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문제 정의
- 危珂는 當歸飮으로 別名하였다. 心血이 凝滯되고 안으로 風熱이 쌓이면 피부에 瘡疥가 발생하며 혹은 붓거나 소양감이 있고 膿水가 浸淫하거나 또는 피부가 發赤하여 두드러기가 생기는 것을 치료할 목적으로 立方되었다*眼, 四物湯에 瘡疥를다스리는 藥材로 구성되어 있어서 血虛, 血熱, 血燥로 因하여 오래도록 낫지 않는 皮膚瘙痒症에 사용하였다见).
- 當歸飮구와 三黃洗劑加味方의 항아토피 치료 기전을 규명하고자, NC/Nga mice를 이용하여 다양한 면역 반응을 관찰하였던 바, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- -5, CCR3 유전자 발현을 조사하였으며 귀와 등의 피부를 조직 검사하였다. 또한 當歸飮구의 항염증 효과를 규명하기 위해서 in vitro 실험에서 RAW 264.7 cell에 當歸飮구를 농도별 처리하였을 때 COX-2발현과 IL-1P, TNF-a, IL-6 등의 cytokine들을 측정하여유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 본 실험은 아토피 치료에 사용되는 DG와 9G을 이용하여 in vivo 실험으로 아토피 유발 모델인 NC/Nga mice에 대해 항알레르기 효과를 알아보고 더불어 in vitro 실험으로 RAW 264.7 세포에 DG를 농도별로 처리하였을 때 항염증 효과를 알아보기 위해 시행되었다.
가설 설정
-
3. 혈청 중 IL-4, IL-5 발현에 미치는 영향.
- A: Serum IL-4 elevation and development of dermatitis in NC/Nga mice. B: Serum IL-5 elevation and development of dermatitis in NC/Nga mice.
- A: Serum IgE elevation and development of dermatitis in NC/Nga mice. B: Serum IL-6 elevation and development of dermatitis in NC/Nga mice.
제안 방법
- 저자는 當歸飮구와 三黃洗劑加味方을 병용하여 NC/Nga mice를 이용한 in vivo 실험에서 IgE, IL-4, IL-5, IL-6, IgM, IgGl, IFN-y의 혈청 수준을 측정하였으며, 피부조직에서 IL-4, Ⅱ.-5, CCR3 유전자 발현을 조사하였으며 귀와 등의 피부를 조직 검사하였다. 또한 當歸飮구의 항염증 효과를 규명하기 위해서 in vitro 실험에서 RAW 264.
- 측정하였다. DG를 투여 8주째 NC/Nga mice를 ethyl ether로 마취한 후 심장 천자법으로 혈액을 채혈하여 혈청을 분리한 후 혈청 중 Ⅱ.-4, 5, INF% IgM, IgGl 량을 ELISA kit로 정량하였다.
- LPSQ “g/ml)를 사용하여 대식세포주인 RAW 264.7(1 xlO6 cell) 세포의 COX-2 활성을 유도한 모델에서 DG를 10, 50, lOOppm 농도로 24시간 처리하여 COX-2 발현 정도를 Western Blot을 수행하여 분석하였다. LPS 단독 처리군에 비해 DG를 처리한 실험군에서 DG 농도존적으로 COX-2 발현 정도가 억제됨을 확인하였다.
- MTT 정량방법을 이용하여 10, 50, 100, 200, 300, 500, 1000 ppm 농도의 DG를 포함된 배양액에서 L929 세포를 24시간 배양 후 세포증식률을 측정하여 대조군과 비교하였다(Fig. 15). DG 100 ppm농도에서는 세포증식률이 대조군에 비해 3%로 증가됨을 확인하였다.
- 실험 시작일부터 NC/Nga mice 실험군에 DG를 8주간 주 3회 (월, 수, 금) 경구투여(250 ㎎/㎏) 하였으며, 외용제인 SG는 매일 2회 등 부위를 충분히 적실 정도로 분무하였다. NC/Nga mice 대조군은 생리식염수를 DG와 같은 용량, 용법으로 경구 투여하였으며, 외용제 또한 생리식염수를 실험군과 같은 방법으로 도포하였다.
- NC/Nga mice의 등 부위를 제모한 뒤 피부 조직을 1 g 떼어내어 DMEM 배양액으로 수세하여 미세조각으로 잘게 썬 후 10% FB9DMEM으로 Petri-dish에서 7일간 배양하였다. 이후 배양 상층 액을 제거하고 다시 10% FBS-DMEM으로 교체하였다.
- RAW 264.7(1 xlO6 cell) 세포를 60 mm plate에서 배양한 후 LPS(1 ㎍/ml)를 처리한 후 DG를 10, 50, 100 ppm을 24시간 처리한다. 24시간 처리 후 배양액을 제거하고 세포를 RIPA buffer 에 protease inhibitors와 phosphatase inhibitorfNajVOi) 처리하고, cell scraper로 세포를 모은 후, 얼음에서 30분간 반응 후, 4℃, 12000 rpm에서 원심 분리하여, 상층 액을 따서 BCA 방법으로 단백질 정량을 한다.
- RT-PCRe RT kit romega, Madison USA) 와 PCR kit를 이용하여 실시하였다. 즉 rapid guanidium isothiocyanate 방법으로 마우스 대식세포주로부터 추출한 0.
- Mosman!^의 방법에 따라 배양한 세포주를 각각 5^103 cell/nrf이 되도록 96 well plate에 분주하여 24시간 배양 후 이들 세포를 10, 50, 100, 200, 300, 500, lOOOppm 농도의 DG가 포함된 배양액에서 24시간 배양하였다. 배양 후 배양액을 버리고 DMSO 를 100 ㎕/well씩을 넣어 5분간 실온에 방치하며 Formazan을 용해한 후 microplate Reader로 흡광도 570 run에서 측정한다.
- 18 fA Taq polymerase (5 U/“C)를첨가한 다음 최종 부피가 40 ㎕가 되도록 멸균증류수를 가하고 pre-denaturation; 95℃, 5분, denaturation; 95℃, 5분, annealing; 55℃, 1분, elongation; 72℃, 1분을 25cycle한 뒤 post-elongation 을 72℃에서 3분 동안의 조건으로 PCR을 수행하였다. 각 PCR product는 20 00씩 1.2% agarose gel에 loading하여 120 V 조건에서 20분간 전기영동을 통하여 분석하였다.
- 내복약인 DG는 7첩 분량의 약제 331.8 g에 증류수 1.5, 를가하여 열탕 추출기에서 3시간 전탕 후 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류 장치로 농축하였다. 외용제인 SG는 약제 840 g에 증류수 3 / 을 가하여 약불로 3시간 전탕한 후, 증류하여 1.
- 유발하였다. 먼저 NC/Nga mice의 등 부위를 깨끗이 제모한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 실험 4일 전 1% DNCB용액 (acetone:olive oil=3:l) 200 ㎕를 등 부위에 도포하고 실험 시작일 '부터 종료일까지 8주간 일주일에 2번 0.
- 16). 배양후 RNA를 분리한 후 이를 이용하여 cDNA를 합성하여 LPS에 의해 생성된 cytokkie의 측정하기 위해서 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 결과 IL-10은 House keeping gene인 0-actin의 양과 비교 즉정 시 DG를 10, 50, 100 ppm의 처리하였을 때 IL-10의 발현량이 LPS 에 비해 76.
- 사용되는 처방이다. 본 실험에 사용된 三黃洗劑加味 方은 三黃洗劑에 淸熱解毒의 작용이 있는 金銀花, 連翹, 馬齒竟 을 加味하였다.
- xylene 처리 후 파라핀에 조직을 담아서 24시간 동안 52 ℃ incubaterCHl 부관하고 조직을 임베딩 틀에 고정하여 파라핀이 충분히 굳은 후에 조직을 5 ㎛로 절편하여 슬라이드 글라스에 붙여서 37℃에서 24시간 동안 두어 조직이 슬라이드 글라스에 완전히 접착되도록 하였다. 슬라이드 글라스를 xylene에 담가 파라핀을 녹인 후 ethanol로재수화시켜 hematoxylin-eosin 염색을 실시하였다.
- 먼저 NC/Nga mice의 등 부위를 깨끗이 제모한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 실험 4일 전 1% DNCB용액 (acetone:olive oil=3:l) 200 ㎕를 등 부위에 도포하고 실험 시작일 '부터 종료일까지 8주간 일주일에 2번 0.2% DNCB용액 150 ㎕를 등 부위에 도포하였다. 실험 시작일부터 NC/Nga mice 실험군에 DG를 8주간 주 3회 (월, 수, 금) 경구투여(250 ㎎/㎏) 하였으며, 외용제인 SG는 매일 2회 등 부위를 충분히 적실 정도로 분무하였다.
- 2% DNCB용액 150 ㎕를 등 부위에 도포하였다. 실험 시작일부터 NC/Nga mice 실험군에 DG를 8주간 주 3회 (월, 수, 금) 경구투여(250 ㎎/㎏) 하였으며, 외용제인 SG는 매일 2회 등 부위를 충분히 적실 정도로 분무하였다. NC/Nga mice 대조군은 생리식염수를 DG와 같은 용량, 용법으로 경구 투여하였으며, 외용제 또한 생리식염수를 실험군과 같은 방법으로 도포하였다.
- 아토피 피부염은 1-chloro 2, 4-dinitrobenzene(DNCB)을 이용하여 유발하였다. 먼저 NC/Nga mice의 등 부위를 깨끗이 제모한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다.
- 염증반응의 중요한 cytokine들인 IL-lft TNF-a, IL-6의 발현 도를 분석하기 위해서 마우스 대식세포주 RAW 264.7 세포에 DG를 10, 50, lOOppm으로 LPS(0.1 μg/ml)로 자극하기 30분 전에 처리하고 20시간 배양하였다(Fig. 16). 배양후 RNA를 분리한 후 이를 이용하여 cDNA를 합성하여 LPS에 의해 생성된 cytokkie의 측정하기 위해서 RT-PCR을 수행하였다.
- 평가항목은 홍반(erythema), 가려움과 건조피부(Pruritus & Dry Skin), 부종과 혈종(Edema & excoriation), 미란(Erosion), 그리고 태선화(Lichenification)로 나누어진다. 이 각각의 항목은 없음(0), 약함(1), 중증도(2), 심함(3)으로 나누어서 채점하였다.
- 저자는 當歸飮구와 三黃洗劑加味方을 병용하여 NC/Nga mice를 이용한 in vivo 실험에서 IgE, IL-4, IL-5, IL-6, IgM, IgGl, IFN-y의 혈청 수준을 측정하였으며, 피부조직에서 IL-4, Ⅱ.-5, CCR3 유전자 발현을 조사하였으며 귀와 등의 피부를 조직 검사하였다.
- 실시하였다. 즉 rapid guanidium isothiocyanate 방법으로 마우스 대식세포주로부터 추출한 0.5 ug의 total RNA를 역전사반응액 과 혼합하여 42℃에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
- 처리농도별로 사용한다. 처리농도는 10, 50, 100, 200, 300, 500, 1000ppm로 처리하고, 처리시간은 24시간으로 실시하였다.
- 혈청내 IgE, IL-6 량은 8주, 10주, 13주, 16주에 mice의 눈에서 capillary tube를 이용하여 약 100 ㎕의 혈액을 채혈한 후 원심분리기로 혈청을 분리하여 IgE 량을 ELISA Kit로 측정하였다. DG를 투여 8주째 NC/Nga mice를 ethyl ether로 마취한 후 심장 천자법으로 혈액을 채혈하여 혈청을 분리한 후 혈청 중 Ⅱ.
대상 데이터
- 실험에 사용한 當!帚飮子(DG))와 三黃洗劑加味方(SG)의 약제는 건재약방에서 구입한 후 정선하여 사용하였고, DG 1첩 및 SG의 내용과 구성은 다음과 같다(Table 1, 2).
- 5, 를가하여 열탕 추출기에서 3시간 전탕 후 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류 장치로 농축하였다. 외용제인 SG는 약제 840 g에 증류수 3 / 을 가하여 약불로 3시간 전탕한 후, 증류하여 1.5, 로 만들어 분무기에 넣어 사용하였다.
- 웅성(雄性) 6주령의 Balb/c, NC/Nga mouse를 중앙실험동물에서 공급받아 실험당일까지 고형사료와 물을 공급하고 실온 22±2℃, 상대습도 50-65%, 조도 200 lux(8시 점등, 20시 소등)를 계속 유지하면서 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 통계학적 유의성 검증은 one-way ANOVA(Analysis of Variance) 방법을 사용하였으며, 유의수준 p<0.01의 범위 내에서 그 결과들은 평균에 대한 표준 편차로 나타낸다.
이론/모형
- NC/Nga mice의 피부염은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안 평가법을 이용하였다. 육안평가 결과는 다음의 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타낸다.
- PCRe GeneAmp PCR system 2400을 이용하여 수행하였다. 반응은 이미 합성된 3 ㎕의 cDNA를 주형으로 사용하고, 주형에 대한 primer는 0-actin, IL-4, IL-5, CCR3, IFN-y 유전자를 증폭하기 위하여 sense primer (20 pmol/㎕)와 antisense primer (20 pmol//㎕를 혼합하여 1 ㎕를 가하고, 다시 3 ㎕ 2.
성능/효과
- 본 실험에서는 LPS(1 "g/ml)를 사용하여 대식세포주인 RAW 264.7(lxl06 cell)의 COX-2 활성을 유도한 모델에서 당귀음자는 LPS 단독 처리군에 비해 DG의 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다.
- 1시 Conventional 조건에서는 8주부터 16주까지 2, 3, 3주(10, 13, 16 주) 간격으로 피부 손상정도를 측정한 결과 대조군은 10주에 4.71±0.80z 13주에 7.28±0.78로 급격한 증가를 나타내었으며, 실험종료 전 16주령은 9.40±0.83로 나타났다. 이에 반해 실험군은 10 주까지는 대조군에 비하여 40% 정도 감소한 2.
- 10). Chemokine인 CCR3 mRNA 발현은 정상군이 1(IF)Z NC/Nga mice 대조군이 1.92(IF)로 나타났고, 실험군이 0.84(IF)로 나타나 대조군에 비하여 현저히 감소하였다(Fig. 11).
- 15). DG 100 ppm농도에서는 세포증식률이 대조군에 비해 3%로 증가됨을 확인하였다. 200 ppm과 300 ppm에서는 세포생존률 대조군에 비해 7, 10%이하로 감소하였다.
- DG와 SG을 처리한 NC/Nga mice의 혈액에서 IgE 수치는 13주와 16주에서 대조군에 비하여 약 68%와 69%의 유의성 있는(p<0.01) 감소를 나타내었고(Fig. 2), 혈중 處 수치 역시 대조군에 비하여 16 주에서 64%의 유의성 있는(p<0.01) 감소를 나타냈다(Fig. 2).
- DG의 구강 투여와 SG의 분무를 8주령부터 실시하여 NC/Nga mice의 피부손상정도를 관찰한 결과, NC/Nga mice가 자연적으로 피부염으로 유발된 conventional 조건에서는 10주 이후 IgE와 피부 발진이 유발된 것을 알 수 있었다(Fig. 1시 Conventional 조건에서는 8주부터 16주까지 2, 3, 3주(10, 13, 16 주) 간격으로 피부 손상정도를 측정한 결과 대조군은 10주에 4.
- DG의 안전성을 확인한 실험으로 세포 독성 평가는 DG 100 ppm농도에서는 세포 증식률이 대조군에 비해 3%로 증가됨을확인하였다. 200 ppm과 300 ppm에서는 세포 생존률 대조군에 비해 7, 10%이하로 감소하였다.
- DG의 염증성 cytokine들의 발현도에 대한 효과(Fig. 16)는 IL-10은 DG를 10, 50, 100 ppm의 처리 시 LPS에 비해 76.6%, 54%, 51.8%로 나타나 DG의 농도 의존적으로 억제되었으며 (Table 5), TNF-a에서는 10, 50, 100 ppm의 처리 시 LFS에 비해 87.2%, 76.8%, 63.2%로 나타나 DG의 농도 의존적으로 억제되었으며(Table 6), IL-6에서도 10, 50, 100 ppm의 처리 시 LPS에 비해 79.5%, 52.8%, 50.7%로 나타나 DG의 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다(Table 7).
- LPS 단독 처리군에 비해 DG를 처리한 실험군에서 DG 농도존적으로 COX-2 발현 정도가 억제됨을 확인하였다. Fig. 17에서 같이 DG를 10 ppm, 50 ppm을 처리한 군에서 35, 50% 정도 발현 억제 효과가 나타남을 확인하였고, 100 ppm에서는 60% 정도의 COX-2 발현 억제 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 8). IFN-y mRNA 발현은 정상군이 1(IF), NC/Nga mice 대조군이 1.10(IF)로 나타났고, 실험군이 4.8(IF)로 나타나 대조군에 비하여 현저히 증가하였다(Fig. 9). IL-5 mRNA 발현은 정상군이 1(IF), NC/Nga mice 대조군이 1.
- 2%로 나타나 DG 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. IL-6은 House keeping gene인 0-actin의 양과 비교 측정 시 DG를 10, 50, 100 ppm의 처리하였을 때 IL-6의 발현량이 LPS에 비해 79.5%, 52.8%, 50.7%로 나타나 DG 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다.
- IgM 수준은 최종 16주령에서 정상군은 62.2±11.3 ng/ml, NC/Nga mice 대조군은 629.2±56.6 “g/ml로 나타난 반면, 실험군은 368.0+56.9 “g/ml로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타냈다(Fig. 5).
- 7(1 xlO6 cell) 세포의 COX-2 활성을 유도한 모델에서 DG를 10, 50, lOOppm 농도로 24시간 처리하여 COX-2 발현 정도를 Western Blot을 수행하여 분석하였다. LPS 단독 처리군에 비해 DG를 처리한 실험군에서 DG 농도존적으로 COX-2 발현 정도가 억제됨을 확인하였다. Fig.
- 9% 감소하였다. NC/Nga mice 의 혈중 IgE, IL-4, IL-5, IL-6, IgM 및 IgGl 수준은 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, IFN-y 수준은 유의성 있게 증가하였다. NC/Nga mice의 비장 무게는 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다.
- NC/Nga mice의 비장을 16주령 후에 적출하여 무게를 측정한 결과, 정상군은 0.156±0.017 g, NC/Nga mice 대조군은 0.162±0.029 g, 실험군은 0.131±0.019 g로 유의성 있는 (p<0.05) 감소를 나타냈다(Fig. 7).
- NC/Nga mice의 피부 손상 정도는 13주와 16주에 실험군 이대 조 군에 비하여 각각 50.9%, 53.9% 감소하였다. NC/Nga mice 의 혈중 IgE, IL-4, IL-5, IL-6, IgM 및 IgGl 수준은 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, IFN-y 수준은 유의성 있게 증가하였다.
- NC/Nga mice의 비장 무게는 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. NC/Nga mice의 피부 조직 배양에서 IL-4, IL-5, CCR3 유전자 발현은 실험군이 대조군에 비하여 현저히 감소하였고, IL-6 발현량은 유의성 있게 감소하였으며, IFN-y의 유전자 발현은 대조군에 비하여 증가하였다. NC/Nga mice의 귀, 등 피부 조직 변화에서는 표피와 진피의 염증 정도와 침윤된 염증 면역 세포 등은 실험군이 대조군에 비하여 현저하게감소되었다.
- 7 세포에서 항염증 효과는 COX-2 활성을 유도한 모델에서 실험군이 대조군에 비해 농도 의존적으로 억제되었다. RAW 264.7 세포에서 염증성 cytokine 발현도에 대한 효과는 IL-lft TNF-a, IL-6 유전자 발현은 실험군이 대조군에 비해 유의적으로 감소하였다 . 세포 독성평가는 L929 세포에서 lOOppm 농도에서는 세포증식률이 실험군이대 조군에 비해 3% 증가되었으며, 200ppm 농도 이상에서 세포 독성을 유발됨을 확인하였다.
- NC/Nga mice의 귀, 등 피부 조직 변화에서는 표피와 진피의 염증 정도와 침윤된 염증 면역 세포 등은 실험군이 대조군에 비하여 현저하게감소되었다. RAW 264.7 세포에서 항염증 효과는 COX-2 활성을 유도한 모델에서 실험군이 대조군에 비해 농도 의존적으로 억제되었다. RAW 264.
- 배양후 RNA를 분리한 후 이를 이용하여 cDNA를 합성하여 LPS에 의해 생성된 cytokkie의 측정하기 위해서 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 결과 IL-10은 House keeping gene인 0-actin의 양과 비교 즉정 시 DG를 10, 50, 100 ppm의 처리하였을 때 IL-10의 발현량이 LPS 에 비해 76.6%, 54%, 51.8%로 나타나 DG 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다. TNF-ae House keeping gene인 B-actin의 양과 비교 측정 시 DG를 10, 50, 100 ppm의 처리하였을 때 TNF-a 의 발현량이 LPS에 비해 87.
- 8%로 나타나 DG 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다. TNF-ae House keeping gene인 B-actin의 양과 비교 측정 시 DG를 10, 50, 100 ppm의 처리하였을 때 TNF-a 의 발현량이 LPS에 비해 87.2%, 76.8%, 63.2%로 나타나 DG 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. IL-6은 House keeping gene인 0-actin의 양과 비교 측정 시 DG를 10, 50, 100 ppm의 처리하였을 때 IL-6의 발현량이 LPS에 비해 79.
- 또한 DG와 SG 을 병용하였을 때 Thl세포에서 생산되는 IL-4, IL-5 등을 억제하며, TH2세포에서 생산되는 INF-y를 증가시켰다. 그리고 조직검사에서도 표피와 진피의 염증 정도와 침윤된 염증 면역 세포 등이 대조군에 비하여 현저하게 감소하였다. 이러한 결과로 DG와 SG의 병용이 면역질환 중의 하나인 아토피 피부염의 치료제로 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 1 pg/ml 로 나타났다. 대조군의 13주와 16주에서는 각각 735.2±27.0, 800.0+50.4 pg/ml 로 나타났고, 실험군은 각각 238.6±41.3, 287.6±25.3 pg/ml 로 나타나 모두 대조군에 비하여 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타냈다(Fig. 2B).
- -6을감소시킴으로 항염증 효과가 있음을 알 수 있다. 또한 DG와 SG 을 병용하였을 때 Thl세포에서 생산되는 IL-4, IL-5 등을 억제하며, TH2세포에서 생산되는 INF-y를 증가시켰다. 그리고 조직검사에서도 표피와 진피의 염증 정도와 침윤된 염증 면역 세포 등이 대조군에 비하여 현저하게 감소하였다.
- 먼저 NC/Nga mice에 8주부터 16주까지 2, 3, 3주(10, 13, 16 주) 간격으로 NC/Nga mice의 피부 손상정도를 측정한 결과 대조군은 10주에 4.71 ±0.80, 13주에 7.28±0.78로 급격한 증가를 나타내었으며, 실험 종료 전 16주령은 9.40±0.83로 나타났다. 이에 반해 실험군은 10주까지는 대조군과 40% 정도 감소한 2.
- 본 실험에서 IgE의 생산과 관련되는 IgM과 B세포 분화 중에 비례적으로 증가되는 치환된 면역 글로블린인 IgGl의 변화에서 모두 대조군에 비하여 유의성 있는 감소로(Fig. 5, 6), IgE 발현 결과와 부합됨으로써, DG와 SG가 Th2 세포 활성화 억제와 더불어 IgE 생산에 관련된 B세포 분화를 억제하는 작용이 있음을 알 수 있다.
- 본 실험에서 혈청 중 IFN-x 수준은 대조군에 비하여 약 1.75 배로 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타냈고(Fig. 4), dorsal skin lesion의 발현 결과에서는, IL-4 발현은 대조군에 비하여 약 1.45 배(Fig. 8) 감소, IFN-y 발현은 NC/Nga mice 대조군에 비하여 4.3배 증가(Fig. 9), IL-5는 대조군에 비하여 약 1.5배 감소(Fig. 10)하였다. 이 같은 결과는 본 시료가 TM세포에서 분비되는 IFN-y를 증가시켜 면역 반응에 관여하는 TH2세포를 억제함으로써 TN2세포에서 Thl세포로의 전환 작용을 발휘함을 알 수 있다.
- 7 세포에서 염증성 cytokine 발현도에 대한 효과는 IL-lft TNF-a, IL-6 유전자 발현은 실험군이 대조군에 비해 유의적으로 감소하였다 . 세포 독성평가는 L929 세포에서 lOOppm 농도에서는 세포증식률이 실험군이대 조군에 비해 3% 증가되었으며, 200ppm 농도 이상에서 세포 독성을 유발됨을 확인하였다.
- 실험군의 혈중 IL-4 수치는 최종 16주령에서 대조군에 비하여 54%(Fig. 3), IL-5 수치는 48%(Fig. 3)의 유의성 있는(p<0.01) 감소를 나타내었다.
- 10)하였다. 이 같은 결과는 본 시료가 TM세포에서 분비되는 IFN-y를 증가시켜 면역 반응에 관여하는 TH2세포를 억제함으로써 TN2세포에서 Thl세포로의 전환 작용을 발휘함을 알 수 있다.
- 이러한 결과로 볼 때 當歸飮구와 三黃洗劑加味方 병용이 Thl세포에서 생산 되는 IL4, IL-5, IL-6 등을 억제하며, TD2세포에서 생산되는 INF-Y를 증가시키므로Thl과 Th2의 면역반응의 불균형으로 발생하는 아토피 피부염 치료에 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 200 ppm과 300 ppm에서는 세포생존률 대조군에 비해 7, 10%이하로 감소하였다. 이러한 결과를 통하여 DG는 L929 세포에 200ppm 농도 이상에서 세포 독성을 유발함을 알 수 있었다.
- 83로 나타났다. 이에 반해 실험군은 10 주까지는 대조군에 비하여 40% 정도 감소한 2.87±0.74로 관찰되었고, 13주와 16주에는 각각 3.57±0.66와 4.33±0.73으로 나타나 대조군에 비하여 현저한 피부손상정도지표(Clinical skin severity score) 감소를 나타냈다(Fig. IB).
- 83로 나타났다. 이에 반해 실험군은 10주까지는 대조군과 40% 정도 감소한 2.87±0.74 로 관찰되었고, 13주와 16주에는 각각 3.57±066과 4.33±0.73으로 나타나 대조군에 비하여 현저한 피부손상정도지표(Clinical skin severity score) 감소를 나타냈다(Fig. IB).
- 정상 Balb/c mice의 조직에서는 표포], 진피, 그리고 기저 부선이 관찰되나, NC/Nga mice대조군에서는 표피가 전반적으로 확장되었으며, 진피의 부종이 심하고 염증세포의 침윤이 관찰되었다. 반면, 실험군은 대조군에 비하여 표피의 각화와 진피의 부종이 심하지 않고, 염증세포의 침윤도 덜 관찰되었다(Fig.
- 정상 Balb/c mice의 조직에서는 표피, 진고], 그리고 연골이 뚜렷하게 관찰되었으나, NC/Nga mice 대조군은 표피와 진피의 확장과 선세포의 비대가 관찰되었다. 실험군에서는 대조군에 비하여 표피와 진피의 두께가 다소 줄어들었고, 표피의 각질 화도 심하지 않은 것으로 관찰되었다(丘昏 13).
- 종합적으로 DG는 RAW 264.7 세포에 농도별 처리하였을 때 COX-2발현을 억제하고 염증성 cytokine인 IL-1P, TNF-a, Ⅱ.-6을감소시킴으로 항염증 효과가 있음을 알 수 있다.
- 혈청 중 IFN-y 수준은 최종 16주령 정상군에서는 13.2±2.8 pg/ml, NC/Nga mice 대조군에서 516.6±93.7 pg/ml, 실험군에서 905.8+36.0 pg /ml로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타냈다(Fig. 4).
후속연구
- 이러한 결과로 DG와 SG의 병용이 면역질환 중의 하나인 아토피 피부염의 치료제로 가능성이 있을 것으로 사료된다. 또한 향후 약물 독성 평가(in vivo) 등의 안정성에 관한 연구가 필요하리라 사료된다.
- 그리고 조직검사에서도 표피와 진피의 염증 정도와 침윤된 염증 면역 세포 등이 대조군에 비하여 현저하게 감소하였다. 이러한 결과로 DG와 SG의 병용이 면역질환 중의 하나인 아토피 피부염의 치료제로 가능성이 있을 것으로 사료된다. 또한 향후 약물 독성 평가(in vivo) 등의 안정성에 관한 연구가 필요하리라 사료된다.
- 이는 DG는 L929 세포에 200ppm 농도 이상에서 세포 독성을 유발됨을 알 수 있었다. 좀 더 안전성을 확인하기 위해서는 경구 아급성 독성, 급성 독성 등의 in vivo 실험을 수행해야 할 것으로 사료된다.
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