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문제 정의
- 최근에 왕머루포도에서분리한 vitisin A와 heyneanol A가 -amyloid에 의한 산화적 스트레스를 감소시켜 신경세포를 보호한다는 연구결과가 유일하다 15). 이에 본 연구에서는 동물모델을 활용하여 heyneanol A의 신경보호 효능이 resveratrol 보다 유의적으로 효과적임을 입증하였으므로, 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 뇌경색이 일어난 부위의 면적 (infarct area, mm2)은 computerized image analysis system 을 이용하여 즉정하였다. 뇌 허혈 손상 면적은 (A) 부종에 의하여 손상면적이 늘어난 것을 보정하기 위하여, 먼저 정상 측 대뇌반구 면적 (B) 을 측정하고 손상 측 대뇌반구 정상조직 면적 (C) 을 측정한 다음 정상 측 대뇌반구 면적에서 손상 측 대뇌반구의 정상조직 면적을 감하는 방법 (A=B-C) 으로 계산하였다. 총뇌허혈 손상 체적은 아래 식과 같이 계산하였다.
- 뇌조직 손상을 평가하기 위하여 중대뇌동맥 폐쇄 24시간 후에 뇌를 적출하여 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride (TTC, sigma T-8877)염색을 시행하였다. TTC 염색이 된 뇌절편을 10% neutral-bufferd formalin용액에 담가 고정시킨 후 각 절편의 이미지를 digital camera 를 이용하여 촬영한 후 computer 에 저장하였다.
- 5℃로 유지하였다. 약물투여는 뇌허혈 유발 2시간 후에 heyneanol A 0.1 ug/kg 을 0.4% propylene glycol 생리식염수에 녹여 재관류 전에 정맥으로 투여하였다. 양성 대조군으로는 뇌 허혈 보호작용이 보고되어 진 heyneanol A 의 전구체인 resveratr이을 같은 용량으로 투여하였다.
- 4% propylene glycol 생리식염수에 녹여 재관류 전에 정맥으로 투여하였다. 양성 대조군으로는 뇌 허혈 보호작용이 보고되어 진 heyneanol A 의 전구체인 resveratr이을 같은 용량으로 투여하였다.
- 하였다. 즉, 꼬리를 잡고 있는 동안 자세의 균형과 앞발의 굴곡성에 중점을 두어 앞발의 뒤뚱거림이 전현 없고 대칭운동에지장이 없는 것을 0으로 하고, 앞발의 굴곡운동을 하지 못하는것을 1로 하였으며, 꼬리를 잡고 있는 동안 몸의 균형을 잃고 빙글빙글 도는 것을 2로 하였으며, 앞발의 굴곡운동성이 전혀 없고밀면 쓰러지는 것을 3으로 하였으며 계속적으로 걷지 못하고 일어나지 못하는 상태를 4로 하여 5등급으로 나누었다.
- 하였다. 체중 250-270 g의 흰쥐를 enflurane (1% to 3.5% in a mixture of 70% N2O and 30% O2) 으로 마취하여 수술 판에 고정시키고 목의 중앙선을 절개한 후, 오른쪽 총경 동맥과 외경동맥을 노출시켜 분리 후, 외경동맥과 총경동맥을 결찰하고, polysiloxane (Xantoprene) 으로 코팅한 봉합사 (4-0 nylon thread [Ethicon, Johnson and Johnson]) 을 20 mm 정도 외경동맥을 통하여 삽입하여 중대뇌동맥을 폐쇄하였다. 뇌허혈은 2시간 동안 중대뇌동맥을 폐쇄하고 재관류하여 22시간 동안 유지하였다.
- 알려져있고 연구가 거의 전무한 상태였다. 최근에 in vitro 실험을 통해 heyneanol A가 산화적스트레스 저해를 통한 신경세포를 보호한다는 연구결과를 바탕으로 중대뇌동맥폐쇠를 통한 뇌 허혈 동물모델을 활용하여 실험을 하였다. 결과 heyneanol A 는 뇌의 cortex 와 striatum 모두 infarction 부위를 유의적으로 감소시켰고, 허혈이 유발된 대뇌 반구의 부종율도 효과적으로 감소시켰으며, 신경결손에서 약간의 회복을 보였다.
대상 데이터
- 실험동물은 6주령의 수컷 Spague-Dawley rat (250-270 g) 을 (주)대한바이오링크로부터 공급받아 clean cage 에 약 7일간 적응시켜 사용하였으며, 명암주기는 12시간씩 자동적으로 조절되는환경에서 사육하였다. 사육실 온도는 23±2℃ 로 유지되었고, 습도는 55±10%로 하였으며, 먹이와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.
데이터처리
- (n=10 each group). The statistically significant differences between control (Vehicle) and sample groups were calculated by the Student's t-test. * p < 0.
- 모든 실험결과는 Means ± S.E.M으로 표시하였으며 유 의성검정은 student’s T-test 를 사용하여 유의성 (*p<0.05, *p*<0.01) 을 검증하였다.
이론/모형
- TTC 염색이 된 뇌절편을 10% neutral-bufferd formalin용액에 담가 고정시킨 후 각 절편의 이미지를 digital camera 를 이용하여 촬영한 후 computer 에 저장하였다. 뇌경색이 일어난 부위의 면적 (infarct area, mm2)은 computerized image analysis system 을 이용하여 즉정하였다. 뇌 허혈 손상 면적은 (A) 부종에 의하여 손상면적이 늘어난 것을 보정하기 위하여, 먼저 정상 측 대뇌반구 면적 (B) 을 측정하고 손상 측 대뇌반구 정상조직 면적 (C) 을 측정한 다음 정상 측 대뇌반구 면적에서 손상 측 대뇌반구의 정상조직 면적을 감하는 방법 (A=B-C) 으로 계산하였다.
- 뇌허혈 동물모델을 만들기 위하여 Belayev16) 등의 방법에 의거하여 중대뇌동맥 폐쇄 (middle cerebral artery occlusion ; MCAO)수술을 하였다. 체중 250-270 g의 흰쥐를 enflurane (1% to 3.
- 신경학적인 검사는 수술후 경과한 다음 24시 간이 경과한 다음 Thiyagarajan17) 등의 방법에 따라 그 결손 정도를 5등급으로 점수화 하였다. 즉, 꼬리를 잡고 있는 동안 자세의 균형과 앞발의 굴곡성에 중점을 두어 앞발의 뒤뚱거림이 전현 없고 대칭운동에지장이 없는 것을 0으로 하고, 앞발의 굴곡운동을 하지 못하는것을 1로 하였으며, 꼬리를 잡고 있는 동안 몸의 균형을 잃고 빙글빙글 도는 것을 2로 하였으며, 앞발의 굴곡운동성이 전혀 없고밀면 쓰러지는 것을 3으로 하였으며 계속적으로 걷지 못하고 일어나지 못하는 상태를 4로 하여 5등급으로 나누었다.
성능/효과
- 1). Resveratr이과 heyneanol A를 0.1 ug/kg 정맥 투여한 군의 경우 cortex와 striatum에서 모두 infarction 부위가 유의성 있게 감소하였으며, heyneanol A 를 투여한 경우 대조군의 infarct volume 459.09 ± 21.83 mm3과 비교하여 약 33.5% 정도 감소시켜 양성 대조군 resveratrol의 18.5% 감소한 것보다도 우수한 것으로 확인되었다 (Fig. 1, 2).
- 최근에 in vitro 실험을 통해 heyneanol A가 산화적스트레스 저해를 통한 신경세포를 보호한다는 연구결과를 바탕으로 중대뇌동맥폐쇠를 통한 뇌 허혈 동물모델을 활용하여 실험을 하였다. 결과 heyneanol A 는 뇌의 cortex 와 striatum 모두 infarction 부위를 유의적으로 감소시켰고, 허혈이 유발된 대뇌 반구의 부종율도 효과적으로 감소시켰으며, 신경결손에서 약간의 회복을 보였다. Heyneanol A 의이런 효과들은 전구체인 resveratrol 보다 더욱 뛰어난 결과로 뇌 허혈 치료제로서의 가능성을 제시해준 것이다.
- 뇌허혈 유발 2 시간 후에 약물처리를 하고 중대뇌동맥 폐쇄 24시간 후에 신경학적 평가를 한 결과 Table 1에서 보는 바와 같이 허혈 24시간 경과 후 신경결손은 양성대조군인 resveratrol (1.60 ± 0.22)에서는 대조군 (1.60 ± 0.22)과의 차이를 보이지 않았으나 heyneanol A (1.44 ± 0.22)에서는 약간의 회복을 보였다.
- 뇌허혈 유발 2시간 후에 대조군으로 0.4% propylene glycol, 양성대조군으로 resveratrol, 실험군으로 heyneanol A 를 단회 투여한 후 뇌를 적출하여 TTC 염색을 한 결과, 대조군의 경우 brain 의 cortex 와 striatum 에서 정상조직과 뚜렷이 구분되는 infarction 부위가 확인되었다(Fig. 1). Resveratr이과 heyneanol A를 0.
- 또한 허혈이 유발된 대뇌 반구의 부종율을 살펴본 결과, heyneanol A 투여군만 대조군의 70.04 ± 24.76 mm3에서 30.57 ± 9.99 mm3 로 약 57% 정도 감소하여 resveratrol 보다 효과적이었다 (Fig. 3).
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