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문제 정의
- 본 실험에서 사용한 Houttuynia cordata root(어성초 뿌리) 메탄올 추출액이 non-lipids에 대하여 산화적 손상을 유발할지 또는 산화적 손상을 예방 할 수 있는 가능성의 여부는 연구된 바가 없다. 본 연구의 목적은 비지질성 산화적 손상에 대한 어성초 뿌리 메탄올 추출액의 항산화 효과를 조사하는 것이다.
제안 방법
- 4) 3 ml로 OH radical을 유도하고 여기에 각 시료를 농도별로 첨가하여 25%:에서 90분간 반응 시킨 후 550nm에서 cytochrome C의 색깔 변화의 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료대신 thiourea® 사용하였고 이때 thiourea에 의해 유도된 OH radical의 억제율(%)을 100%로 하였으며, 억제율(%)은 다음과 같이 산줄하였다.
- 이 혼합 용액을 thiobarbituric acid(TBA)방법으로 [25] 37%:에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 lecithin을 제외한 다른 시약들이 들어간 sample을 blank로 하여 532nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 45 jim 로 여과한 후 HPLC(Water? USA)로 분석하였다. 분석에 이용된 칼■럼은 Wter E2241F(103 mm x 1 mm, 0.5 μm) 과 UV detector(254 nm)< 사용하였고 이동상 용매는 50 mM KH2PO4(pH 4.61)-methanol(92 : 8 v/v), 유속은 0.5 ml /min로 컬럼을 평행 시킨 후 표준 2七dG 와 8-hydroxy-2-deoxyguanosine(8-OH-2'dG)l' 주입하여 retention time 과 peak areas 값으로 분석 비교하였다.
- 시료의 추출은 수직으로 환류 냉각관을 부착시킨 2구환저플라스크에 음건 세절한 약초 300 g에 메탄올 900 ml 을 가하여 수욕 상에서 3시간 동안 환류 냉각하면서 3 회 반복 추출하여 얻어진 용액을 합하고 여과한 후 회전 진공증발 농축기로 농축하여 MeOH 엑스를 얻어 이를 비 지질 산화적 손상 예방 효과 즉정에 사용하였다.
- 4) 58 ml이 들어있는 ultrasonic cleaner(Branson B-221 Smithkline company, USA)에서 2시간 동안 초음파처리하였다. 초음파 처리된 용액(10mg lecithin/ml), FeCl3, ascorbic acid와 각 약초 MeOH 추출액(50~\200 jig)을 혼합하여 최종 농도가 3.12 mg lecithin/ml, 125 jiM FeClj, 125 jiM ascorbic acid가 되게 조제하였다. 이 혼합 용액을 thiobarbituric acid(TBA)방법으로 [25] 37%:에서 1시간 동안 배양하였다.
- 배양 후 20 mM HC1 1 ml과 cold TCA(20%, w/v) 1 ml을 첨가하여 3, 000 xg에서 10분간 원심분리 하였다. 침전된 단백질을 2 ml ethanol-ethyacetate( 1 : 1)로세 번 세척한 후 6M guanidine-HCl 2ml로서 녹인 다음 370nm에서 시료의 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 연구의 실험재로로 사용한 어성초 뿌리는 경남 약초 재배 연구소에서 구입하여 수세한 다음 음건하고 세절하여 사용하였다.
데이터처리
- 사이의 유의수준 /? < 0.05로 Dimnetfs f-test를 이용하여 실시하였다.
- 8% trichloroacetic acid(TCA) 1 ml을 첨 가하고 90℃ water-bath에서 20분간 배양하였다. 배양 후 sample을 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며 모든 samplee 3회 반복하여 평균값으로 하였다.
- 본 실험에서 얻은 측정치의 통계학적 분석은 통계처리 comp냐ter program인 Statistical Analysis System(SAS) 를 이용하여 등분산 검정 후 one-way AN0W게서 유의한 F값이 관찰되는 항목에 대하여 대조군과 각 처리군 사이의 유의수준 /? < 0.05로 Dimnetfs f-test를 이용하여 실시하였다.
이론/모형
- 2'-dG oxidation에 대한 효과 측정은 Wilson 등 [28] 의방법 에 따라 측정하였다. 즉 메 탄올 추출액 (50-1, 200 jig), 기-dG(0.
- Deoxyribose damage에 대한 항산화 효과 측정은 Halliwell 등 [9]의 방법에 따라 측정하였다. 즉 약초 MeOH 주출액 (50~ 1.
- Hydrogen peroxides scavenging 효과 측정은 Ruch 등 [21]의 방법에 따라 측정하였다. 20℃ phosphate buffer saline(pH 7.
- OH radical 소거 효과는 Shi 등 [21]의 방법에 따라 100 μM vitamin C, 100# cytochrome C 가 함유된 sodium phosphate buflfer(0.15 mM, KH2PO4-K#IPQpH 7.4) 3 ml로 OH radical을 유도하고 여기에 각 시료를 농도별로 첨가하여 25%:에서 90분간 반응 시킨 후 550nm에서 cytochrome C의 색깔 변화의 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료대신 thiourea® 사용하였고 이때 thiourea에 의해 유도된 OH radical의 억제율(%)을 100%로 하였으며, 억제율(%)은 다음과 같이 산줄하였다.
- Protein carbonyl 형성에 대한 항산화 효과 측정은 Lenz 등 [16]의 빙법에 따라 측정하였다. 즉 약초 MeOH 추출액(50-1200 jig), phosphate buflfer(20 mM KH2PO4-K2HPO4, pH 7.
- 에 대한 약초 메탄올 추출액의 chelating activity측정은 Carter [3]의 방법에 따라 측정하였다. 즉 0.
성능/효과
- 5와 같다. 100 pig 농도에서는 25.51%, 300 pig 농도에서 는 49.9%, 600 pig 농도에서는 32.39%, 1, 200 pig 농도에서는 37.74%로서 100 pig 농도에서만 소거 효과가 아주 낮게 나타나는 반면 다른 농도에서는 소거 효과가 비교적 높게 나타났다. 이 소거 효과를 현재 사용되고 있는 합성 항산화제인 BHA, BHT와 천연 항산화제인 tocopherol과의 과산화수소 제거 효과를 비교한 결과 BHA 22.
- 9%의 제거효과를 보였으며, OH radical 제거효과는 L200 曲 농도에서 91 %의 높은 제거 효과를 보였다. 2'-dG 산화 억제 시험에서는 撰00昭에서 91%의 산화 억제 효과를 보였다.
- FeCl& 1土。2와 ascorbic acid로 유도한 protein carbonyl 형성에 대한 농도별 어성초 뿌리 추출물의 항산화 효과를 측정한 결과 100 pig 농도에서 87.36, 300 μg에서는 86.44%, 600 pig 농도에서는 88.29%, 1, 200 μg에서는 85.85%로 나타났다. 현재 합성 항산화제로 이용되고 있는 BHA, BHT와 천연 항산화제인 tocopherol과의 protein carbonyl 형성에 대한 억제능을 비교한 결과 합성 항산화제 BHA는 92.
- 63%로 나타났다. Deoxyribose damage 억제에 대한 어성초 뿌리의 최대 억제효과는 300 첨가 시 73.99% 로 나타났는데 이 억제 효력과 현재 합성 항산화제로 이용되고 있는 BHA, BHT 와 천연 항산화제인 tocopherol 과의 deoxyribose damage 억제능을 비교한 결과 합성 항산화제 BHA는 모든 농도에서 70% 이상(최대 74.45%) 의 deoxyribose damage 억제능을 보여 어성초 보다 억제 능이 뛰어 났으며, BHT 또한 BHA와 비슷한 억제 능을 보여(최대 79.72%) 어성초 보다 뛰어 났다. 그러나 TCP는 1, 200 μg 첨가시를 제외 하고는 모든 농도에서 어성초 뿌리보다 낮게 나타났으나 유의성은 인정되지 않았다(Fig.
- Fe好/fW, 로 유도한 deoxyribose damage에 대한 농도별 어성초 뿌리 추출물의 항산화 능력을 TBA 법으로 측정 한 결과 100 pig 농도에서는 69.97%, 300 pig 농도에서는 73.99%, 600 pig 농도에서는 73.74%, 1, 200 μg에서는 69.63%로 나타났다. Deoxyribose damage 억제에 대한 어성초 뿌리의 최대 억제효과는 300 첨가 시 73.
- [13, 25]. Liposome 산화 손상에 대한 어성초 뿌리 추출물의 보호 효과를 측정 한 결과, 600 昭/ml까지는 농도 의존 형으로 liposome peroxidation 억제능력이 증가하는 경향이나 1, 200 p.g/ml 에서는 오히려 억제력이 약간 감소하는 경향을 보여 앞으로 연구나 실제 임상에 사용 시 600 jig/ml 이하의 농도를 사용하여야 최대의 효과를 얻을 것으로 판단된다. 현재 상업적으로 이용되고 있는 항산화제 BHA, BHT, TCP과의 항산화력을 비교한 결과 BHT 보다는 다소 떨어지지만 BHA와 TCP보다는 항산화 효과가 높게 나타났다.
- 02%의 억제 효과를 보였다. 과산화수소 제거효과는 300 jig에서 49.9%의 제거효과를 보였으며, OH radical 제거효과는 L200 曲 농도에서 91 %의 높은 제거 효과를 보였다. 2'-dG 산화 억제 시험에서는 撰00昭에서 91%의 산화 억제 효과를 보였다.
- 99%의 억제 효과를 보였다. 단백질 과산화 억제효과를 측정한 결과 600jxg에서 88.29%의 억제효과를 보였으며, 철 이온 형성 억제 시험에서는 600 jig 농도에서는 31.02%의 억제 효과를 보였다. 과산화수소 제거효과는 300 jig에서 49.
- Zhao와 Jung [28]은 OH radical scavenger# 이 혼합 반응액에 첨가하면 deoxyribose에 붙어 있는 OH radical를 분리시키려고 경쟁적으로 반응을 하게 되며 이때 OH radical 제거제의 농도가 deoxyribosee] 농도보다도 높으면 쉽게 OH radical을 deoxyribose 로부터 분리하여 deoxyribose의 손상을 회복시킨다고 보고하였다. 따라서 본 실험에서 사용한 어성초 뿌리 추출물도 73.99%까지 deoxyribose의 손상 억제 효과를 보인 결과도 이와 같은 기전에 의하여 OH radical로 인하여 손상된 deoxyribose을 회복시킨 결과로 판단된다.
- 이는 본 실험에서 사용한 어성초 뿌리의 메탄올 추출액과 MEMBH의 성분의 차이에서 오는 결과로 판단되며 이 추출액들이 이미 지질 과산화를 억제한 후 단백질 산화억제 기전에 관여하고 있음을 알 수 있으므로 보다 더 강력한 지질 및 단백질 산화 방지제라고 추측할 수 있다. 또한 본 실험에서 사용한 추출물은 합성 항산화제 BHA, BHT 및 천연 항산화제 보다 다소 낮은 단백질 산화 억제력을 보였지만 MEMBH 보다는 단백질 산화 억제가 뛰어난 항산화제라고 판단된다.
- 메탄올 추출물의 OH radical 제거효과는 용량이 증가할수록 제거효과가 증가하는 용량의존형으로 나타났다. 항산화제가 비지질의 과산화를 억제할 수 있느냐는 결국 OH radical을 얼마나 제거하느냐에 달려 있으며, Fig.
- 본 실험에서 lecithin liposome 산화에 대한 어성초 뿌리 주줄물의 항산화 효과를 즉정 한 결과 주줄물의 농도에 따라 항산화 효과가 다양하게 나타난 것으로 보아 천연 항산화제의 항산화 효과는 산화되는 물질의 종류에 따라 다양하게 나타날 것으로 예측 되지만 기질로서 지질 사용 시는 천연 항산화제의 항산화 효과가 광범위하게 나타나는 것으로 판단된다. 이와 같은 결과는 Duh 등 [6]이 콩 껍질의 항 산화효과를 측정한 결과와 일치하는 것으로 나타났다.
- 따라서 이 변화된 carbonyl 유도체를 측정함으로서 어느 정도 단백질 산화가 일어났느냐를 측정 할 수 있다고 보고하였다. 본 실험에서 사용한 어성초 뿌리의 메탄올 추출액들은 OH radical의 공격으로 인한 단백질 산화를 최소 85% 이상 억제하는 것으로 나타났는데 이러한 결과는 Antosiewicz 등 μ]이 쥐 간장 마이크로좀의 단백질과 지질 과산화에 대한 indolinci acid와 quinolinic aminoxylson 억제 효과에 대한 결과와 일치하는 결과를 보였으나 Duh 등 [6]이 콩 껍질의 메탄올 추출액 (MEMBH)을 사용하여 단백질 산화 억제시험을 측정한 결과 전혀 억제력이 없었다고 보고한 것과는 상이한 결과를 보였다. 이는 본 실험에서 사용한 어성초 뿌리의 메탄올 추출액과 MEMBH의 성분의 차이에서 오는 결과로 판단되며 이 추출액들이 이미 지질 과산화를 억제한 후 단백질 산화억제 기전에 관여하고 있음을 알 수 있으므로 보다 더 강력한 지질 및 단백질 산화 방지제라고 추측할 수 있다.
- 어성초 뿌리 추출물의 2'-dG 산화억제 효과를 Wilson 등 [28]의 방법에 따라 측정한 결과, 72.3-91% 억제율을 나타내어 BHA, BHT, TCP 보다 억제율이 높게 나타났다. 현재 사용되고 있는 합성 항산화제 인 BHA와 BHT는 발암과 같은 부작용이 유발될 수 있다는 보고를 고려해 볼 때 어성초 뿌리는 이들을 대체할 수 있는 잠재성 있는 천연 항산화제라고 판단되어지며, 이러한 결과는 Gilad 등 [9], Duh 등 [6]과 Wilson등 [28]이 항산화제를 사용한 결과 모두다 8-OH-2'dG 형성을 억제하는 경향이 있다고 보고한 것과 일치하지만 그 기전이 동일한지는 앞으로 규명하여야할 과제 이며, 어성초 뿌리 메탄올 추출물의 2'-dG 산화억제 효과 결과와 관련지어볼 때 어성초는 미래 신약 개발의 좋은 자원이 될 것으로 판단된다.
- 6과 같다. 어성초 뿌리의 OH radical 제거 효과는 100 曲에서 77%, 300 μg에서는 80%, 600 μg에서는 82%, 1, 200μg에서는 91%로 아주 높게 나타났다. 이러한 결과를 thiourea을 대조군 100%으로 하고 표준물질과 OH radical 제 거효과를 비교한 결과 BHA 63-90%, BHT 79~92%와는 비슷한 효과를 보였으나, TCP 67-80% 보다는 어성초 뿌리의 OH radical 제거 효과가 높게 나타났다(Fig.
- 어성초 뿌리의 메탄올 추출물이 비지질 과산화에 미치는 효과를 측정한 결과, Liposome model system에서는 600jxg에서 32.13%의 과산화 억제력을 보였고, deoxyribose 손상 시험에서는 300 昭에서 73.99%의 억제 효과를 보였다. 단백질 과산화 억제효과를 측정한 결과 600jxg에서 88.
- 74%로서 100 pig 농도에서만 소거 효과가 아주 낮게 나타나는 반면 다른 농도에서는 소거 효과가 비교적 높게 나타났다. 이 소거 효과를 현재 사용되고 있는 합성 항산화제인 BHA, BHT와 천연 항산화제인 tocopherol과의 과산화수소 제거 효과를 비교한 결과 BHA 22.35-40.42%, BHT는 28.09~37.8%로서 농도에 따라 다소의 차이는 있으나 비슷한 제거 효과를 보인 반면, TCP는 21.6-29.18%建서 어성초 뿌리의 과산화수소 제거 효과 보다 낮게 나타났다3 <0.05) (Fig. 5).
- 3%, 600 μg에서는 81%, 1, 200 μg에서는 91%를 나타내었다. 이 억제 효과를 합성 및 천연 항산화제인 BHA, BHT, TCP와의 산화 억제 효과를 비교한 결과 BHA는 70-77%, BHT는 70-79%, TCP는 68~75%로 나타나 어성초 뿌리의 억제 효과 보다 낮게 나타났다3< 0.05)(Fig. 7). 2, -dG와 8-OH-2'dG 성분을 확인하기 위하여 HPLC(Water, USA)로 분석한 결과, 2, -dG는 4.
- 본 실험에서 사용한 어성초 뿌리의 메탄올 추출액들은 OH radical의 공격으로 인한 단백질 산화를 최소 85% 이상 억제하는 것으로 나타났는데 이러한 결과는 Antosiewicz 등 μ]이 쥐 간장 마이크로좀의 단백질과 지질 과산화에 대한 indolinci acid와 quinolinic aminoxylson 억제 효과에 대한 결과와 일치하는 결과를 보였으나 Duh 등 [6]이 콩 껍질의 메탄올 추출액 (MEMBH)을 사용하여 단백질 산화 억제시험을 측정한 결과 전혀 억제력이 없었다고 보고한 것과는 상이한 결과를 보였다. 이는 본 실험에서 사용한 어성초 뿌리의 메탄올 추출액과 MEMBH의 성분의 차이에서 오는 결과로 판단되며 이 추출액들이 이미 지질 과산화를 억제한 후 단백질 산화억제 기전에 관여하고 있음을 알 수 있으므로 보다 더 강력한 지질 및 단백질 산화 방지제라고 추측할 수 있다. 또한 본 실험에서 사용한 추출물은 합성 항산화제 BHA, BHT 및 천연 항산화제 보다 다소 낮은 단백질 산화 억제력을 보였지만 MEMBH 보다는 단백질 산화 억제가 뛰어난 항산화제라고 판단된다.
- 어성초 뿌리의 OH radical 제거 효과는 100 曲에서 77%, 300 μg에서는 80%, 600 μg에서는 82%, 1, 200μg에서는 91%로 아주 높게 나타났다. 이러한 결과를 thiourea을 대조군 100%으로 하고 표준물질과 OH radical 제 거효과를 비교한 결과 BHA 63-90%, BHT 79~92%와는 비슷한 효과를 보였으나, TCP 67-80% 보다는 어성초 뿌리의 OH radical 제거 효과가 높게 나타났다(Fig. 6).
- 이와 같은 어성초 뿌리의 liposome peroxidation에서 얻은 최대 억제 능력 32.13%는 현재 합성 항산화제로 이용되고 있는 BHA, BHT와 천연 항산화제인 tocopherol 의 liposome peroxidation 억제능력과 어떠한 관계가 있는지 비교하기 위하여 BHA, BHT, 천연 항산화제인 tocopherole] liposome peroxidation 억제능력을 측정한 결과 BHT는 첨가 농도에 관계없이 어성초보다 liposome peroxidation 억제능력 이 높게 나타났으며 0.01), BHA 는 100 jig 첨가시를 제외하고는 어성 초보다 liposome peroxidation 억제능력이 낮게 나타났고(p v 0.05), TCP는 10)0μg을 제외 하고는 모든 농도에서 어성초 보다 liposome peroxidation 억제 능력이 낮게 나타났다Qx 0.05) (Fig. 1).
- 인지질인 liposome(lecithin)^ 이용하여 어성초 뿌리 메탄올 추출물을 농도별로 첨가하여 liposome peroxidation 억제 능력을 측정한 결과, 100 μg에서는 28.94%, 300 jig 에서는 31.25%, 600 μg 농도에서 32.13%, 1, 200 μg에서는 30.88%로 나타나 약초 추출물이 600 μg까지는 농도의존형으로 liposome peroxidation 억제능력이 증가하는 경향이나 1£00μg에서는 오히려 억제력이 다소 감소하는 경향을 보여 앞으로 연구나 실제 임상에 사용 시 농도는 600 p.g 이하의 농도를 사용하여야 최대의 효과를 얻을 것 같다.
- 철이온에 대한 농도별 어성초 뿌리 추출물의 킬레이트 효과는 100 μg 농도에서는 15.32%, 300 pig 농도에서는 23.29%, 600 pig 농도에서는 31.02%, 1, 200 pig 농도에서는 30.06%로서 300 pig 이상의 농도에서 킬레이트 효과가 높게 나타났다. 킬레이트를 유도하는 EDTA와의 효과를 비교한 결과, 어성초 뿌리의 킬레이트 효과 (31.
- 06%로서 300 pig 이상의 농도에서 킬레이트 효과가 높게 나타났다. 킬레이트를 유도하는 EDTA와의 효과를 비교한 결과, 어성초 뿌리의 킬레이트 효과 (31.02%)는 ED1A(2%) 보다 현저하게 높은 유의성3< 0.001) 있는 억제력을 나타내었다. 이와 같이 300pig 이상의 농도에서 ED1A 보다 높게 나타나는 것은 Fenton reaction에서 금속 이온 농도를 현저하게 감소시키기 때문인 것 같다(Fig.
- g/ml 에서는 오히려 억제력이 약간 감소하는 경향을 보여 앞으로 연구나 실제 임상에 사용 시 600 jig/ml 이하의 농도를 사용하여야 최대의 효과를 얻을 것으로 판단된다. 현재 상업적으로 이용되고 있는 항산화제 BHA, BHT, TCP과의 항산화력을 비교한 결과 BHT 보다는 다소 떨어지지만 BHA와 TCP보다는 항산화 효과가 높게 나타났다. 이러한 결과는 Duh 등 [6]이 콩 껍질의 항 산화 효과를 측정한 결과와 일치하는 것으로 나타났다.
- 85%로 나타났다. 현재 합성 항산화제로 이용되고 있는 BHA, BHT와 천연 항산화제인 tocopherol과의 protein carbonyl 형성에 대한 억제능을 비교한 결과 합성 항산화제 BHA는 92.92~94.75%로, BHT는 92.21 ~94.75%로 나타났으며 천연 항산화제 tocopherol도 83.36-92.35%로 어성초 뿌리보다 단백질의 산화적 손상 억제력이 뛰어났으나 유의성은 인정되지 않았다(Fig. 3).
후속연구
- 이상의 결과로 보아 어성초 뿌리 메탄올 추출물은 각종 산화기전에 있어서 비지질 과산화를 예방하는 효과가 있음을 알 수 있고, 항산화 효과는 활성 산소종을 제거하여 나타나는 것으로 추측되지만 명확한 기전은 더 연구하여야 하겠다.
- 3-91% 억제율을 나타내어 BHA, BHT, TCP 보다 억제율이 높게 나타났다. 현재 사용되고 있는 합성 항산화제 인 BHA와 BHT는 발암과 같은 부작용이 유발될 수 있다는 보고를 고려해 볼 때 어성초 뿌리는 이들을 대체할 수 있는 잠재성 있는 천연 항산화제라고 판단되어지며, 이러한 결과는 Gilad 등 [9], Duh 등 [6]과 Wilson등 [28]이 항산화제를 사용한 결과 모두다 8-OH-2'dG 형성을 억제하는 경향이 있다고 보고한 것과 일치하지만 그 기전이 동일한지는 앞으로 규명하여야할 과제 이며, 어성초 뿌리 메탄올 추출물의 2'-dG 산화억제 효과 결과와 관련지어볼 때 어성초는 미래 신약 개발의 좋은 자원이 될 것으로 판단된다.
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