효과를 보강하기위하여 첨가된 다당류분획의 효과가 HemoHIM의 항염증 작용으로 나타난 것으로 사료된다.
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