[논문]초친수성 표면에서 혈장 단백의 흡착 및 혈소판의 변화에 관한 연구

박남희; 전배혁; 제형곤; 이준완; 이재원

문제 정의

본 연구에서 기존의 헤파린 코팅과는 달리 다른 고분자물질로 도관의 표면을 코팅하여 그 효과를 분석해 보고자 하였다. 플라즈마(plasma)는 이온화한 가스상태를 뜻하는데 플라즈마를 고체물질(여기서는 도관)에 접촉하면 얇은 막이 입혀지게 되고 이 고분자 표면에 -OH, -COOH, -NH₂ 등의 작용기를 부착하여 표면을 초친수성(물과의 접촉각 <5°)으로 바꾸어 줌으로써 도관의 표면에 여러 층의 수분 막이 형성되도록 하였다[11, 12].
본 연구에서는 초친수성 표면개질의 생체적합성을 평가하기 위한 응고반응의 평가도구로서 여러가지 지표들을 조사하였다. 특히 트롬빈 형성의 표지자인 트롬빈-안티트롬빈 복합체는 응고반응의 활성화 정도를 알려주는 대표적인 표지자로서 많은 연구에서 활용되고 있다.

가설 설정

플라즈마(plasma)는 이온화한 가스상태를 뜻하는데 플라즈마를 고체물질(여기서는 도관)에 접촉하면 얇은 막이 입혀지게 되고 이 고분자 표면에 -OH, -COOH, -NH₂ 등의 작용기를 부착하여 표면을 초친수성(물과의 접촉각 <5°)으로 바꾸어 줌으로써 도관의 표면에 여러 층의 수분 막이 형성되도록 하였다[11, 12]. 이런 상태는 김이 서리지 않는 안경을 만드는 것과 같이 체외순환 시 혈액 내의 아미노산, 단백질, 혈소판 등이 고분자 표면으로 이동하는 것을 방해하며 이들의 흡착을 어렵게 함으로써 응고 반응을 줄일 수 있을 것으로 가정하여 동물실험을 통해 응고 반응의 정도를 비교하였다.
체외순환 시 염증반응은 잘 알려진 바와 같이 혈액이 nonbiologic surface와 접촉하면서 contact system이 활성화되고 이어서 혈액응고계, 보체계, 섬유소 융해계의 활성화가 연속적으로 일어나는 것이다. 따라서 초친수성 표면을 가진 회로를 사용하면 회로의 표면에 수분막이 입혀지게 되면 이후 혈액이 표면에 노출되더라도 물분자보다 분자량이 훨씬 큰 혈장단백이 도관의 표면으로 이동하여 흡착되는 것이 어려울 것이므로 contact system의 활성화를 억제할 수 있으리라 가정하였다.

제안 방법

Monomer는 Aldrich사의 HMDSO (hexamethyldisiloxane)을 사용하였고, grafting을 위한 H2O는 증류수를 사용하였다. Blood vessel 안을 균일하게 plasma polymer로 coating하거나 grafting하기 위하여 전극을 바퀴 위의 판에 고정하여, 움직일 수 있게 하였다. 초친수성 표면처리의 공정은 다음과 같다.
프로그램에 따라 이루어졌다. 실험동물의 마취는 먼저 10~15 ㎎/㎏의 Ketamine (유한양행, Korea)을 근육 주사하여 안정시킨 다음 사지를 고정하고 귀 후방의 정맥에 20 gauze의 정맥주사용 카테타(동방의료기, Korea)를 거치하여 정맥 통로를 확보한 뒤 Dormicum (한국로슈, Korea) 을 5 mg 투여하였다. 심전도 감시를 시행하며 호흡을 확인하면서 기도 확보를 위한 기관 절개를 시행하고 기관삽관을 시행하였다.
실험동물의 마취는 먼저 10~15 ㎎/㎏의 Ketamine (유한양행, Korea)을 근육 주사하여 안정시킨 다음 사지를 고정하고 귀 후방의 정맥에 20 gauze의 정맥주사용 카테타(동방의료기, Korea)를 거치하여 정맥 통로를 확보한 뒤 Dormicum (한국로슈, Korea) 을 5 mg 투여하였다. 심전도 감시를 시행하며 호흡을 확인하면서 기도 확보를 위한 기관 절개를 시행하고 기관삽관을 시행하였다. 흡입마취제로는 Enflurane (중외제약, Korea)을 사용하였으며 Vecroniume(이연제약, Korea) 등의근이 완제를 투여하면서 전신마취를 유지하였다.
흡입마취제로는 Enflurane (중외제약, Korea)을 사용하였으며 Vecroniume(이연제약, Korea) 등의근이 완제를 투여하면서 전신마취를 유지하였다. 정중흉골절개를 시행한 후 좌측 내유동맥에 동맥 카테터(arterial line)를 거치하여 수술 중 혈압을 연속적으로 감시하였고상대정맥에 18 gauze의 카테타를 설치하여 수액공급의 통로를 확보하였다.
심낭을 절개하여 좌심방과 상행대동맥에 캐눌라를 거치한 다음 원심성 바이오펌프를 이용하여 두 시간 동안 정상체온 하에서 체외순환을 시행하였다. 이때 대동맥 및 좌심방 캐눌라, 그리고 원심성 바이오펌프의 헤드는 아무런 처치를 하지 않은 상품화된 제품을 사용하였으며 도관의 표면처리 여부에 따라 무작위로 각 5마리씩 실험군 과대 조 군으로 나누어 실험을 진행하였다.
하에서 체외순환을 시행하였다. 이때 대동맥 및 좌심방 캐눌라, 그리고 원심성 바이오펌프의 헤드는 아무런 처치를 하지 않은 상품화된 제품을 사용하였으며 도관의 표면처리 여부에 따라 무작위로 각 5마리씩 실험군 과대 조 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 회로의 총 길이는 약 360 cm로 그 중 도관의 길이는 좌심방 캐눌라와 바이오 펌프의 헤드까지 그리고 헤드에서 상행대동맥 캐눌라까지 각각 150 cm로 제작하였는데 이는 실험실에서 제작할 수 있는 최대한의 길이였다.
체외순환으로 인한 응고반응의 정도를 비교 분석하기위해 체외순환 시작 전, 체외순환 30분, 체외순환 60분, 그리고 체외순환 종료 직후에 혈소판의 수를 측정하였으며, 동일한 시간에 트롬빈-안티트롬빈 복합체(thrombin-anti- thrombin complex, TAT)의 혈중 농도를 측정하였다. 또한체외순환 전과 체외순환 후의 혈소판 응집능을 비교하였으며 혈중 총 단백량을 비교하였다.
또한체외순환 전과 체외순환 후의 혈소판 응집능을 비교하였으며 혈중 총 단백량을 비교하였다. TAT는 enzyme immunoassay kit (Enzygnost TAT micro, Dade-Behring, Germany) 를 사용하여 측정하였으며 혈소판의 응집능은 adenosine diphosphate (ADP), collagen, epinephrine 및 ristocetin을 응집 매체로 하여 Platelet aggregation profiler (PAP-4) (Bio/Date Corp.
또한체외순환 전과 체외순환 후의 혈소판 응집능을 비교하였으며 혈중 총 단백량을 비교하였다. TAT는 enzyme immunoassay kit (Enzygnost TAT micro, Dade-Behring, Germany) 를 사용하여 측정하였으며 혈소판의 응집능은 adenosine diphosphate (ADP), collagen, epinephrine 및 ristocetin을 응집 매체로 하여 Platelet aggregation profiler (PAP-4) (Bio/Date Corp., USA)를 이용하여 측정하였으며 측정값은 백분율 (%)로 표시하였다.
CPB=Cardiopulmonary bypass.헤파린 코팅이 아니라 플라즈마를 이용한 초친수성 표면처리를 시행하고 동물실험을 통해 염증반응 지표들의 변화를 분석하여 그 임상적 효과를 비교해 보았다. 초친수성 표면 처리의 기본적인 개념은 앞서 언급한 것처럼 도관의 표면에 고분자 물질을 입힌 다음 고분자 물질이 물(H2O)분자와 친화력이 있도록 만든 다음 물분자와 결합시켜 회로의 표면에 얇은 수분막을 형성하게 하는 것이다.
못함을 보여주었다고 할 수 있다. 우선 전신성염증반응의 결과로 나타날 수 있는 혈소판의 기능 저하를관찰하기 위하여 adenosine diphosphate (ADP), collagen, epinephrine 및 ristocetin을 응집매체로 하여 혈소판의 응집기능을 측정하였다. 체외순환 전에 비해 혈소판의 응집능기능은 감소하였으나 두 군 간에 유의한 차이가 없었다.
따라서 체외순환회로의 생체적합성 판정에 있어서 회로 표면의 변화, 즉 혈장단백의 흡착정도 또는 혈소판의흡착정도를 직접 관찰하고 이를 객관화하는 것이 중요한데 이성호 등[17]은 방사성동위원소(Tc99m)를 이용한 혈소판 흡착의 정량분석법을 개발하여 객관적인 평가가 가능하였다고 하였다. 참고로 본 실험에서도 실제 회로 표면에 어떠한 변화가 일어나는지를 관찰하기 위해 흡착된단백의 정량분석 및 표면전자현미경 검사를 시도하였다. 그러나 이러한 검사들은 위의 저자들이 지적한 대로 관찰자 및 검체 부위에 따라 매우 상이한 결과가 도출되어 실험결과로 인정하기 어려운 점들이 있었다.

대상 데이터

체외순환회로의 도관 안에 초친수성 표면을 만들기 위한 플라즈마 발생 장치 (glow discharge)는 Fig. 1과 같이 제작하였다. 장치는 그림에서 보는 바와 같이 Advanced Energy사의 600 W RF (radio frequency; 13.
1과 같이 제작하였다. 장치는 그림에서 보는 바와 같이 Advanced Energy사의 600 W RF (radio frequency; 13.56 MHz) power supply, Edwards사의 RV5 vacuum pump, 그리고 MKS사의 mass flow controller를 이용한 monomer와 gas를 흘려줄 수 있는 장치로 구성되어 있다. Monomer는 Aldrich사의 HMDSO (hexamethyldisiloxane)을 사용하였고, grafting을 위한 H2O는 증류수를 사용하였다.
56 MHz) power supply, Edwards사의 RV5 vacuum pump, 그리고 MKS사의 mass flow controller를 이용한 monomer와 gas를 흘려줄 수 있는 장치로 구성되어 있다. Monomer는 Aldrich사의 HMDSO (hexamethyldisiloxane)을 사용하였고, grafting을 위한 H2O는 증류수를 사용하였다. Blood vessel 안을 균일하게 plasma polymer로 coating하거나 grafting하기 위하여 전극을 바퀴 위의 판에 고정하여, 움직일 수 있게 하였다.
심전도 감시를 시행하며 호흡을 확인하면서 기도 확보를 위한 기관 절개를 시행하고 기관삽관을 시행하였다. 흡입마취제로는 Enflurane (중외제약, Korea)을 사용하였으며 Vecroniume(이연제약, Korea) 등의근이 완제를 투여하면서 전신마취를 유지하였다. 정중흉골절개를 시행한 후 좌측 내유동맥에 동맥 카테터(arterial line)를 거치하여 수술 중 혈압을 연속적으로 감시하였고상대정맥에 18 gauze의 카테타를 설치하여 수액공급의 통로를 확보하였다.
이때 대동맥 및 좌심방 캐눌라, 그리고 원심성 바이오펌프의 헤드는 아무런 처치를 하지 않은 상품화된 제품을 사용하였으며 도관의 표면처리 여부에 따라 무작위로 각 5마리씩 실험군 과대 조 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 회로의 총 길이는 약 360 cm로 그 중 도관의 길이는 좌심방 캐눌라와 바이오 펌프의 헤드까지 그리고 헤드에서 상행대동맥 캐눌라까지 각각 150 cm로 제작하였는데 이는 실험실에서 제작할 수 있는 최대한의 길이였다. 헤파린은 15,000 IU을 투여하여 Activated clotting time이 300초가 넘도록 유지하였다.

이론/모형

실험동물은 60 kg 내외의 건강한 돼지를 대상으로 하였으며 실험동물의 준비(검수, 검역, 순화) 및 사육관리는 미국 국립보건원 (National Institutes of Health)의 지침 (NIH publication 85~23)에 근거한 아산생명연구소 실험동물실의 프로그램에 따라 이루어졌다. 실험동물의 마취는 먼저 10~15 ㎎/㎏의 Ketamine (유한양행, Korea)을 근육 주사하여 안정시킨 다음 사지를 고정하고 귀 후방의 정맥에 20 gauze의 정맥주사용 카테타(동방의료기, Korea)를 거치하여 정맥 통로를 확보한 뒤 Dormicum (한국로슈, Korea) 을 5 mg 투여하였다.

성능/효과

2). 또한 혈소판의 응집기능을 측정한 응집능 검사에서는 4가지 매체에 대해 모두 체외순환시작 전에 비해 응집 능이 감소되었으나 모두 정상범위 안에 있어 혈소판의 기능 저하는 관찰되지 않았다(Fig. 3).
체외순환 전에 측정한 혈장 총단백량은 실험군에서 7.02 + 0.7 g/dL, 대조군에서 7.35 ±0.4 g/dL로 유의한 차이가 없었으나 체외순환 후 실험군에서 5.60 + 0.7 g/dL, 대조군에서 4.05±0.8 g/dL로 대조군에서 유의한(p<0.05) 감소를 보였다(Fig. 4). 또한 트롬빈 안티트롬빈 복합체 검사에서는 체외순환 전 6.
체외순환 전에 비해 혈소판의 응집능기능은 감소하였으나 두 군 간에 유의한 차이가 없었다. 또한 체외순환에 따른 혈소판 수의 변화도 두 군 간에 큰차이를 보이지 않았으며, 혈액응고시스템 활성화로 유리된 혈중 트롬빈의 정도를 나타내는 트롬빈-안티트롬빈 복합체의 비교에서도 유의한 차이가 없어 효과적인 염증반응의 차단 효과를 관찰할 수 없었다. 그러나 본 실험에서의미 있었던 결과 한 가지는 체외순환 전후로 비교한 혈액 내 총 단백량(total protein)의 수치에서 두 군 간에 유의한 차이를 보인 점이다.
또한 체외순환에 따른 혈소판 수의 변화도 두 군 간에 큰차이를 보이지 않았으며, 혈액응고시스템 활성화로 유리된 혈중 트롬빈의 정도를 나타내는 트롬빈-안티트롬빈 복합체의 비교에서도 유의한 차이가 없어 효과적인 염증반응의 차단 효과를 관찰할 수 없었다. 그러나 본 실험에서의미 있었던 결과 한 가지는 체외순환 전후로 비교한 혈액 내 총 단백량(total protein)의 수치에서 두 군 간에 유의한 차이를 보인 점이다.
연속적으로 일어나게 된다[13]. 본 연구에서초친수성 표면개질을 시행하지 않은 대조군이 실험군에비해 체외순환 후 혈장 단백의 총량이 유의하게 감소하였다는 사실은 초친수성 표면처리가 어느 정도 혈장 단백의흡착을 감소키는 역할을 하였다고 볼 수 있다. 이는 곧 혈장 단백의 흡착을 줄임으로써 판의 흡착과 응고로 이어지는 염증반응의 정도를 감소시킬 수 있을 것으로 판단하였으나 본 실험에서 나타난 결과와 같이 실제 염증반응의정도를 나타내는 지표들은 두군 간에 차이가 없었다.
그러나 본 실험의 결과는 체외순환회로의 초친수성 표면처리가 전체적으로 염증반응을 차단하는데 그다지 효과적이지 못함을 보여주었다고 할 수 있다. 우선 전신성염증반응의 결과로 나타날 수 있는 혈소판의 기능 저하를관찰하기 위하여 adenosine diphosphate (ADP), collagen, epinephrine 및 ristocetin을 응집매체로 하여 혈소판의 응집기능을 측정하였다.

후속연구

Tanaka 등의 연구에서 보면 흡착된 혈장 단백의 양이 비슷하였던 서로 다른 코팅재질에서단백의 구조적인 변화는 서로 달랐고 이로 인해 혈소판의활성화되는 정도 역시 확연히 다르다는 점을 확인하여 이를 뒷받침하고 있다[16]. 따라서 본 실험에서 초친수성 표면개질의 효과로 혈장 단백의 흡착이 감소되었다는 간접적인 결과를 얻었지만 궁극적으로는 혈소판의 활성으로유도되는 염증반응을 감소시키지 못한 점이 앞서 언급한흡착된 단백의 과도한 구조적인 변화로 인한 것인지에 대해 향후 추가적인 연구가 필요하겠다.
특히 트롬빈 형성의 표지자인 트롬빈-안티트롬빈 복합체는 응고반응의 활성화 정도를 알려주는 대표적인 표지자로서 많은 연구에서 활용되고 있다. 그러나이 표지자는 체외순환회로의 생체적합성을 평가하는 실험모델에서는 수술적 외상 등에 의해 결과에 영향을 받을수 있는 간접적인 평가 방법이라는 점에서 제한점이 있다. 따라서 체외순환회로의 생체적합성 판정에 있어서 회로 표면의 변화, 즉 혈장단백의 흡착정도 또는 혈소판의흡착정도를 직접 관찰하고 이를 객관화하는 것이 중요한데 이성호 등[17]은 방사성동위원소(Tc99m)를 이용한 혈소판 흡착의 정량분석법을 개발하여 객관적인 평가가 가능하였다고 하였다.
그러나 이러한 검사들은 위의 저자들이 지적한 대로 관찰자 및 검체 부위에 따라 매우 상이한 결과가 도출되어 실험결과로 인정하기 어려운 점들이 있었다. 따라서 본실험에서 방사성동위원소를 이용하는 방법 등을 포함한 직접적이면서도 객관적인 평가방법을 통하여 초친수성 표면개질의 효과를 분석하지 못한 점이 제한점으로 생각된다. 또한 추가적으로 고려해야 할 사항으로는 실험 모델에서의 제한점이 있을 것으로 생각된다.
따라서 본실험에서 방사성동위원소를 이용하는 방법 등을 포함한 직접적이면서도 객관적인 평가방법을 통하여 초친수성 표면개질의 효과를 분석하지 못한 점이 제한점으로 생각된다. 또한 추가적으로 고려해야 할 사항으로는 실험 모델에서의 제한점이 있을 것으로 생각된다. 실제 임상에서는산화기 (oxygenator) 및 흡인 장치 (cardiotomy suction device) 로 인한 혈소판의 활성화 또는 파괴로 인해 혈소판의 수가 감소하고 그 기능이 저하되는 것으로 알려져 있는데본 실험 모델에서는 이러한 영향이 배제되어 있어 혈소판의 수나 기능에 그다지 영향을 미치지 못한 것으로 판단된다.
이러한 결과에서 혈장단백의 흡착정도와 응고반응의 활성화의 상관관계에 대한 연구가 필요하며 생체적합성 판정에 있어 좀 더 객관적인 검사 방법의 도입 및 적용이 필요할 것으로 생각된다. 또한 향후 초친수성 표면처리의 기술발전과 함께 산학 협동 또는 다학제간 협동 연구를 통해 좀 더 발전된 실험 모델이 정립되어야 할 것으로 생각된다.
이러한 결과에서 혈장단백의 흡착정도와 응고반응의 활성화의 상관관계에 대한 연구가 필요하며 생체적합성 판정에 있어 좀 더 객관적인 검사 방법의 도입 및 적용이 필요할 것으로 생각된다. 또한 향후 초친수성 표면처리의 기술발전과 함께 산학 협동 또는 다학제간 협동 연구를 통해 좀 더 발전된 실험 모델이 정립되어야 할 것으로 생각된다.

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