[논문]면역억제제 Tautomycetin을 생산하는 방선균의 고체배지 pH에 따른 항진균 활성

허윤아; 최시선; 장용근; 홍순광; 김응수

면역억제제 Tautomycetin을 생산하는 방선균의 고체배지 pH에 따른 항진균 활성
Solid Medium pH-Dependent Antifungal Activity of Streptomyces sp. Producing an Immunosuppressant, Tautomycetin 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.35 no.1, 2007년, pp.26 - 29

허윤아 (인하대학교 생물공학과) , 최시선 (인하대학교 생물공학과) , 장용근 (한국과학기술원 생명화학공학과) , 홍순광 (명지대학교 생명과학정보학부) , 김응수 (인하대학교 생물공학과)

초록
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Tautomycetin(TMC)은 국내 토양에서 분리된 방선균(Streptomyces sp. CK4412)로부터 생합성 되는 항진균성 2차 대사산물로서, Cyclosporin및 FK506과 같은 기존의 면역억제제보다 작용 메카니즘 및 효능이 훨씬 탁월한 선형의 폴리케타이드계 면역억제 화합물이다. 고체배지의 pH변화와 TMC생산성과의 상관관계를 규명하기 위하여, 방선균 CK4412를 다양한 pH조건에서 배양하면서 항진균 활성 및 TMC생산량을 비교분석 하였다. 고체배지의 pH를 산성조건(pH 4-5)으로 유지하여 방선균 CK4412 균주를 배양할 경우, 중성 pH 조건에서 배양한 경우보다 훨씬 탁월한 항진균 활성 및 TMC생산성이 관찰되었다. 본 연구결과는 대표적인 방선균 S. coelicolor에서 입증된 pH-shock게 의한 2차대사산물의 생산성 증대효과가 대사산물의 특성과 균주가 전혀 다른 TMC 생산균주 CK4412에서도 관찰됨을 입증함으로써, pH조절에 의한 다양한 종류의 방선균 유래 유용 생리활성물질의 생산성 증대 전략을 제시하고 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

Tautomycetin (TMC), which is produced by Streptomyces sp. CK4412, is a novel activated T cell-specific immunosuppressive compound with an ester bond linkage between a terminal cyclic anhydride moiety and a linear polyketide chain bearing an unusual terminal alkene. Antifungal activity against Aspergillus niger and TMC productivity assayed by HPLC using culture extracts from Streptomyces sp. CK4412 grown on solid medium adjusted at various pH were measured. The cells cultured at acidic pH (pH 4-5) medium exhibited much stronger antifungal activity as well as higher TMC productivity than those cultured at neutral pH medium, implying that the acidic pH-shock should be an efficient strategy to induce the productivity of secondary metabolites in Streptomyces culture.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

또한 방선균 배양 시 영양분의 농도 및 특정 성장제한 인자의 규명 등에 관한 보고가 그리 많지 않아서, 이들 대사물질이 성장시기와 밀접한 연관이 있는 항생제 생산에 미치는 영향의 정도를 예측하거나 또한 일반화하는 것은 매우 어려운 일이다. 특히 세포의 성장속도나 배지의 영양학적 요소에 의한 2차 대사산물의 생산성 증가에 관한 보고는 많지만, 비영양 학적 요소들이 2차 대사산물 생합성에 주는 스트레스에 관한 연구는 매우 제한적이다[7, 8], 최근 배지의 pH 변화를 통한 2차 대사산물의 생산성 극대화 가능성이 S. coelicolor 및 S. kasugaensis 균주에서 성공적으로 입증되었다[9, 11], 따라서 본 연구에서는 이러한 대표적인 비영양학적 요소인 배지의 pH 변화를 대사산물의 특성 및 균주가 전혀 다른 TMC 생산 균주에 적용함으로써, 보다 일반적인 pH-shock 에 의한 방선균 유래 유용 생리활성물질의 생산성 증대 전략을 제시하고자 한다.

제안 방법

강력한 항진균 활성도 갖는 TMC는 현재 임상에서 일반적으로 사용되는 면역억제제 Cyclosporine A 보다 100배나 높은 활성을 보일 뿐만 아니라 활성화된 T 세포에만 특이적으로 작용함으로써 , 차세대 면역억제제로의 개발 가능성이 매우 높은 화합물이다[13]. T*? MC 선형의 type I 폴리케타이드 부분과 환형의 C₈ anhydride가 에스테르 결합으로 연결되는 독특한 구조를 지니고 있으며[5], 최근 본 연구진은 TMC 생합성에 관여하는 전체 유전자군을 분리하여 그 특성을 규명하였다[6].
장기 보관으로는 20% glycerol의 spore suspension으로 -7VC에 보관하였다[10]. 고체배지에서의 pH- shock 방법을 적용하기 위하여, pH에 영향을 줄 수 있는 요소인 TES buffer와 NaOH는 제외한 변형된 R2YE 고체배지 [103 g sucrose, 0.25 g K2SO₄, 10.12 g MgCh . 6H₂O, 10 g glucose, 0.1 g casamino acids, 5 g yeast extract, 증류수 800 ml, 1 ml KH₂PO₄(0.5%), 8 ml CaCl2 - 2H₂O(3.68%), 1.5 ml L-proline(20%), 0.2 ml trace element solution]# 기본 배지로 사용하였고, 필요한 경우 pH를 각각 4, 5, 6, 7.5 로 맞춰 사용하였다. 배지의 pH 조성 이 초기 균주의 성장에 영향을 미칠 수도 있으므로, 배양 2일까지는 기본 배지의 셀로판지 위에서 배양한 후, 이를 셀로판지 만을 다른 pH의 배지에 각각 옮긴 후 5일을 더 배양하였다(Fig.
고체배지의 pH 변화에 따른 TMC 생산성을 정량 적으로 비교 분석하기 위하여 HPLC를 사용하였다. R2YE 고체 배지에서 7일 동안 배양한 cell을 배지와 함께 mixei에서 혼합하고 동량의 chloroform으로 추출한 후, rotoevaporator를 이용하여 농축시키고 이를 적당량의 MeOH으로 용리하였다.
결과 및 고찰

고체배지의 pH 변화와 TMC 생산성과의 상관관계를 규명하기 위하여, 방선균 CK4412를 기본 배지에서 2일 배양하고 이를 각각 다른 pH의 배지에 각각 이동시킨 후 5일을 더 배양하면서 항진균 활성 및 TMC 생산량을 비교분석 하였다. 각기 pH가 다르게 제작된 고체배지 위에 배지로부터의 영양분 공급이 가능한 셀로판지를 깔고 배양한 cell을 들어내고 고체배지만을 mixer로 혼합한 후 동량의 chloroform 으로 30℃, 20min 흔들어 주면서 추출하였다.
CK4412)로부터 생합성 되는 항진균성 2 차 대사산물로서, Cyclosporin 및 FK506과 같은 기존의 면역억제제보다 작용 메카니즘 및 효능이 훨씬 탁월한 선형의 폴리케타이드계 면역억제 화합물이다. 고체배지의 pH 변화와 TMC 생산성과의 상관관계를 규명하기 위하여, 방선균 CK4412를 다양한 pH 조건에서 배양하면서 항진균 활성 및 TMC 생산량을 비교분석하였다. 고체배지의 pH를 산성 조건 (pH 4-5)으로 유지하여 방선균 CK4412 균주를 배양할 경우, 중성 pH 조건에서 배양한 경우보다 훨씬 탁월한 항진균 활성 및 TMC 생산성이 관찰되었다.
niger는 ME 배 지 (malt extract 20 g, glucose 20 g, peptone 1 g, agar 20 g, 증류수 1 L)에 멸균된 물을 이용하여 곰팡이 포자를 얇게 핀 상태로 30℃에서 6 hr정도 배양하였다. 그리고 HPLC 분석에 사용하였던 추출물 15 를 종이 디스크에 흡수시켜 올려놓은 후 1-2일 배양한 후 항진균 활성을 측정하였다.
, Japan)를 이용하여 273 nm에서 확인하였다. 또한, 각 pH에서 배양한 세포로부터의 항진균 활성 변화를 알아보기 위해 Aspergillus niget를 사용하여 생물학적 정량실험을 수행하였다. A.

대상 데이터

sp. CK4412를 분양 받아 사용하였다. 단기보관을 위하여, R2YE 고체 배지 [103 g sucrose, 0.

성능/효과

3A). pH 4나 pH 5의 경우, pH 6이나 pH 7.5에서 배양된 경우보다 확연히 Aspergillus Niger 균주에 대한 항진균 활성도가 높아짐을 확인할 수 있다. 이는 고체배지의 pH가 산성인 경우가 중성이나 염기성의 경우보다 2차 대사산물의 생산에 유리하게 작용함을 보이는 결과이다.
고체배지의 pH 변화와 TMC 생산성과의 상관관계를 규명하기 위하여, 방선균 CK4412를 다양한 pH 조건에서 배양하면서 항진균 활성 및 TMC 생산량을 비교분석하였다. 고체배지의 pH를 산성 조건 (pH 4-5)으로 유지하여 방선균 CK4412 균주를 배양할 경우, 중성 pH 조건에서 배양한 경우보다 훨씬 탁월한 항진균 활성 및 TMC 생산성이 관찰되었다. 본 연구결과는 대표적인 방선균 S.
고체배지의 pH를 산성 조건 (pH 4-5)으로 유지하여 방선균 CK4412 균주를 배양할 경우, 중성 pH 조건에서 배양한 경우보다 훨씬 탁월한 항진균 활성 및 TMC 생산성이 관찰되었다. 본 연구결과는 대표적인 방선균 S. coelicolor에서 입증된 pH-shock에 의한 2차대 사산 물의 생산성 증대효과가 대사산물의 특성과 균주가 전혀 다른 TMC 생산균주 CK4412에서도 관찰됨을 입증함으로써, pH 조절에 의한 다양한 종류의 방선균 유래 유용 생리활성물질의 생산성 증대 전략을 제시하고 있다.
추출한 샘플은 두 층으로 나뉘게 되는데 아래의 chloroform층을 깨끗하게 분리한 후 rotoevaporats를 이용하여 농축시키고 1/20 voL의 methanol 에 용리하였다. 우선 항진균 활성 측정결과, pH가 낮을수록 즉, 배지가 산성 인 조건에서 배양될수록 항진균 활성이 높아짐을 관찰할 수 있었다(Fig. 3A). pH 4나 pH 5의 경우, pH 6이나 pH 7.
이는 중성이나 염기성 조건에서의 TMC 생산량이 극히 미량이기 때문에 검출하지 못하였기 때문이지 물질이 합성되지 않는 것은 아니라 사료된다. 이 사실은 전 파장 UV-scan을 통해 TMC 특유의 흡수파장패턴을 통해 중성과 염기성인 조건에서도 물질이 생산됨을 확인하여 증명되었다. 따라서, 이 물질의 생성에 acidic pH가 필수적 이지는 않으며 산성조건에서 TMC가더 많이 생합성 되는 것으로 사료된다(Fig.
각기 pH가 다르게 제작된 고체배지 위에 배지로부터의 영양분 공급이 가능한 셀로판지를 깔고 배양한 cell을 들어내고 고체배지만을 mixer로 혼합한 후 동량의 chloroform 으로 30℃, 20min 흔들어 주면서 추출하였다. 이때, 각 배지마다 같은 양의 agar powder를 넣고 제작하였음에도 불구하고, pH가 낮은 산성인 고체배지일수록 배지가 단단하지 않고 묽은 현상을 보였다. 추출한 샘플은 두 층으로 나뉘게 되는데 아래의 chloroform층을 깨끗하게 분리한 후 rotoevaporats를 이용하여 농축시키고 1/20 voL의 methanol 에 용리하였다.
이는 고체배지의 pH가 산성인 경우가 중성이나 염기성의 경우보다 2차 대사산물의 생산에 유리하게 작용함을 보이는 결과이다. 이와 같은 pH-shocH 의한 2차대 사산 물의 생산성 증가 현상은 S. coelicolor 및 S. kasttgaensis와 같은 다른 방선균에서도 관찰되었다[9, 11], 또한, HPLC 분석에서도 이와 부합되는 결과를 보였는데, 동일한 extracts를 HPLC 로 정량 분석한 결과, TMC peak로 사료되는 12 min 이후 peak들이 산성인 pH 4 또는 pH 5 조건에서 pH 6과 pH 7.5 조건에서 보다 높음을 확인할 수 있었다. 하지만, Fig.

참고문헌 (14)

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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