본 연구는 인간 난관액 또는 자궁액 내에 존재하는 에너지원이 생쥐 2-세포기 배의 체외 발달에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. ICR 암 생쥐에 5 IU hCG 주사 후 $46{\sim}50$ 시간에 2-세포기 배를 회수하였다. 회수된 배는 3가지 배양 조건 [대조군: 0 mM Group A: glucose(G) 0.5 mM + pyruvate(P) 0.32 mM + lactate(L) 10.5 mM, Group B: G 3.15 mM + P 0.1 mM + L 5.83 mM]에서 72시간 배양하였다. 배양 24 시간에 상실배 출현율은 group A (72.3%)와 group B (56.6%)가 대조군(34.9%)보다 유의하게 높았다.(p<0.05). 그러나 48시간에 배반포기 배 출현율은 대조군(51.8%)이 group A (39.8%)와 group B (25.9%)보다 유의하게 (p<0.05) 높았다. 72시간에 투명대 부착 ($ZiB,\;41.0{\sim}51.8%$), 투명대 탈출 ($ZeB,\;18.1{\sim}32.5%$) 및 총 배반포기 배 출현율 ($68.7{\sim}73.5%$)은 실험군 간에 통계적인 차이가 없었다. 배반포기 배의 평균 세포수와 ICM 세포수는 group A (70.8, 13.4)와 group B (64.4, 11.8)가 대조군 (53.1, 5.7)보다 유의하게(p<0.05) 많았고, 통계적인 유의차는 없었으나 group A가 group B보다 많은 경향이었다. 총 세포수에 대한 ICM 비율은 group A(22.9%)와 group B(23.7%)가 대조군(14.2%)보다 유의하게(p<0.05) 높았다. 영양배엽(TE) 세포수($34.1{\sim}45.1$)는 실험군 간에 통계적인 차이가 없었다. ICM에 대한 TE 비율(ICM:TE ratio)은 대조군(1:6.0)이 group A(1:3.4)나 group B(1:3.4)보다 유의하게(p<0.05) 높았다. 생쥐 2-세포기 배를 배양하여 72시간까지의 배 발달율을 살펴보면 배양액에 에너지원을 첨가하는 것이 효과적이었으며, 자궁액 농도보다는 난관액 농도로 에너지원을 조절했을 때 배 발생 능력이 높은 경향을 보였다.
본 연구는 인간 난관액 또는 자궁액 내에 존재하는 에너지원이 생쥐 2-세포기 배의 체외 발달에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시하였다. ICR 암 생쥐에 5 IU hCG 주사 후 $46{\sim}50$ 시간에 2-세포기 배를 회수하였다. 회수된 배는 3가지 배양 조건 [대조군: 0 mM Group A: glucose(G) 0.5 mM + pyruvate(P) 0.32 mM + lactate(L) 10.5 mM, Group B: G 3.15 mM + P 0.1 mM + L 5.83 mM]에서 72시간 배양하였다. 배양 24 시간에 상실배 출현율은 group A (72.3%)와 group B (56.6%)가 대조군(34.9%)보다 유의하게 높았다.(p<0.05). 그러나 48시간에 배반포기 배 출현율은 대조군(51.8%)이 group A (39.8%)와 group B (25.9%)보다 유의하게 (p<0.05) 높았다. 72시간에 투명대 부착 ($ZiB,\;41.0{\sim}51.8%$), 투명대 탈출 ($ZeB,\;18.1{\sim}32.5%$) 및 총 배반포기 배 출현율 ($68.7{\sim}73.5%$)은 실험군 간에 통계적인 차이가 없었다. 배반포기 배의 평균 세포수와 ICM 세포수는 group A (70.8, 13.4)와 group B (64.4, 11.8)가 대조군 (53.1, 5.7)보다 유의하게(p<0.05) 많았고, 통계적인 유의차는 없었으나 group A가 group B보다 많은 경향이었다. 총 세포수에 대한 ICM 비율은 group A(22.9%)와 group B(23.7%)가 대조군(14.2%)보다 유의하게(p<0.05) 높았다. 영양배엽(TE) 세포수($34.1{\sim}45.1$)는 실험군 간에 통계적인 차이가 없었다. ICM에 대한 TE 비율(ICM:TE ratio)은 대조군(1:6.0)이 group A(1:3.4)나 group B(1:3.4)보다 유의하게(p<0.05) 높았다. 생쥐 2-세포기 배를 배양하여 72시간까지의 배 발달율을 살펴보면 배양액에 에너지원을 첨가하는 것이 효과적이었으며, 자궁액 농도보다는 난관액 농도로 에너지원을 조절했을 때 배 발생 능력이 높은 경향을 보였다.
This study was conducted to examine the effects of energy substrates in different conoentration of carbohydrates in the human oviduct and uterus on the in vitro development of mouse 2-cell embryos. Two-cell embryos were collected from ICR female mice at $46{\sim}50\;hr$ after 5 IU hCG inj...
This study was conducted to examine the effects of energy substrates in different conoentration of carbohydrates in the human oviduct and uterus on the in vitro development of mouse 2-cell embryos. Two-cell embryos were collected from ICR female mice at $46{\sim}50\;hr$ after 5 IU hCG injection and cultured in three different media [control: 0 mM, Guoup A: glucose (G) 0.5 mM + pyruvate (P) 0.32 mM + lactate (L) 10.5 mM, Group B: G 3.15 mM + P 0.1 mM + L 5.83 mM] for 72 hr. Rates of morula formation of group A (72.3%) and B (56.6%) were significantly higher higher (p<0.05) than that of control (34.9%) at 24 hr. However, blastocyst rate was significantly higher (p<0.05) in control (51.8%) than group A (39.8%) and B (28.9%) at hr. At 72 hr, no differences were found in the number of zona-intact, zona-escape and total blastocysts among groups. Mean and ICM cell numbers were significantly higher (p<0.05) in group A (78.0, 13.4) and B (64.4, 11.8) than control (53.1, 5.7), respectively, The percent of ICM were significantly higher (p<0.05) in group A (22.9%) and B (23.7%) than control (14.2%). No differences were round in the TE cell numbers ($34.1{\sim}45.1$). The ICM:TE ratio was significantly higher $34.1{\sim}45.1$ in control (1:6.0) than group A (1:3.4) and B (1:3.4). This study shows that energy substrates added to culture media especially, the oviductal level of carbohydrates increase the developmental capacity of 2-cell mouse embryos.
This study was conducted to examine the effects of energy substrates in different conoentration of carbohydrates in the human oviduct and uterus on the in vitro development of mouse 2-cell embryos. Two-cell embryos were collected from ICR female mice at $46{\sim}50\;hr$ after 5 IU hCG injection and cultured in three different media [control: 0 mM, Guoup A: glucose (G) 0.5 mM + pyruvate (P) 0.32 mM + lactate (L) 10.5 mM, Group B: G 3.15 mM + P 0.1 mM + L 5.83 mM] for 72 hr. Rates of morula formation of group A (72.3%) and B (56.6%) were significantly higher higher (p<0.05) than that of control (34.9%) at 24 hr. However, blastocyst rate was significantly higher (p<0.05) in control (51.8%) than group A (39.8%) and B (28.9%) at hr. At 72 hr, no differences were found in the number of zona-intact, zona-escape and total blastocysts among groups. Mean and ICM cell numbers were significantly higher (p<0.05) in group A (78.0, 13.4) and B (64.4, 11.8) than control (53.1, 5.7), respectively, The percent of ICM were significantly higher (p<0.05) in group A (22.9%) and B (23.7%) than control (14.2%). No differences were round in the TE cell numbers ($34.1{\sim}45.1$). The ICM:TE ratio was significantly higher $34.1{\sim}45.1$ in control (1:6.0) than group A (1:3.4) and B (1:3.4). This study shows that energy substrates added to culture media especially, the oviductal level of carbohydrates increase the developmental capacity of 2-cell mouse embryos.
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문제 정의
따라서 본 실험은 인간의 체외수정술에서 임신율을 향상시킬 수 있는 방법 중에서 발생 능력이 가장 우수한 배반포기 배아의 획득을 모색하기 위해, glutamine이 단독 에너지원으로 함유되어 있는 배양액에 인간 생식 기관 (난관, 자궁)액 내 에너지원인 glucose, pyruvate 및 lac- fate 를 각각 다른 농도로 첨가하여 생쥐 2-세포기 배 발생능력에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
3회 실험에서 105개의 2-세포기 배를 72시간 배양한 다음 나타난 배반포기 배에서 ICM/TE 세포 수, %ICM 및 ICM:TE 비율을 조사하여 Table 2에 제시하였다. 57개의 배반포기 배(대조군: 17; group A: 20; group B: 20) 중에서 55개(대조군: 15; group A: 20; group B: 20)가 이중 형광 염색에 성공하여, ICM, TE 및 총 세포수를 대조군 (85, 512, 597), group A(267z 901, 1, 168) 및 group B(235, 761, 996)에서 각각 조사하였다.
57개의 배반포기 배(대조군: 17; group A: 20; group B: 20) 중에서 55개(대조군: 15; group A: 20; group B: 20)가 이중 형광 염색에 성공하여, ICM, TE 및 총 세포수를 대조군 (85, 512, 597), group A(267z 901, 1, 168) 및 group B(235, 761, 996)에서 각각 조사하였다.
확인된 암컷만 실험에 이용하였다. hCG 주사 후 약 48시간째에 경추탈골법으로 생쥐를 희생시킨 다음 난관을 적출하여 실체현미경 하의 배양 접시(3037, Falcon, USA)에서 난관을 관류하여 2-세포기 배를 회수하였다. 회수한 2-세포기 배중에서 형태적으로 정상적인 것만을 선별하여 실험에 이용하였다 (Fig.
난자의 배양은 glutamine을 단독 에너지원으로 함유하고 있는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium; 11966-025, Gibco, Grand Island, NY, USA)에 20% 인간 난포 액(hFF)을 첨가하여 사용하였다(대조군). 배양액에 glu- cose(G) 0.
Falcon)에 10개 내외의 배를 배양하였다. 모든 실험군은 72시간 동안 배양하면서 배양 48시간째에 동일한 배양액을 1/2씩 교체하였고 24시간 간격으로 배 발달 양상을 조사하였다. 배 발달은 상실배기 배(morula), 배반포기 배 (blastocyst), 투명대 부착 배반포기 배 (zona-intact blas-tocyst- tocyst, ZiB) 및 투명대 탈출 배반포기 배(hatching〜hat ched blastocyst, zona-escape blastocyst, ZeB, Fig.
모든 실험군은 72시간 동안 배양하면서 배양 48시간째에 동일한 배양액을 1/2씩 교체하였고 24시간 간격으로 배 발달 양상을 조사하였다. 배 발달은 상실배기 배(morula), 배반포기 배 (blastocyst), 투명대 부착 배반포기 배 (zona-intact blas-tocyst- tocyst, ZiB) 및 투명대 탈출 배반포기 배(hatching〜hat ched blastocyst, zona-escape blastocyst, ZeB, Fig. IB) 등으로 나누어 관찰, 기록한 다음, 배양 72시간에 형광 염색법을 이용하여 배반포기 배에서 총 세포 수 및 ICM/TE 세포수를 조사하였다.
첨가하여 사용하였다(대조군). 배양액에 glu- cose(G) 0.5 mM, pyruvate(P) 0.32 mM, lactate(L) 10.5 mM(난관액 농도, group A) 또는 G 3.15 mN] P 0.1 mM, L 5.83 mM (자궁액 농도, group B)을 각각 첨가하여 실험에 사용하였다.
사용하였다. 생쥐는 온도와 명암이 조절되는 곳에서 실험에 사용될 때까지 사육되었으며, 명암의 주기는 14: 10시간으로 조절하였고, 사료와 물은 무제한으로 급여하였다.
5시간 이상 방치하여 염색을 유도하였다. 염색이 완료된 배반포기 배는 glycerol (G2025, Si印mm)에서 과다한 양의 염색액을 제거하고 나서 slide glass로 옮겨 놓고 cover glass로 덮은 다음, 형광 현미경 (BX50, Olympus, Japan) 에 부착된 형광 여과기에 자외선 (UV)을 통과시켜 청색으로 나타나는 것은 ICM, 분홍색으로 나타나는 것은 TE로 관찰하였다(Fig. 1C).
대상 데이터
9%)은 실험군 간에 통계적인 차이가 없었다. 176개의 배반포기 배(대조군: 58; group A: 61; group B: 57)에서 총 세포 수(대조군: 3, 079; group A: 4, 620; group B: 3, 673)를 관찰하였다. 평균 세포수는 group A(70.
과배란을 유도하기 위해 PMSG(G-4877, Sigma) 와 hCG (CG-10, Sigma)# 각각 5 IU씩 48 시간 간격으로 복강 주사하고 암컷과 수컷을 합사시킨 다음, 12시간 후에 질 전이 확인된 암컷만 실험에 이용하였다. hCG 주사 후 약 48시간째에 경추탈골법으로 생쥐를 희생시킨 다음 난관을 적출하여 실체현미경 하의 배양 접시(3037, Falcon, USA)에서 난관을 관류하여 2-세포기 배를 회수하였다.
본 연구에 사용된 생쥐는 국내에서 사육중인 ICR 계통 마우스로, 암컷은 생후 3〜6주령, 수컷은 10〜15주령인 것을 사용하였다. 생쥐는 온도와 명암이 조절되는 곳에서 실험에 사용될 때까지 사육되었으며, 명암의 주기는 14: 10시간으로 조절하였고, 사료와 물은 무제한으로 급여하였다.
hCG 주사 후 약 48시간째에 경추탈골법으로 생쥐를 희생시킨 다음 난관을 적출하여 실체현미경 하의 배양 접시(3037, Falcon, USA)에서 난관을 관류하여 2-세포기 배를 회수하였다. 회수한 2-세포기 배중에서 형태적으로 정상적인 것만을 선별하여 실험에 이용하였다 (Fig. 1A).
데이터처리
배양 시기에 따라 각 처리군 간 평균에 대한 유의성은 Sigma plot 2001(v7.0)과 SAS package program (v8.0)을 이용하여 Student's f-test와 Chi-square 검정을 병용 실시하여 분석하였고, 5% 내00.05)일 때 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
생쥐 배의 체외 발달에 대한 실험 결과는 백분율로 나타내었고, 불연속 변수에 대한 표준 편차는 ±SD로 표시하였다. 배양 시기에 따라 각 처리군 간 평균에 대한 유의성은 Sigma plot 2001(v7.
이론/모형
각각의 배양액에서 형성된 배반포기 배는 이중 형광 염색법(박 등, 2002)으로 ICM과 TE를 염색하여 관찰하였다. 염색법을 간단하게 설명하면, 배반포기 배를 실온에서 염색액 1에서 15초 이내로 노출하고 나서 즉시 염색액 2로 옮긴 다음 4°C에서 1.
성능/효과
Table 1에 제시하였다. 배양 24시간에 상실배 출현율은 에너지 첨가군인 group A(72.3±27.0%)와 group B (56.6±14.6%)가 대조군(34.9±19.3%)보다 유의하게 높았다 (p<0.05). 배양 48시간에 배반포기 배 출현율은 대조군 (51.
박 등, 2004). 배양 96시간에 부화 배반포기 배 발생률이 glucose(0.5 mM: 82.3%; 3.15 mM: 78.5%)를 첨가하였을 때 가장 우수하였고 특히 저 농도(난관액 농도, 0.5 mM)에서 가장 좋았다. 반면, pyruvate(0.
Glucose-free mediunr을 사용할 경우, 생쥐에서 배반포기 배의 부화가 늦어지고, 사람에서도 같은 문제점을 내포하고 있을 깃으로 생각된다(Conaghan 등, 1993). 본 실험에서도 배양액에 이ucose를 포함한 에너지원을 혼합하였을 때, 생쥐 2-세포기 배에서 배반포기까지의 발달율에서는 대조군과 크게 차이가 나지 않다가 배반포기 배의 평균 세포수와 ICM 세포 수 및 %ICM이 에너지원 첨가군에서 높아서, 후기 배 발달에 에너지원이 매우 큰 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
배양액에 단독 에너지원으로 함유되어 있는 glu-tamine은 생쥐 (Chatot 등, 1989; Gardner와 Leese, 1990), 햄스터 (Schini와 Bavister, 1988)의 세포발생중지현상을 극복하는데 도움을 준다고 하였는데, glutamine은 gluta mine transaminase를 통하여 2-oxoglutarate로 변화된 후 에너지를 생산하며, 생쥐 배는 대사 에너지로 glutamine 을 이용한다(Nasr-Esfahani 등, , 1992). 본 연구 결과에서 에너지원을 별도로 첨가하지 않은 대조군에서 사용된 배양액은 glutamine이 기본적으로 포함되어 있는데, 생쥐 2-세포기 배가 배반포기까지 발달하는데 이 에너지원을 사용한 것으로 판단된다. 그러나 에너지원 무첨가군인 대조군보다 에너지원 첨가군에서 배 발생 능력의 향상이 뚜렷하게 관찰되는 것으로 미루어 보아, 배양액에 기본적으로 포함되어 있는 glutamine에 의한 간섭 효과가 없거나 있더라도 매우 미미한 것으로 사료된다.
후속연구
결론적으로, 생쥐 2-세포기 배를 인간 난관액 내 농도로 조절된 에너지원(glucose 0.5 mM pyruvate 0.32 mM, lactate 10.5 mM; group A) 이 첨가된 배양액에서 배양하면 발생 능력을 높이는 데 도움이 될 것이다. 이 연구의 결과들은 앞으로 인간 배아의 체외 배양 조건을 향상시키는데 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
47 mNM의 pyruvate는 계속 첨가하고 상실배기 이후에는 1 mM의 glucose를 같이 첨가하는 것이 배반포기 배아의 발생률을 높이고 각각의 배반포기 배아에서는 세포수가 증가한다고 하였다. 그러나 이들의 실험에서는 10% maternal serum과 5.55 mM의 glucose를 첨가한 EBSS에 인간 난자를 2~4- 세포기까지 배양하여 2일째 이식을 하고 남은 여분의 난자를 배양하였으므로 난자가 고농도의 glucose에 노출되어 받은 영향에 대해서는 더 많은 연구가 진행되어야 할 점이다.
이 연구의 결과들은 앞으로 인간 배아의 체외 배양 조건을 향상시키는데 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 인간의 생식 기관액 내에 함유되어 있는 서로 다른 종류와 농도의 에너지원 간 상호 작용 및 최적의 첨가 또는 제거 시기가 생쥐와 사람 배아의 체외 발달에 미치는 효과에 대해서는 더 많은 연구가 필요할 것이다.
5 mM; group A) 이 첨가된 배양액에서 배양하면 발생 능력을 높이는 데 도움이 될 것이다. 이 연구의 결과들은 앞으로 인간 배아의 체외 배양 조건을 향상시키는데 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 그러나 인간의 생식 기관액 내에 함유되어 있는 서로 다른 종류와 농도의 에너지원 간 상호 작용 및 최적의 첨가 또는 제거 시기가 생쥐와 사람 배아의 체외 발달에 미치는 효과에 대해서는 더 많은 연구가 필요할 것이다.
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