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문제 정의
- Affymetrix Arabidopsis DNA chip 분석 결과에 의 하면, 애기장대의 22000개 유전자 중에서 469개의 유전자의 발현이 2배 이상 증가하였고 513개의 유전자의 발현은 2배 이상 감소하였다 (data not shown). 그 중에서 식물체에서만 존재하며 다양한 생물학적 또는 비생물학적 스트레스 반응에 관여하는 것으로 보고되고 있는 ERF/AP2 gene family의 하나인 AtERFll 유전자의 병 저항성 방어체계에서의 기능을 연구하였다.
- 본 연구는 Affymetrix Arabidopsis DNA chip을 이용하여 AvrRpt2 단백질에 의해서 특이적으로 전사과정이 억제 조절되는 애기장대 AIERFU 유전자를 확인하였고 기초 병 저항성 방어체계에서의 그 기능을 규명하고자 하였다.
- 본 연구팀은 AvrRpt2 단백질에 의해서 직접 또는 간접적으로 그 발현이 조절되는 유전자들을 전체 유전체적 수준에서 확인하고 병 저항성 방어체계에서의 기능을 연구하기 위해서 Affymetrix Arabidopsis DNA chip을 이용하였다. 비 병원성 유전자인 颇Rpt2를 발현하는 P.
제안 방법
- tomato DC3000 증식정도를 정량적으로 조사하기 위해서는 cfu/ml의 농도로 더욱 희석시켰다. 3-4 주 정도 된 야생종을 대조군으로, AtERFU을 대 량 발현하는 형질전환 식물체를 실험 군으로 이용하여 최소한 4개의 개별식물체로부터 4장 정도의 잎의 뒷면에 1ml 주사를 사용하여 박테리아 용액을 전체 잎의 반만 감염시키고 습도를 유지하였다. 감염 당일과 3일 후에 박테리아 증식 정도를 정량화하기 위해서 균이 감염된 4장의 잎으로부터 lcn?의 부위를 발취하고 10 mM MgCh 용액에 갈아서 순차적으로 희석을 시킨 후에 rifampicin (100/zg/ml)과 kanamycin (50“g/ml)이 들어 있는 King's B agar 배지에서 배양하였다.
- tomato DC3000를 감염시켰다. 4-5주 배양한 애기장대 야생종 Col-0를 대조군으로 사용하여서 AfERFH을 대량 발현하는 형질전환체에서 박테리아의 증식 정도를 비교하였다. 감염 후 3일간 박테리아를 증식시킨 후 각각의 감염된 부위의 조직을 채취하여 재료 및 방법에 기술한 방법에 의해서 박테리아의 증식을 정량적으로 조사한 결과, 대조군인 Col-0에 비해서 AfERFH를 대량발현하는 형질전환체에서는 박테리아의 증식이 약 100배 정도 감소하였다(Fig.
- AtERFll 유전자는 biotrophic 병원균인 Pseudomonas sy-ringae 침입에 대한 애기장대의 병 저항성 방어체계에서 positive 조절인자로서 작용할 것이라는 가설을 직접적으로 증명하기 위해서 CaMV 35S promoter에 의해서 항상 AtERF:丑 유전자를 대량 발현하는 애기장대 형질전환 식물체를 제작하였다. 먼저 애기장대의 전체 genomic DNA에서 AtERFll 유전자의 coding 영역을 PCR 방법을 이용해서 분리하고 염기서열의 정확성을 확인한 후에 식물체의 대량발현용 binary vector 인 pBTEX vector 에 Xbal/Sall의 제한 효소를 이용하여 재조합 하였다(Fig.
- 다시 새로운 hybridization 용액을 첨가한 후, "p로 label된 probe와 함께 16-20시간 반응하였다. AtERFll 특이적 인 probe는 PCR로 증폭된 DNA 단편을 주형으로 random primer DNA labeling kit (Stratagene)를 사용해 a-[32P]dATP 로 표지하였다. Hybridization 반응 후, membranee washing buffer로 15분간 3회 반복해서 씻어주었다.
- 이렇게 재조합 되어진 pBTEX-AtERFll construct는 vacuum infiltration 방법으로 애기장대 Col-0에 형질전환 시켰다. Hygromycin (20陽/ml)에 대한 저항성으로 선별된 형질전환체를 배양토에서 4-5주 정도 배양한 후에, 각각의 형질전환체로 부터 잎의 조직을 채취해서 total RNA를 추출하고 northern blot 분석을 통하여 이 유전자의 발현정도를 분석하였다. 모본으로 사용된 애기장대 Col-0 에서는 AtERFll 유전자가 거의 발현되지 않지만 pBTEX-AtERFll constructs.
- RNA를 추출하기 위해서 먼저 배양토에서 3-4주 동안 자란 애기장대 형질전환체 또는 전 처리된 식물체로부터 잎 조직을 채취하고 액체질소로 완전히 얼린 후에 유발로 분쇄 하였다. 전체 RNA를 TRIzol (Invitrogen) 용매를 사용하여 제공하는 방법에 따라서 추출하였다.
- 애기장대의 형질전환은 개화하고 있는 애기장대의 꽃봉오리 전체를 AtERFU을 대량 발현하도록 제작된 binary vector를 가지고 있는 Agrobacterium tumefaciens (GV3101) 용액에 담그고 진공을 잠시 걸었다가 풀어주는 vacuum infiltration 방법을 사용하였다[4]. To 세대 식물체에서 수확된 모든 씨앗을 hygromycin (20 /ml) 이들어있는 Gamborgzs B5 배지에서 발아시켜서 형질 전환 체를 선별하였다.
- 2% formaldehyde-agarose gel 에서 전기영동을 한 후, 모세관법에 의해서 Hybond N+ hybridization membrane (Amersham-Pharmacia Biotech, USA) 에 RNA를 전이시켰다. UV cross-linkage를 하여서 RNA를 memebrane 에 고정 시킨 후, 65 ℃ 에서 1시간가량 pre-hybridization을 하였다. 다시 새로운 hybridization 용액을 첨가한 후, "p로 label된 probe와 함께 16-20시간 반응하였다.
- syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) 현탁액을 RPS2 저항성 유전자의 기능이 결함이 된 애기장대 rps2 돌연변이체의 잎에 감염하고 6 시간 후에 전체 RNA를 분리하였다. 대조군으로는 avrRpt2 유전자만이 없는 F.
- syringae pv. tomato DC3000 ㎛次從2)를 감염함으로써 식물체로 AvrRpt2 단백질을 전이시킨 후에, 시간대 별로 AtERFll 유전자의 발현양상을 조사하였다. AvrRpt2 단백질만이 존재하는 전자의 경우와는 달리 후자의 경우는 감염균의 type Ⅲ secretion system (TTSS)에 의해서 AvrRpt2 단백질 뿐만 아니라 다른 TTSS effector들의 전이를 동반한다[5, 13, 22].
- 그 중에서 먼저 식물 호르몬인 ethylene의 신호 조절에 관여하는 ERFs (ethylene-responsive element binding factors) 전사조절 유전자 family 중에서 Bia subfamily 그룹으로 알려져 있는 AtERFll 유전자의 병 저항성 관련 기능을 규명하였다. 저항성 유전자 RFS2가 없는 경우에는 비 병원성 인자인 AvrRpt2 단백질은 기주 식물체내의 기초 병 저항성을 감소시키고 병원성 세균의 증식을 향상시켜서 병증을 증대시키는 effector로 작용한다는 기존의 연구결과와 유사하게, 저항성 유전자 RPS2가 없는 조건에서 AtERFll 유전자의 발현이 AvrRpt2 단백질의 작용에 의해서 특이적으로 감소되는 것을 확인하였다.
- 먼저 애기장대의 전체 genomic DNA에서 AtERFll 유전자의 coding 영역을 PCR 방법을 이용해서 분리하고 염기서열의 정확성을 확인한 후에 식물체의 대량발현용 binary vector 인 pBTEX vector 에 Xbal/Sall의 제한 효소를 이용하여 재조합 하였다(Fig. 3A). 이렇게 재조합 되어진 pBTEX-AtERFll construct는 vacuum infiltration 방법으로 애기장대 Col-0에 형질전환 시켰다.
- 본 연구는 Affymetrix Arabidopsis DNA chip을 이용하여 비 병원성 인자인 AvrRpt2 단백질에 의해서 특이적으로 전사 과정이 조절되는 애기장대 유전자들을 분리하고 병 저항성 방어체계와 관련한 어들 유전자들의 기능 분석을 시도하였다. 그 중에서 먼저 식물 호르몬인 ethylene의 신호 조절에 관여하는 ERFs (ethylene-responsive element binding factors) 전사조절 유전자 family 중에서 Bia subfamily 그룹으로 알려져 있는 AtERFll 유전자의 병 저항성 관련 기능을 규명하였다.
- 식물 형 질전환용 vector를 제작하기 위하여 먼저 AtERFll 의 coding 영역을 Xbal과 Sall제한효소 작용 염기서열을 가진 primer (For; TTTCTAGAATGGCACCGACAGTTAAA, Rev; AAGTCGACATCAGTTCTCAGGTGGAG) 를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편을 Xbal과 Sall 제한효소로 절단시키고 같은 제한효소로 절단된 pBTEX binary vector에 연결시켰다.
- 소독한 종자는 Gamborg's B5 (GIBCO) 배지에 파종하였다. 이틀간 4℃에서 춘화처리 후에 형광 빛에서 16시간 암주기, 8시 간의 광주기, 22℃ 의 조건으로 2주일간 배 양을 하여 자란 유식 물체를 배양용 포트에 옮겨 심고 같은 조건에서 4주일간 더 배양한 식물체를 사용하였다.
- 3B). 이형 질전환 식물체들을 이용하여 Pseudomonas 인/湖에 대한 병 저항성 실험을 하기 위해서 자가수분을 통한 homozygote line을 선별하였다.
- 전체 RNA를 TRIzol (Invitrogen) 용매를 사용하여 제공하는 방법에 따라서 추출하였다. RNA blot 분석을 위해서 10μg의 RNA를 1.
- PCR로 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편을 Xbal과 Sall 제한효소로 절단시키고 같은 제한효소로 절단된 pBTEX binary vector에 연결시켰다. 애기장대의 형질전환은 개화하고 있는 애기장대의 꽃봉오리 전체를 AtERFU을 대량 발현하도록 제작된 binary vector를 가지고 있는 Agrobacterium tumefaciens (GV3101) 용액에 담그고 진공을 잠시 걸었다가 풀어주는 vacuum infiltration 방법을 사용하였다[4].
대상 데이터
- syringae pv. tomato DC3000 현탁액을 처리한 후에 동일한 시간대에 분리한 전체 RNA를 이용하였다. Affymetrix Arabidopsis DNA chip 분석 결과에 의 하면, 애기장대의 22000개 유전자 중에서 469개의 유전자의 발현이 2배 이상 증가하였고 513개의 유전자의 발현은 2배 이상 감소하였다 (data not shown).
- 병원성 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000를 감염시켰다. 4-5주 배양한 애기장대 야생종 Col-0를 대조군으로 사용하여서 AfERFH을 대량 발현하는 형질전환체에서 박테리아의 증식 정도를 비교하였다.
- syringae pv. tomato DC3000에 대한 병 저항성을 실험하였다. AtERFll 유전자가 대량 발현하는 형질전환 된 애기장대에서는 야생종에 비해 대략 100배 이상 세균의 증식이 억제되는 강력한 기초 병저항성을 가진다는 것을 검증하였다.
- Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000는 병원균 분석에 사용되었다. P, stringae pv.
- 본 연구의 병원균 감염실험 또는 형질전환체 제작에 사용한 애기징대 (Arabidopsis thaliatia)는 야생종인 Col-0 ecotype 또는 같은 유전적 배경에 rps2 유전자만 결함이 된 돌연변이체를 사용하였다. 무균 배양을 위해서는 애기장대 종자를 0.
- 1% SDS가 포함된 50% bleach 용액에 5분간 담가서 1차 표면소독을 하고난 후 멸균수로 5회 반복하여 세척을 하였다. 소독한 종자는 Gamborg's B5 (GIBCO) 배지에 파종하였다. 이틀간 4℃에서 춘화처리 후에 형광 빛에서 16시간 암주기, 8시 간의 광주기, 22℃ 의 조건으로 2주일간 배 양을 하여 자란 유식 물체를 배양용 포트에 옮겨 심고 같은 조건에서 4주일간 더 배양한 식물체를 사용하였다.
- Labeling 된 membranee 랩에 싸서 필름 카세트에 x-ray 필름과 함께 넣어 -70℃ 정도에서 보관한 후에 현상하였다. 유전자의 발현양상은 사진의 이미지를 사용하여 측정하였다.
이론/모형
- 전체 RNA를 TRIzol (Invitrogen) 용매를 사용하여 제공하는 방법에 따라서 추출하였다. RNA blot 분석을 위해서 10μg의 RNA를 1.2% formaldehyde-agarose gel 에서 전기영동을 한 후, 모세관법에 의해서 Hybond N+ hybridization membrane (Amersham-Pharmacia Biotech, USA) 에 RNA를 전이시켰다. UV cross-linkage를 하여서 RNA를 memebrane 에 고정 시킨 후, 65 ℃ 에서 1시간가량 pre-hybridization을 하였다.
- 증폭된 DNA 단편을 Xbal과 Sall 제한효소로 절단시키고 같은 제한효소로 절단된 pBTEX binary vector에 연결시켰다. 애기장대의 형질전환은 개화하고 있는 애기장대의 꽃봉오리 전체를 AtERFU을 대량 발현하도록 제작된 binary vector를 가지고 있는 Agrobacterium tumefaciens (GV3101) 용액에 담그고 진공을 잠시 걸었다가 풀어주는 vacuum infiltration 방법을 사용하였다[4]. To 세대 식물체에서 수확된 모든 씨앗을 hygromycin (20 /ml) 이들어있는 Gamborgzs B5 배지에서 발아시켜서 형질 전환 체를 선별하였다.
- 3A). 이렇게 재조합 되어진 pBTEX-AtERFll construct는 vacuum infiltration 방법으로 애기장대 Col-0에 형질전환 시켰다. Hygromycin (20陽/ml)에 대한 저항성으로 선별된 형질전환체를 배양토에서 4-5주 정도 배양한 후에, 각각의 형질전환체로 부터 잎의 조직을 채취해서 total RNA를 추출하고 northern blot 분석을 통하여 이 유전자의 발현정도를 분석하였다.
성능/효과
- tomato DC3000 현탁액을 처리한 후에 동일한 시간대에 분리한 전체 RNA를 이용하였다. Affymetrix Arabidopsis DNA chip 분석 결과에 의 하면, 애기장대의 22000개 유전자 중에서 469개의 유전자의 발현이 2배 이상 증가하였고 513개의 유전자의 발현은 2배 이상 감소하였다 (data not shown). 그 중에서 식물체에서만 존재하며 다양한 생물학적 또는 비생물학적 스트레스 반응에 관여하는 것으로 보고되고 있는 ERF/AP2 gene family의 하나인 AtERFll 유전자의 병 저항성 방어체계에서의 기능을 연구하였다.
- tomato DC3000에 대한 병 저항성을 실험하였다. AtERFll 유전자가 대량 발현하는 형질전환 된 애기장대에서는 야생종에 비해 대략 100배 이상 세균의 증식이 억제되는 강력한 기초 병저항성을 가진다는 것을 검증하였다.
- syringae pv. tomato DC3000 (awRptZ)균을 감염시킨 식물체 모두에서 AtERFll 유전자의 발현이 시간이 지날수록 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 AtERFll 유전자는 비병원성 인자인 AvrRpt2 단백질이 RPS2 저항성 유전자가 없는 기주 식물체의 기초적 병 저항성 방어체계를 낮추기 위해서 그 발현을 조절하는 중요한 target 유전자들 중의 하나이며 식물체의 병 저항성 반응에서 중요한 positive 조절자로서 작용한다는 가능성을 제시한다.
- 4-5주 배양한 애기장대 야생종 Col-0를 대조군으로 사용하여서 AfERFH을 대량 발현하는 형질전환체에서 박테리아의 증식 정도를 비교하였다. 감염 후 3일간 박테리아를 증식시킨 후 각각의 감염된 부위의 조직을 채취하여 재료 및 방법에 기술한 방법에 의해서 박테리아의 증식을 정량적으로 조사한 결과, 대조군인 Col-0에 비해서 AfERFH를 대량발현하는 형질전환체에서는 박테리아의 증식이 약 100배 정도 감소하였다(Fig. 4). 이러한 결과는 AtERFll 유전자는 biotrophic 병원균인 Pseudomonas syringae 침입에 대한 애기장대의 병 저항성 방어체계에서 중요한 positive 조절 자로서 기능을 수행함을 증명한다.
- Tobacco ERF3, Arabidopsis AtERF3 와 AtERF4 가 GCC-box를 포함하는 유전자들의 발현을 억제하는 것을 보였다[19]. 그 중 하나인 /MERF4는 ethylene, jasmonic acid, abscisic acid 에 의해 발현이 유도될 수 있으며 *tERF4를 발현하는 형질전환 식물체에서는 ethylene과 abscisic acid에 관련되어 반응하는 유전자들이 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 AfERF4는 ethylene과 abscisic acid 반응에 있어서 negative regulators.
- 4). 이러한 결과는 AtERFll 유전자는 biotrophic 병원균인 Pseudomonas syringae 침입에 대한 애기장대의 병 저항성 방어체계에서 중요한 positive 조절 자로서 기능을 수행함을 증명한다.
- tomato DC3000 (awRptZ)균을 감염시킨 식물체 모두에서 AtERFll 유전자의 발현이 시간이 지날수록 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 AtERFll 유전자는 비병원성 인자인 AvrRpt2 단백질이 RPS2 저항성 유전자가 없는 기주 식물체의 기초적 병 저항성 방어체계를 낮추기 위해서 그 발현을 조절하는 중요한 target 유전자들 중의 하나이며 식물체의 병 저항성 반응에서 중요한 positive 조절자로서 작용한다는 가능성을 제시한다.
- 그 중에서 먼저 식물 호르몬인 ethylene의 신호 조절에 관여하는 ERFs (ethylene-responsive element binding factors) 전사조절 유전자 family 중에서 Bia subfamily 그룹으로 알려져 있는 AtERFll 유전자의 병 저항성 관련 기능을 규명하였다. 저항성 유전자 RFS2가 없는 경우에는 비 병원성 인자인 AvrRpt2 단백질은 기주 식물체내의 기초 병 저항성을 감소시키고 병원성 세균의 증식을 향상시켜서 병증을 증대시키는 effector로 작용한다는 기존의 연구결과와 유사하게, 저항성 유전자 RPS2가 없는 조건에서 AtERFll 유전자의 발현이 AvrRpt2 단백질의 작용에 의해서 특이적으로 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 AtERFll 유전자는 식물체의 병 저항성 방어기작에 있어서 positive regulator로서 작용하기 때문에 effector로 작용하는 AvrRpt? 단백질에 의해서 조절되는 것으로 추측하였다.
후속연구
- 이러한 결과들로 미루어 보아 AvrRpt2 단백질에 의해서 직.간접적으로 조절되는 유전자들의 기능 규명은 P- 에 의한 발병 원리의 분자생물학적 이해를 위한 중요한 단서를 제공할 것으로 생각된다.
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