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문제 정의
- 본 연구는 수서환경의 대표적인 오염물질의 하나인 시안(CN)과 3, 5-이염화페놀(3, 5-Dichloro- phenol) 이 각각 개별적으로 존재하거나 혼재하는 조건에서의 발광박테리아 Vibriofischeri<>1] 대한 독성영향을 평가하였다. 이러한 실험결과를 통해 시안과 이염화페놀이 혼재하는 조건하의 독성영향을 예측하기위한 정량적인 모델을 작성하는 것이 가능하며, 실제 현장 시료에서 측정된 독성영향의 발현량과 이들 오염물질의 농도간의 관계에 대한 이해를 높이고자 하였다.
- 평가하였다. 이러한 실험결과를 통해 시안과 이염화페놀이 혼재하는 조건하의 독성영향을 예측하기위한 정량적인 모델을 작성하는 것이 가능하며, 실제 현장 시료에서 측정된 독성영향의 발현량과 이들 오염물질의 농도간의 관계에 대한 이해를 높이고자 하였다.
제안 방법
- 2 mg/L 범위에서 일정간격으로 6 농도를 제조하여 발광박테리 아에 노출하였다. 3, 5-이염화페놀 단일물질에 대한 독성시험 역시 2회에 걸쳐 실시되었는데 1차 시험에서는 0.7~ 11.1 mg/L 범위에서 5 농도를, 2차 시험에서는 0.9~ 11 mg/L 범위에서 [ 농도를 설정하여 노출하였다. 각 오염물질의 농도는 표준용액이 희석용액과 박테리아 주입에 의해 희석되는 비율을 조절하여 설정되었다.
- 이 시스템은 96- well plate 방식으로, 이를 이용하여 각 well 에 담겨진 300μL의 시료에 발광박테리 아를 일정 량 (#) 자동 주입하면서 노출이 시작되었다. 노출 시작 직후부터 발광도의 측정을 시작하여 총 60분 동안 3~5분 간격으로 측정하여 각 실험구별로 발광도의 변화를 추적하였다.
- 단일물질에 대한 독성시험 결과를 이용하여 혼합독성시험을 위한 시안과 3, 5-이염화페놀의 농도조합을 설정하였다. 혼합독성시험 (3차 실험)에서는시안의 농도 0, 2, 4, 8 mg/L과 3, 5-이염화페놀의 농도 0, 2, 4, 6, 8mg/L을 4x5 조합으로 만들어 시험에 이용하였다.
- 또한 금속류와 시안이 혼재하는 경우에는 시 안에 의한 pH 변화와 더불어시안화금속 화합물의 형성이 시안과 금속류의 생물이용도에 모두 영향을 미칠 수 있으므로 더욱 복잡하다. 따라서 현장 시료의 독성영향은 시료 내에 존재하는 유해물질의 농도를 모두 분석한다. 하여도 정확하게 예즉하는 것은 매우 어렵다.
- 보다 정량적으로 두 물질간의 독성상호작용을 규명하기 위하여 각 물질의 농도를 Toxic Unit(TU)으로 환산한 다음 각각의 TU를 합하여 발광박테리아의 상대발광 저해도와 비교하였다(Fig. 6). 발광박테리 아가 10분간 노출된 경우 시안이 0 또는 2 mg/L 인 경우 DCP의 농도가 0에서 8mg/L으로 증가하는 경우에는 TU 합의 증가에 따라 발광저해도가 일정하게 비례하였으나 시 안 농도가 4 또는 8 mg/L으로 증가한 이후에는 TU의 변화와 발광저해도는 유의한 관계성 이 나타나지 않았다 (Fig.
- 본 연구에서 실시한 시험생물과 시험방법의 적절성 을 평 가하기위한 양성 대조구로는 시험 물질 인 3, 5-이염화페놀과 별도로 6가 크롬과 아연을 추가하였다. 이들 세 물질은 ISO의 발광미생물 독성시험 표준규격인 ISO 11348에서 추천하는 물질로서 농도별 발광저해시험결과 EC20과 EC80의 범위안에 3, 5-이염화페놀은 3.
- 본 연구에서는 시안과 이염화페놀에 각각 노출 시 킨 발광박테 리 아의 발광저 해영 향시험 (1 차, 2 차 실험: Exp-1 & Exp-2)과 시안과 이염화페놀의 혼합물에 대한 발광저해영향시험 (3차 실험: Exp-3)을수행하였다.
- 시안 단일물질에 대한 독성시험은 2회에 걸쳐 실시되었는데 1차 시험에서는 시안농도(CN「)를 0.5-28 mg/L 범 위 에서 일정 간격 으로 7 농도를, 2차시 험에서는 시 안농도를 0.9~9.2 mg/L 범위에서 일정간격으로 6 농도를 제조하여 발광박테리 아에 노출하였다. 3, 5-이염화페놀 단일물질에 대한 독성시험 역시 2회에 걸쳐 실시되었는데 1차 시험에서는 0.
- 시험용액의 pH, 염분, 용존산소 등의 측정을 위해서 시험용액 제조에 이용한 것과 동일한 표준용액과 희석액 및 재활성화용액을 혼합하여 50mL의 용액을 만들어 이용하였다.
- 1998). 실험과정을 간략하게 설명하면, 발광박테리아 시약에 재활성화용액 1 mL을 넣고안정화시킨 후 100|iL를 약 40mL의 희석시약에 넣고 잘 섞은 다음 독성실험을 실시하였다. 발광박테리아를 노출시킬 여러 농도의 시안과 3, 5-이염화 페놀의 검액은 폴리에틸렌재질의 96-well plate에 준비하였다.
- 2mg/L 농도가 포함되어 야만 시험적합도를 인정받을 수 있다(ISO, 1998). 양성대조구 실험을 위해서 시험적합도 기준 농도를 포함하여 각 물질별로 6개의 농도구간을, 그리고 각 농도별로는 4개의 반복구를 설정하였다.
- 설정하였다. 혼합독성시험 (3차 실험)에서는시안의 농도 0, 2, 4, 8 mg/L과 3, 5-이염화페놀의 농도 0, 2, 4, 6, 8mg/L을 4x5 조합으로 만들어 시험에 이용하였다.
- 혼합독성을 정량적으로 평가하기 위해서는 단순히 두 가지 독성물질의 경우만 보더라도 각각 5개 농도구간에서 혼합독성을 평가하기 위해서는 총 25개의 농도에서 각각 독성영향을 평가해야만 한다. 따라서 n개의 물질에 대한 혼합독성을 m 개의농도 구간에서 평가하기 위해서는 개의 농도에서 독성시험을 수행해야 한다.
대상 데이터
- 발광박테 리 아 Vibrio fischeri (NRRL B-11177)은 (주)네오엔비즈 환경안전연구소에서 배양하여 동결건조시킨 발광박테리아 시약(VF1001, NeoEnBiz CO.)을 이용하였다. 본 연구에서는 발광박테리아 독성시험을 위하여 적당량의 시안화칼륨(KCN; CAS No.
- 본 연구는 해양수산부의 '해양수산 중소. 벤처기업 기술개발지원사업'의 지원을 받았으며 이에 감사드립니다.
- )을 이용하였다. 본 연구에서는 발광박테리아 독성시험을 위하여 적당량의 시안화칼륨(KCN; CAS No. 151-50-8; Aldrich)과 3, 5-이염화페놀(3, 5-Dichlorophenol; CAS No. 591-35-5; Aldrich)을 시험물질로 이용하였다.
데이터처리
- 모든 측정 결과는 평균만을 이용하였고, 평균과 함께 항상 표준편차를 계산하여 제시하였다. 시안과 이염화페놀에 각각 노출시킨 발광박테리아의 상대발광율에 대한 시안과 3, 5-이염화페놀의 반수영향농도 (EC50) 를 Probit method를 이용하여 각각 산출하였다 (ISO, 1998).
이론/모형
- 각 농도별 반복수는 4개 였고, 대조 구의 경우 반복수는 8개였다. 발광박테리아 시약주입 및 발광도의 측정은 (주)네오엔비즈에서 자체 개발한 N-tox system을 이용하였다. 이 시스템은 96- well plate 방식으로, 이를 이용하여 각 well 에 담겨진 300μL의 시료에 발광박테리 아를 일정 량 (#) 자동 주입하면서 노출이 시작되었다.
- 시안과 이염화페놀에 각각 노출시킨 발광박테리아의 상대발광율에 대한 시안과 3, 5-이염화페놀의 반수영향농도 (EC50) 를 Probit method를 이용하여 각각 산출하였다 (ISO, 1998).
성능/효과
- 3, 5-이 염화페놀에 노출된 발광박테리 아의 상대적인 발광도 저해영향은 1, 2차 실험의 경우 가장 낮은 농도인 0.7과 0.9 mg/L에서도 유의하게 나타난 반면 (Fig. 3), 3차 실험에서 2 mg/L에 노출된 박테리아는 노출 30분 경과시까지는 10% 내외의 발광저해도를 보이다가 이후 회복되어 대조구와 유의한 차이를 보이지 않아 1, 2차 실험결과와 다소 차이를 보였다(Fig. 4). 하지만 그 이상의 농도 범위에서는 모든 실험에서 일정한 농도-반응의 관계를 보여 실험간의 반수영향농도의 차이가 시안에 비해 다소 적었다(Table 1).
- 5). 3, 5-이염화페놀의 농도가 2mg/L인 경우에는 시안농도가0인 경우에 비해 시안이 2mg/L인경우에 발광도가 급격하게 감소하였다가 4mg/L 이상에서는 큰 변화가 없었다. 하지만 DCP가 4mg/L 이상인 경우에는 시안이 없는 경우 상대발광도가 50%로 크게 떨어졌고, 시안이 2mg/L으로 증가였을 때 다시 급격한 발광도 감소를 보인 반면, 시안이 4와 8mg/L으로 증가하였을 때는 오히려 발광도가 다소 증가하는 역전 현상을 보였다 (Fig.
- 고농도(>4 mg/L)의 3, 5-이염화페놀에 노출된 발광박테리아의 상대발광도는 노출시간에 따라서지속적으로 감소하는 특징을 보여 반수영향농도역시 모든 실험에서 노출시간에 따라 감소하였다. 하지만 시간별 반수영향농도의 변이폭은 시안과비교해 크지 않았다 (Table 1).
- 1, 2). 노출 시간이 30분 경과한 시점에 시안의 각 농도별 발광도는 최저값에 도달하였고, 그 이후에는 일부 농도에서 발광도가 회복되는 경향이 관찰되었다 (Figs. 1, 2).
- 경우에는 11%로 이온화되지 않은 형태의비율이 급격하게 감소함을 알 수 있다. 따라서 3, 5- 이염화페놀의 총농도가 모두 8mg/L 인 경우라 하더 라도 시 안농도가 0, 2, 4, 8mg/L으로 증가함에 따라 이온화 되지 않은 3, 5-이염화페놀의 농도는 각각 7.5, 4.9, 2.7, 0.9 mg/L으로 큰 차이를 보이 게 됨을 알 수 있다. 이에 따라 시안 농도가 8mg/L인 경우에는 이온화 되지 않은 3, 5-이염화페놀의 농도가 각 실험구별로 큰 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다(Fig.
- 2로 나타났다. 따라서 각각의 물질은 ISO(1998)에서 제시하는 기준치인 3.4, 18.7, 그리고 2.2 mg/L를 범위 안에 포함하고 있어, N-tox 시스템을 이용한 발광미생물 독성시험은 유해물질 민감도 및 반응성의 측면에서 문제가 없는 것으로 판단할 수 있었다.
- 발광박테리아가 30분간 노출된 경우에는 시안이 2 mg/L인 경우 동일한 TU에서 관찰되는 발광저해도가 시안이 0인 경우와 비교해 다소 낮았지만, TU와 저해영향 간의 유의한 관계성은 10분 노출 시와 마찬가지로 유의하게 나타났다(Fig. 6). 시안이 4 mg/L으로 증가한 경우에는 동일한 TU에서 나타나는 저해영향은 매우 낮아졌지만, TU의 증가에 따라 저해도가 증가하는 유의한 관계성은 나타났다.
- 발광박테리아가 시안과 3, 5-이염화 페놀(DCP)의 혼합물에 10분 또는 30분 노출된 경우 상대발광도는 DCP의 농도가 0mg/L 인 경우 시 안농도가 증가함에 따라 감소하는 경향이 뚜렷하게 나타났다 (Fig. 5). 3, 5-이염화페놀의 농도가 2mg/L인 경우에는 시안농도가0인 경우에 비해 시안이 2mg/L인경우에 발광도가 급격하게 감소하였다가 4mg/L 이상에서는 큰 변화가 없었다.
- 따라서 혼합독성을 평가하기 위한 시험부담을 감당하기 위해서는 보다 효율적 인 시험방법이 개발될 필요가 있다. 본 연구에 활용된 N-tox®1 독성평가 시스템은 현재 개발된 독성 시 험법중에서 가장 효율적인 시 험방법이 라고 할 수 있기 때문에 혼합독성에 대한 정량적인 평가를 위해서 손쉽게 활용할 수 있었다.
- 본 연구에서 비록 HCN을 물에 용해하지는 않았지만 KCN이 가수분해되어 형성된 HCN이 공기중으로 휘발되어 시안의 농도는 노출시간이 경과함에 따라 감소하였고 낮은 농도의 시안에 노출되어 생리적 저해가 일어났으나 저해의 정도가 치사에 이를 정도는 아니었던 발광박테리아는 시안이 휘발된 이후 발광도의 회복을 보인 것으로 추정된다. 하지만 일정 수준 이상의 시안에 노출된 발광박테리 아는 1차 실험에서 14, 28mg/L에 노출된 경우처럼 완전히 사망하거나, 2차 실험에서 9.
- 본 연구에서 활용한 N-tox® 독성평가 시스템의 독성검출 성능을 평가하기 위해서 실시한 양성대조구 시험결과 3, 5-이염화페놀(mg/L)의 EC20은 2.6, EC80은 11.5 이었고, 6가 크롬 (mg/L)의 경우 EC20은 3.2, EC80은 27.3이었으며, 아연(mg/L)의 경우 EC20은 1.1, EC80은 7.2로 나타났다. 따라서 각각의 물질은 ISO(1998)에서 제시하는 기준치인 3.
- 수 있다. 본 연구에서 희석액을 이용한 발광박테리아 대조구의 pH는 7.0이었다. 하지만 시안 농도가 2, 4, 8 mg/L인 경우 시료의 pH가 8.
- 본 연구에서는 시안 농도 증가에 따라 이염화페놀 독성이 크게 감소할 수 있고 그 원인이 시안에 의한 pH 증가에 있음을 설명하였다. 이와 같은 상호작용에 대한 연구결과는 실제 현장 시료에서 나타날 수 있는 유해물질 오염과 독성발현 정도를 이해하는 데에 도움을 줄 수 있다.
- 6). 시안이 4 mg/L으로 증가한 경우에는 동일한 TU에서 나타나는 저해영향은 매우 낮아졌지만, TU의 증가에 따라 저해도가 증가하는 유의한 관계성은 나타났다. 하지만 시 안이 8 mg/L으로 증가한 이 후에는 유의한 관계성 이 사라지는 특징을 보였다.
- 실측된 pH 값과 문헌상의 평균 Ka 값(10「&2)을이용하여 시안농도별로 R 값을 계산해보면, 시안농도가 0일 때는 94%로 3, 5-이염화페놀의 대부분이 이온화되지 않은 형태로 존재하지만 시안농도가 2 mg/L인 경우에는 61%, 4mg/L인 경우에는 33%, 8 mg/L인 경우에는 11%로 이온화되지 않은 형태의비율이 급격하게 감소함을 알 수 있다. 따라서 3, 5- 이염화페놀의 총농도가 모두 8mg/L 인 경우라 하더 라도 시 안농도가 0, 2, 4, 8mg/L으로 증가함에 따라 이온화 되지 않은 3, 5-이염화페놀의 농도는 각각 7.
- 7). 이러한 pH 범위는 본 연구에서 시안 첨가에 따른 시료 pH 변화 범위와 거의 일치하고 있어 시안 첨가에 따른 pH 변화가 이 염화페놀의 독성발현에 매우 큰 영향을 미쳤음을 예상할 수 있다.
- 일부 농도구간에서의 발광도 회복현상에 의해 발광박테리아에 대한 시안의 반수영향농도의 변화곡선은 1~3차 실험에서 모두 노출 직후에서 30분까지는 감소하다가 30분 경과 후 60분까지는 다시 증가하는 U자형 패턴을 보였다 (Fig. 2). 반수영향농도(ECso)는 1차 실험에서 10분과 30분 노출 시 2, 3차 실험과 비교해 다소 높았으나 60분 노출 시에는 2차 실험결과와 유사한 수준을 보였다(Table 1).
- 7). 즉, pKi 값이 4.7인 Pentachlorophenol 의 경우에는 pH가 3에서 6까지 증가하는 과정에서 R 값이 크게 감소하고, P& 값이 5.2~6.9의 범위를 보이는 Tetrachlorophenole|- Trichlorophenol류는 pH가 5 — 8 범위에서, Dichlorophenol류는 pH가 7~9 범위에서 급격한 감소가 일어남을 알 수 있다
- 이와 같은 상호작용에 대한 연구결과는 실제 현장 시료에서 나타날 수 있는 유해물질 오염과 독성발현 정도를 이해하는 데에 도움을 줄 수 있다. 특히 본 연구를 통해 이 염화페놀과 같이 pH 변화에 민감한 유해물질의 경우에는 반드시 이온화정도를 고려하여 3- 물질의 독성영향을 파악하고, pH에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인에 대한 고려가 필요함을 알 수 있었다.
- 3, 5-이염화페놀의 농도가 2mg/L인 경우에는 시안농도가0인 경우에 비해 시안이 2mg/L인경우에 발광도가 급격하게 감소하였다가 4mg/L 이상에서는 큰 변화가 없었다. 하지만 DCP가 4mg/L 이상인 경우에는 시안이 없는 경우 상대발광도가 50%로 크게 떨어졌고, 시안이 2mg/L으로 증가였을 때 다시 급격한 발광도 감소를 보인 반면, 시안이 4와 8mg/L으로 증가하였을 때는 오히려 발광도가 다소 증가하는 역전 현상을 보였다 (Fig. 5). 이와 같은 역전현상은 DCP가 6과 8mg/L일 때 더욱 뚜렷하게 나타났다(Fig.
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