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문제 정의
- 본 연구는 상황버섯균사체를 제주산 보리에 접종 배양함으로서 상황 버섯의 효능과 더불어 사용 가능한 보건기능개선을 위한 상품에 대한 효능을 검정하고자 한다.
제안 방법
- (1) 혈청 중 Aspartate aminotransferase(AST; GOT) 활성도 측정 혈청 중 AST 측정은 자동 분석기기 (COBAS MIRA, Roche, Germany) 로 Reitman-Frankel 법을 통하여 발생하는 적갈색의 흡광도 측정하고 표준혈청에 있어서도 같은 방법으로 반응시켜 작성한 검량선으로 부터 검체 중의 AST 를 측정하였다.
- (2) 혈청 중 Alanine aminotransferase (ALT; GPT) 활성도 측정 혈청 중 ALT 측정은 자동 분석기기 (COBAS MIRA, Roche, Germany) 로 Reitman-Frankel 법을 통하여 발생하는 적갈색의 흡광도 측정하고 표준혈청에 있어서도 같은 방법으로 반응시켜 작성한 검량선으로 부터 검체 중의 ALT 를 측정하였다.
- (3) 혈청 중 Lactate Dehydrogenase (LDH) 활성도 측정 혈청 중 LDH 측정은 자동 분석기기 (COBAS MIRA, Roche, Germany) 로 LDH 가 젖산을 산화, 피루빈산을 생성하고, 조효소인 NAD는 NADH 로 환원되면서, 340 nm에서의 흡광도가 증가하는데 이 흡광도 변화속도를 측정하는 것에 의하여 LDH 의 활성 치를 구하고 표준혈청에 있어서도 같은 방법으로 반응시켜 작성한 검량선으로 부터 검체 중의 LDH 농도를 측정하였다.
- LDL-C는 이미 산출된 TC, TG, HDL-C 를 사용하여 Friedwald의 공식 (TG가 400 mg/dl 이하일 때)에 의해 간접 산출하였다.
- Triton WR-1339에 의해서 간에서 일어나는 지방대사 이상의 결과로 전반적 간기능의 저하 및 지질관련 대사의 이상이 있을 것으로 생각되어 고지혈증을 유발 후 간기능 및 지질관련 대사 측정을 위해 여러가지 지표의 변화를 관찰하였는데, 간기능관련으로 AST, ALT, LDH, ALP 를 측정하였으며, 지질대사관련으로 Phospholipid, Triglyceride, Total Cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholester이를 측정하였다.
- 개발된 상황버섯보리를 잡곡 대용으로 상복하였을 때 나타나는 기능성 중에 지질대사에 관한 효능을 검증하기위하여 상황버섯 보리 추출물을 일주일간 투여한 후, Triton WR-1339을 통하여 고지혈증을 유발시키고 AST, ALT 활성도 변화율, LDH, ALP 활성도 변화율, Phospholipid, TG 함량 변화율 및 Total Cholesterol, HDL and LDL 함량 변화율을 검사하여 본 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 개발된 상황보리 (Phellinus linteus-Barley corn) 를 잡곡 대용으로 상복하였을 때 나타나는 기능성 중에 지질대사에 관한 효능을 검증하기위하여 상황보리 추출물을 일주일간 투여한 후, Triton WR-1339(tyloxapol: Sigma T8761) 을 복강으로 40 mg/100 g 투여하고, 18시간 경과 후 채혈하여 혈청 중 AST, ALT 활성도 변화율, LDH, ALP 활성도 변화율, Phospholipid, TG 함량 변화율 및 Total Cholesterol, HDL and LDL 함량 변화율에 미치는 영향을 살펴보았다.
- 고지혈증을 유발하기 7일 전부터 실험군은 검액을 정해진 농도에 맞추어 1일 1회 경구 투여하였고, 대조군은 생리식염수를 1일 1회 경구 투여하였고, 채혈은 실험동물을 에테르로 가볍게 마취한 후, 심장천자를 통하여 전혈을 채취하였다. 채취한 전혈은 상온에 방치한 후 원심분리기 (Centra-8R, IEC, USA) 로 3.
- 본 연구에서 소량의 시료로 단시간내의 효과 검증을 위해 인위적으로 일시적인 고지혈증의 유발이 필요하여 세포의 lipase 활성을 억제하여 혈액 내 triglyceride 와 LDL 을 증가12-14)시키고, 세포내 lipas 활성을 억제에도 관여하여 세포 내 triglyceride 의 축적을 증가4)시키는 것으로 보고된 Triton WR-1339를 사용하였다. Triton WR-1339는 non-haemolytic detergent 로 triglyceride, high-molecular-weight Apo B, free & ester-bound cholesterol, phospolipid 및 fatty acid 의 혈청농도를 증가15, 16)시키고, in vivo 와 in vitro에서의 lysosomal 가lolesterol esterase 의 활성도를 감소 17, 18)시키며, 조직 내 형태변화로서 간조직내 콜레스테롤의 축적을 증가시키고, 신장내 피질의 사구체와 곡세뇨관에 콜레스테롤의 축적을 증가시킨다고 보고19, 20)되었다.
- 실험군을 5개군으로 나누어 Normal, Control , BC(Barley corn), PLBC(Phellinus linteus Barley corn)-1, PLBC(Phellinus linteus Barley corn)-2, PLBC(Phellinus linteus Barley corn)-3 으로 하고 각각 6마리를 배정하였다.
- 실험실 환경에 적응시킨 실험동물들을 고지혈 유발 16시간 전부터 절식시킨 후 Triton WR-1339(tyloxapol: Sigma T8761) 을복강으로 40 mg/100 g 투여하고, 18시간 경과 후 채혈하였다
- 이 침전을 제거한 혈청에 발생 시약을 가해 37℃로 가온하면 유리형 cholester로 되며 사lolesteroloxidase 의 작용으로 산화되어 과산화수소를 형성한다. 이 과산화수소는 Peroxidase의 작용에 의해 chlorophenol 과 4-aminoantipyrine 을 정량적으로 산화 축적시켜 적색색소를 생성하므로 505 nm 에서 흡광도를 측정하여 lipoprotein 중의아lolesterol(HDL-C) 함량을 구하였다.
- 혈청 중 ALP 측정은 자동 분석기기 (COBAS MIRA, Roche, Germany) 로 혈청중의 ALP 가 알카리 용액중에서 기질인 p-니트로 페닐 인산을 p-니트로페놀과 인산으로 유리시키는 것을 이용, p-니트로페놀(황색)의 흡광도의 증가속도를 측정하여 ALP 의 활성 치를 구하고 표준혈청에 있어서도 같은 방법으로 반응시켜 작성한 검량선으로 부터 검체 중의 ALP 농도를 측정하였다.
- 혈청 중 Phospholipid의 측정은 자동 분석기기 (COBAS MIRA, Roche, Germany) 로 효소법을 통하여 발생한 자색의 흡광도를 측정하고 표준혈청에 있어서도 같은 방법으로 반응시켜 작성한 검량선으로 부터 검체 중의 Phospholipid 농도를 측정하였다.
- 혈청 중 Total Cholesterol 측정은 자동 분석기기 (COBAS MIRA, Roche, Germany) 로 효소법을 통하여 발생한 자색의 흡광도를 측정하고 표준혈청에 있어서도 같은 방법으로 반응시켜 작성한 검량선으로 부터 검체 중의 Total Cholester이의 농도를 측정하였다.
- 혈청 중 Triglyceride 측정은 자동 분석기기 (COBAS MIRA, Roche, Germany)로 유리 Glycerol 소거법 (GPO with Glycerol blank) 을 통하여 반응물의 탁도를 광학적으로 측정하고 표준혈청에 있어서도 같은 방법으로 반응시켜 작성한 검량선으로 부터검체 중의 Triglyceride 농도를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 상황보리 (Phellinus linteus-Barley corn) 는제주도산 맥주보리에 상황을 배양한 것으로 조직검사상으로 상황의 비율이 85%정도인 것으로 하였다.
- 실험 동물은 체중 130 g내외의 Sprague Dawly계 웅성 흰쥐(대한실험동물센터, 한국)를 구입하여 고형사료(삼양 배합사료실험동물용, 삼양유지사료, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경(온도: 20±2℃, 습도: 40~60%, 명암: 12시간 light/dark cycle) 하에서 2주 적응 후 사용하였다.
- 실험에 사용한 기구로는 생화학분석기(Cobas Mira, Roche, Switzerland), 원심분리기 (IEC Centra-8R centrifuge international EQUIPMENT COMPANY Extraction apparatus 3unitx500ml USA), 감압농축기 (Rotarapor REIII BUCHI Switzerland) 등이었다.
데이터처리
- 대조군 및 비교약물을 사용한 군과의 비교로 그 효과를 알아보았으며, Student T-test 에 의해 통계처리 하였다.
성능/효과
- AST의 변화는 Normale 100.5±3.8(U/I)이며, Normal에 비하여 Contr이은 196.3±9.6(U/I) 로 유의하게 (p<0.005) 증가하였으며, Contr이에 비하여 BCe 148.3±9.3(U/I)로 현저하게 유의한 (p<0.005) 감소를 하였다. PLBC-1, PLBC-2, PLBC-3은 각각 151.
- 005) 감소를 보였다. HDL의 변화는 Contr이에 비하여 BC 은 유의한 (p<0.05) 증가를 나타내었으며, PLBC-1, PLBC-2, 현저하게 유의한(p<0.005) 증가를 보였으며, PLBC-3은 유의한 (p<0.025) 증가를 나타내었다.
- 6 (g/dl) 로 감소는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았다. PLBC-1 은 279.7±32.6(g/dl) 로 Contr이에 비하여 유의한 (p<0.025) 감소를 보였고, PLBC-2, PLBC-3은 각각 274.0±30.5(g/dl), 183.±26.3(g/dl) 로 Contr이에 비하여 현저하게 유의한 (p<0.005) 감소를 보였다.
- 05) 감소를 보였다. PLBC-1은 132.0±4.3(U/I) 로 Contr이에 비하여 유의한 (p<0.05) 감소를 보였고, PLBC-2는 140.0±2.6(U/I) 로 Control 에 비하여 감소는 하였으나 유의성은 보이지 않았으며, PLBC-3 은 130.7±1.6(U/I) 로 Contr이에 비하여 현저하게 유의한 (p<0.005) 감소를 보였다 (Table 3).
- 05) 감소를 하였다. PLBC-2는 63.7±2.7(U/I)로 Contr이에 비하여 유의한 (p<0.05) 감소를 보였고, PLBC-1과 PLBC-3은 각각 57.7±1.1(U/I), 59.3±2.4(U/I)로 Contr이에 비하여 현저하게 유의한(p<0.005) 감소를 보였다(Table 2).
- 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의혈청 중 LDH 의 변화는 Contr 이에 비하여 BC는 감소는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았고, PLBC-1, PLBC-2 와 PLBC-3는 Contr이에 비하여 유의한 감소를 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 ALP 의 변화는 Contr이에비하여 BC, PLBC-1은 유의한 감소를 보였고, PLBC-2는 Control 에 비하여 감소는 하였으나 유의성은 보이지 않았으며, PLBC-3 은 Contr이에 비하여 현저하게 유의한 감소를 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 Phospholipid 의 변화는 Contr이에 비하여 BCe 감소는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았고, PLBC-1 은 유의한 감소를 보였고, PLBC-2, PLBC-3은 각각 현저하게 유의한 감소를 보였다.
- 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 ALT 의 변화는 Contr이에 비하여 BC, PLBC-2은 유의한 감소를 보였고, PLBC-1 과 PLBC-3은 현저하게 유의한 감소를 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의혈청 중 LDH 의 변화는 Contr 이에 비하여 BC는 감소는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았고, PLBC-1, PLBC-2 와 PLBC-3는 Contr이에 비하여 유의한 감소를 보였다.
- 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 AST 의 변화는 Control 에 비하여 BC, PLBC-1, PLBC-2, PLBC-3가 현저하게 유의한 감소를 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 ALT 의 변화는 Contr이에 비하여 BC, PLBC-2은 유의한 감소를 보였고, PLBC-1 과 PLBC-3은 현저하게 유의한 감소를 보였다.
- 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 Total Cholester이의 변화는 Contr이에 비하여 BCe 유의한 감소를 나타내었으며, PLBC-1, PLBC-2, PLBC-3은 현저하게 유의한 감소를 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 HDL 의 변화는 Contr이에 비하여 BCe 유의한 증가를 나타내었으며, PLBC-1, PLBC-2, 현저하게 유의한 증가를 보였으며, PLBC-3은 유의한 증가를 나타내었다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 LDL의변화는 Contr이에 비하여 BC, PLBC-1, PLBC-2는 감소는 하였으나 유의성은 나타내지 않았고, PLBC-3은 현저하게 유의한 감소를 나타내었다.
- 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 HDL 의 변화는 Contr이에 비하여 BCe 유의한 증가를 나타내었으며, PLBC-1, PLBC-2, 현저하게 유의한 증가를 보였으며, PLBC-3은 유의한 증가를 나타내었다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 LDL의변화는 Contr이에 비하여 BC, PLBC-1, PLBC-2는 감소는 하였으나 유의성은 나타내지 않았고, PLBC-3은 현저하게 유의한 감소를 나타내었다.
- 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 ALP 의 변화는 Contr이에비하여 BC, PLBC-1은 유의한 감소를 보였고, PLBC-2는 Control 에 비하여 감소는 하였으나 유의성은 보이지 않았으며, PLBC-3 은 Contr이에 비하여 현저하게 유의한 감소를 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 Phospholipid 의 변화는 Contr이에 비하여 BCe 감소는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았고, PLBC-1 은 유의한 감소를 보였고, PLBC-2, PLBC-3은 각각 현저하게 유의한 감소를 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청중 Triglyceride 의 변화는 Contr이에 비하여 BC 은 증가는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았으며, PLBC-1은 감소는 하였으나유의성은 보이지 않았고, PLBC-2, PLBC-3은 각각 현저하게 유의한 감소를 보였다.
- 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청중 Triglyceride 의 변화는 Contr이에 비하여 BC 은 증가는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았으며, PLBC-1은 감소는 하였으나유의성은 보이지 않았고, PLBC-2, PLBC-3은 각각 현저하게 유의한 감소를 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 Total Cholester이의 변화는 Contr이에 비하여 BCe 유의한 감소를 나타내었으며, PLBC-1, PLBC-2, PLBC-3은 현저하게 유의한 감소를 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 HDL 의 변화는 Contr이에 비하여 BCe 유의한 증가를 나타내었으며, PLBC-1, PLBC-2, 현저하게 유의한 증가를 보였으며, PLBC-3은 유의한 증가를 나타내었다.
- 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 Phospholipid 의 변화는 Contr이에 비하여 BCe 감소는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았고, PLBC-1 은 유의한 감소를 보였고, PLBC-2, PLBC-3은 각각 현저하게 유의한 감소를 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청중 Triglyceride 의 변화는 Contr이에 비하여 BC 은 증가는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았으며, PLBC-1은 감소는 하였으나유의성은 보이지 않았고, PLBC-2, PLBC-3은 각각 현저하게 유의한 감소를 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 Total Cholester이의 변화는 Contr이에 비하여 BCe 유의한 감소를 나타내었으며, PLBC-1, PLBC-2, PLBC-3은 현저하게 유의한 감소를 보였다.
- 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 ALT 의 변화는 Contr이에 비하여 BC, PLBC-2은 유의한 감소를 보였고, PLBC-1 과 PLBC-3은 현저하게 유의한 감소를 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의혈청 중 LDH 의 변화는 Contr 이에 비하여 BC는 감소는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았고, PLBC-1, PLBC-2 와 PLBC-3는 Contr이에 비하여 유의한 감소를 보였다. 고지혈증을 유발시킨 흰쥐의 혈청 중 ALP 의 변화는 Contr이에비하여 BC, PLBC-1은 유의한 감소를 보였고, PLBC-2는 Control 에 비하여 감소는 하였으나 유의성은 보이지 않았으며, PLBC-3 은 Contr이에 비하여 현저하게 유의한 감소를 보였다.
- 또 LDL 의 변화는 Contr이에 비하여 BC, PLBC-1, PLBC-2 는감소는 하였으나 유의성은 나타내지 않았고, PLBC-3은 현저하게 유의한 (p<0.005) 감소를 나타내었다.
- 위의 결과에서 상황보리는 지질대사이상 지표중 Triglyceride, Total Cholesterol, HDL-cholester이에서 현저한 개선 효과를 얻었으며, LDL-cholesterol, Phospholipid에서는 PLBC-3 는 현저한 개선효과를 얻었으나 나머지는 개선효과는 있었으나 유의성은 나타나지 않았고, 간기능 지표중 AST, ALT에서는 현저한 개선효과를 얻었고, LDH, ALP는 현저하지는 않지만 유의성 있는 개선효과를 나타내었다. 고지혈유발을 위해 사용한 Triton WR-1339은 3-hydroxy-3-methyglutaryl-CoA(HMG CoA) reductase에 의한 간세포 내에서 아lolesterol 합성 증가로 야기된 plasma lipoprotein 의 증가와 같은 기전에 의한 지방축적이 나타난다는 보고21-23)와, Triton WR-1339가 세포 내 lipase 의 활성을 저해하여 triglyceride 의 축적을 증가시키며, 지방입자의 증가는 주로 콜레스테롤의 증가에 의해 주도된 것이라는 보고 가 있는데 이러한 간세포 내에서의 콜레스테롤을 비롯한 지방축적 및 혈중농도 증가는 전반적인 간기능의 저하를 유발, 간 기능지수의 증가를 유발하였을 것으로 사료되며 상황보리에 의한 간세포의 콜레스테롤을 비롯한 지방축적감소 및 혈중 농도저하를 통해서 간기능 개선에 효과를 주었을 것으로 사료된다.
- 한편 Triglyceride 의 변화는 Contr이에 비하여 BC 은 증가는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았으며, PLBC-1은 감소는 하였으나 유의성은 보이지 않았고, PLBC-2, PLBC-3은 각각 현저하게 유의한 (p<0.005) 감소를 보였다.
- 혈청 중 AST 의 변화는 Controle 비하여 BC, PLBC-1, PLBC-2, PLBC-3가 현저하게 유의한(p<0.005) 감소를 보였고, ALT 의 변화는 Controle 비하여 BC, PLBC-2 은 유의한 (p<0.05) 감소를 보였고, PLBC-1과 PLBC-3은 현저하게 유의한(p<0.005) 감소를 보였다.
- 혈청 중 LDH의 변화는 Contr이에 비하여 BC는 감소는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았고, PLBC-1, PLBC-2와 PLBC-3 는 Contr이에 비하여 각각 (p<0.05) 과 (p<0.025) 로 유의한 감소를 보였으며, ALP 의 변화는 Controle 비하여 BC, PLBC-1은 유의한 (p<0.05) 감소를 보였고, PLBC-2는 Contr이에 비하여 감소는 하였으나 유의성은 보이지 않았으며, PLBC-3은 Contr이에 비하여 현저하게 유의한 (p<0.005) 감소를 보였다.
- 혈청 중 Phospholipid 의 변화는 Contr이에 비하여 BC 은 감소는 하였으나 유의성을 나타내지는 않았고, PLBC-1은 유의한 (p<0.025) 감소를 보였고, PLBC-2, PLBC-3은 각각 현저하게 유의한 (p<0.005) 감소를 보였다.
- 혈청 중 Total Cholester이의 변화는 Control 에 비하여 BC 은 유의한 (p<0.05) 감소를 나타내었으며, PLBC-1, PLBC-2, PLBC-3은 현저하게 유의한(p<0.005) 감소를 보였다. HDL의 변화는 Contr이에 비하여 BC 은 유의한 (p<0.
후속연구
- 이상의 실험결과로 보아 상황보리는 간세포의 콜레스테롤을 비롯한 지방축적감소 및 혈중 농도저하를 통해서 간기능 개선에 유효한 것으로 사료되며, 아울러 동맥경화의 예방인자로서의 역할도 기대되는바 앞으로 이 부분의 연구도 진행되어야 할 것으로 생각된다.
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