[논문]해양바이오물질이 PCB의 독성작용에 미치는 영향

이현교; 김혜영; 양재호

문제 정의

과거 연구에서 키토산의 흡착력을 이용한 중금속이나 다이옥신 등의 오염물질 해독작용이 보고 된 바 있으나 지금까지 PCB에 대한 신경독성 해소에 대한 연구는 알려진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 다양한 키토산의 분자 용량을 활용하여 PCB의 신경 장애 현상인 PKC의 활성을 억제할 수 있는지를 분석하고자 하였다.
본 연구에서는 Protein kinase C isoform의 활성을 측정하기 위하여 각각의 항체를 사용하여 cytosolic fraction에서 membrane fraction으로 이동되는 정도를 immunoblot을 이용하여 분석하였다. 이성질체 중PKC-betall는 PCB-77과 PCB-81에서 translocation을 보이지 않은 반면 PCB-105 와 PCB-123에서는 membrane fraction 의 상승을 보였다 (Fig.
신경 세포의 성장 및 발달은 early developmental age에 심각한 영향을 받을 수 있으므로 PCB에 의한 신경 독성 작용의 생체지표를 찾는 일은 앞으로 활발한 연구가 요구되는 분야이다 [1]. 본 연구에서는 뇌, 비장, 심장 등에 많이 분포하며 뇌세포의 성장조절과 신경전달물질의 분버], 유전자 발현, 세포의 대사 등에도 관여하는 Protein kinase C (PKC)의 작용기전 분석을 통하여 PCB가 신경 독성에 미치는 영향을 이해하고자 하였으며, non 와 mono-ortho PCB의 구조적 특성에 따른 신경독성을 비교하여 효율적인 위해성 평가의 기준을 확립하고자 하였다. 아울러 PCB와 같은 환경오염물질에 의한 신경세포의 장애현상을 예방 또는 차단하는 방법을 모색하기 위해 면역계를 강화하고 암세포의 활동을 저하시키는 해양 생리활성물질인 키토산의 효능을 평가하고 이 물질의 활용가능성을 제시하고자 하였다.
[4]. 본연구에서는 키토산이 PCB와 같은 환경오염물질의 유해성을 예방 또는 차단하는데 어떤 역할을 하는지 밝히고자 하였다. 과거 연구에서 키토산의 흡착력을 이용한 중금속이나 다이옥신 등의 오염물질 해독작용이 보고 된 바 있으나 지금까지 PCB에 대한 신경독성 해소에 대한 연구는 알려진 바가 없다.
본 연구에서는 뇌, 비장, 심장 등에 많이 분포하며 뇌세포의 성장조절과 신경전달물질의 분버], 유전자 발현, 세포의 대사 등에도 관여하는 Protein kinase C (PKC)의 작용기전 분석을 통하여 PCB가 신경 독성에 미치는 영향을 이해하고자 하였으며, non 와 mono-ortho PCB의 구조적 특성에 따른 신경독성을 비교하여 효율적인 위해성 평가의 기준을 확립하고자 하였다. 아울러 PCB와 같은 환경오염물질에 의한 신경세포의 장애현상을 예방 또는 차단하는 방법을 모색하기 위해 면역계를 강화하고 암세포의 활동을 저하시키는 해양 생리활성물질인 키토산의 효능을 평가하고 이 물질의 활용가능성을 제시하고자 하였다.

가설 설정

[3h]PDBu를 이용한 PKC활성 측정은 전체의 활성만을 알 수 있는 단점이 있다. PKC는 11개 이상의 이성질체를 가지고 있으며 이들은 세포 내 분포나 작용면에서 서로 많은 차이를 나타내고 있다.

제안 방법

5 mM NaHCOs, 25 mM glucose, 4 mM glutamine, 10 % heat-inactivated fetal bovine serum)을 사용하였다 소뇌 과립 신경 세포 적출 3시간 전에 50 ml의poly-L-lysine을 처리한 6-well culture plate에 최종 세포 농도가 I* xlO₅ cells/ml 되게 한 cell suspension을 3 ml씩 넣었다. 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하고 nonneuronal cell의 성장을 억제하기 위해 일차배양 후 24-48시간 사-이에 5 11M의 cytosine arabinoside를처리하였다. 세포는 PCB에 대한 반응이 가장 민감한 시기인 생후 14일 즉, 일차배양 후 7일째에 실험에 사용하였다 [6].
PKC isozymes의 translocation을 확인하기 위해 6-well culture plate 에서 7일간 배 양한 소뇌 과립 신경세포에 DMSO (0.1%) control 및 25, 50 nM의 PCB를 15분간 처 리하였다. 키토산은 1 % acetic acid에 녹인 후 stock 용액을 만들었으며 pH는 5.

대상 데이터

3, 3', 4, 4'-pentaCB), PCB-123 (2', 3, 4, 4', 5-pentaCB)를 선택하였다. PCB는 ACCU standard제품을 구입하여사용하였다
본 연구에 사용된 일반 시약은 Sigma사에서 구입하였으며 PKC의 항체 등은 Santa cruze사-에서 구입하여 사용하였다 본 연구에서는 PCB 이성질체 중non-ortho 형태인 PCB-77 (3, 3', 4, 4'-tetraCB), PCB-81 (3, 4, 4;5-tetraCB) 와 mono-ortho 형태인 PCB-105 (2, 3, 3', 4, 4'-pentaCB), PCB-123 (2', 3, 4, 4', 5-pentaCB)를 선택하였다. PCB는 ACCU standard제품을 구입하여사용하였다
37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하고 nonneuronal cell의 성장을 억제하기 위해 일차배양 후 24-48시간 사-이에 5 11M의 cytosine arabinoside를처리하였다. 세포는 PCB에 대한 반응이 가장 민감한 시기인 생후 14일 즉, 일차배양 후 7일째에 실험에 사용하였다 [6]. 95% 이상의 전형적인 소뇌 과립 신경세포를 배양하였다

데이터처리

실험결과의 통계학적 처리는 Student's F-test를 사용하였으며 p < 0.05 수준 이하에서 유의성을 결정하였다

이론/모형

PKC isozyme의 translocation을 측정하기 위하여 cellular fraction 또는 extract에 대해 western blot을 실시하였다. cellular fractione] sample을 10 % acrylamide gel에서 전기 영동한 후 semi-dry electrophoretic transfer cell (Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 nitrocellulose paper에 10 V로 30 분에 걸쳐 blotting하고 blocking buff&로 1시간 동안 반응시 킨 후 specific monoclonal antibodies (Santa Cruz, CA, USA)를 적정 비율로 희석한 후 1시간 동안 반응시킨다.
특히 강력한 PKC 활성을 보인 PCB-105 에 의한 PKC 활성은 1,000 kDa 이상 값에서 확실한 억제작용이 나타났으며 낮은 분자량인 50 kDa 에서는 억제효과가 매우 낮은 것으로 나타났다 (Table 2). 특정 PKC isoform에 대한 키토산의 영향을 측정하기 위하여 immimoblot 방법으로 특정 PKC isofonn 에 대한 translocation을 억제하는지를 분석하였다. PKC-betall의 경우 PCB-105는 cytosol의 단백 량이 감소하는 반면 membrane의 단백 량은 증가하여 PCB에 의한 활성을 나타내었다.

성능/효과

PKC의 전체적인 활성을 분석하기 위해 [3:H]PDBu 를 이용하여 PKC의 전체적인 활성을 분석한 결과 non-ortho PCB 에 비해 mono-ortho PCB의 활성이 높게 나타났으며 mono-ortho 구조가 신경세포 내 PKC 의 활성을 증가시키는 neuroactive한 화학적 구조임을 확인하였다(Table 1). eon-ortho 구조인 PCB-77과 PCB-81 에 비해 mono-ortho 구조인 PCB-105 와 PCB-123에서 PKC 활성이 뚜렷이 나타났으며 이러한 변화는 최고의 용량인 50 11M에서 나타났다.
확인하였다(Table 1). eon-ortho 구조인 PCB-77과 PCB-81 에 비해 mono-ortho 구조인 PCB-105 와 PCB-123에서 PKC 활성이 뚜렷이 나타났으며 이러한 변화는 최고의 용량인 50 11M에서 나타났다. [NPDBu을 이용한 정량적인 PKC활성 측정 방법은 PKC가 membrane fraction으로 옮겨 가는 정도를 정 확하게 측정할 수 있어 PKC활성의 전체를 추정하는데 유용하게 사용되고 있다.
본 연구는 생 후 7일 된 SD rat의 소뇌로부터 과립층 세포를 확보하여 성장기에 취약한 신경독성 물질을 선별 할 수 있는 근거를 확보하였다 다이옥신과 유사한 구조 및 작용을 가지고 있는 non-ortho PCB 에 비해 Ah 수용체와 친화력이 없거나 매우 낮은 mono-ortho PCB는 위해성 평가에서 지금까지 제외되어 왔으며 기존의 Toxic equivalent factor (TEF) 개념으로 환산할 때 non-ortho 구조인 PCB-77은 mono- ortho PCB-123의 30배나 되는 독성 물질이지만 [11], mono-ortho PCB가 성장기 소뇌 세포에서 non-ortho PCB에 비해 PKC PKC활성에 더 강력한 영향을 주는 것으로 확인되어 뇌 세포에서 중요한 신경독성 물질임이 확인되었다. 따라서 본 연구 결과는 앞으로 PCB의 독성 평가 뿐 아니라 지금까지 활용되어오고 있는 TEF의 새로운 개념의 설정 필요성을 강조하여 앞으로 새로운 차원의 위해성 평가모델의 확립을 가져오게 할 것으로 사료된다.
PCB-77의 경우 50 11M 에서 15 %의 증가를 나타내었으며 또 다른 non-ortho PCB인 PCB-81의 경우도 50 11M에서 12 %정도의 증가만 나타내었다. 즉 다이옥신과 유사구조를 가진 non-ortho PCB는 독성 등가값 (TEF)이 높을지라도 신경세포에서 신호전달기작에 중요한 역할을 하는 PKC의 활성에는 큰 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다. 반면 다이옥신과 유사구조가 아닌 mono- ortho PCB-105 와 PCB-123은 PKC 활성에 높은 값을 나타내었다.
있었다. 특히 강력한 PKC 활성을 보인 PCB-105 에 의한 PKC 활성은 1,000 kDa 이상 값에서 확실한 억제작용이 나타났으며 낮은 분자량인 50 kDa 에서는 억제효과가 매우 낮은 것으로 나타났다 (Table 2). 특정 PKC isoform에 대한 키토산의 영향을 측정하기 위하여 immimoblot 방법으로 특정 PKC isofonn 에 대한 translocation을 억제하는지를 분석하였다.

후속연구

확인되었다. 따라서 본 연구 결과는 앞으로 PCB의 독성 평가 뿐 아니라 지금까지 활용되어오고 있는 TEF의 새로운 개념의 설정 필요성을 강조하여 앞으로 새로운 차원의 위해성 평가모델의 확립을 가져오게 할 것으로 사료된다. 또한 본 연구 결과는 PCB의 구조-활성 관계를 확보하여 식품 또는 환경 중에 존재하는 신경 내분비계 장애 물질을 효율적으로 선별하고 위해성 평가의 효율을 향상시키는데 기여 할 것으로 전망된다.
따라서 본 연구 결과는 앞으로 PCB의 독성 평가 뿐 아니라 지금까지 활용되어오고 있는 TEF의 새로운 개념의 설정 필요성을 강조하여 앞으로 새로운 차원의 위해성 평가모델의 확립을 가져오게 할 것으로 사료된다. 또한 본 연구 결과는 PCB의 구조-활성 관계를 확보하여 식품 또는 환경 중에 존재하는 신경 내분비계 장애 물질을 효율적으로 선별하고 위해성 평가의 효율을 향상시키는데 기여 할 것으로 전망된다. 키토산의 고분자 물질은 전체 PKC의 활성 뿐 만아니라 특정 한 PKC isoform 에 대한 활성도 억제하는 것으로 나타나 키토산이 환경오염물질에 의한 신경세포의 내분비계 장애 현상에 어떤 형태로든 관여하고 있음을 암시하고 있어 앞으로 해양바이오 소재에 대한 기능성 및 신소재로서의 발전 가능성을 암시하는 중요한 자료로 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
또한 본 연구 결과는 PCB의 구조-활성 관계를 확보하여 식품 또는 환경 중에 존재하는 신경 내분비계 장애 물질을 효율적으로 선별하고 위해성 평가의 효율을 향상시키는데 기여 할 것으로 전망된다. 키토산의 고분자 물질은 전체 PKC의 활성 뿐 만아니라 특정 한 PKC isoform 에 대한 활성도 억제하는 것으로 나타나 키토산이 환경오염물질에 의한 신경세포의 내분비계 장애 현상에 어떤 형태로든 관여하고 있음을 암시하고 있어 앞으로 해양바이오 소재에 대한 기능성 및 신소재로서의 발전 가능성을 암시하는 중요한 자료로 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

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