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문제 정의
- 본 연구의 선행연구에서는 glucose 농도를 달리한 조건에서 배양한 GM10 세포의 배양액 중에 는 IGFBP-3가 가장 많이 존재하고 IGFBP-4와 -5는 미미 하게 존재하는 것으로 나타난 반면, cell lysate 중에서는 IGFBP-3 와-5가 양적으로 많이 분포하고 있었으며, IGFBP4는 아주 적은 양이 존재한다고 보고하였다. 이에 본 연구에서는 사람의 섬유아세포인 GM10에서 glucose 농도에 따른 물질대사 및 IGFBP-3 존재와 발현을 살펴보고, 실험결과를 토대로 당뇨병과 관련된 in vitro model system으로서의 활용 가능성을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- 5% SDS-PAGE로 분리하여 Immobilon-PSQ transfer membrane (Millipore)에 이동시킨 membrane을 3% BSA가 포함된 TBS로 30분 blocking시켰다. 1% BSA가 함유된 TBS에 IGFBP-3(l:l/500) 1차 antibodye 하룻밤, 2차 anti- body(l:2/000z anti-rabbit IgG alkaline phosphatase con- jugate)에서 3시간 반응시킨 후에 세척하고 color substrate solution (NBT/BCIP, Promega)으로 발색 하여 IGFBP-3분해 정도를 확인하였다.
- Cells were cultured for 24 hr in a medium containing high glucose, high glucose treated with IGF-I, high glucose treated with insulin and low glucose. Conditioned medium was incubated with intact IGFBP-3 (100 ng) for 14 hr at 3712, and the products were analyzed by Western blotting, lane 1 : Conditioned medium plus intact IGFBP-3 and no incubation, lane 2 : Conditioned medium containing high glucose (25 mM) plus intact IGFBP-3, lane 3 : Conditioned medium containing high glucose (25 mM) treated with IGF-I (100 ng/ml) plus intact IGFBP-3, lane 4 : Conditioned medium containing high glucose (25 mM) treated with insulin (100 ng/ml) plus intact IGFBP-3, lane 5 : Conditioned medium containing low glucose (5 mM) plus intact IGFBP-3.
- GM10 세포를 5 mM glucose 배지 또는 25 mM glucose 배지에 배양한 후 무혈청 배지로 교환하고 5일(120시간)동안 배양한 세포배양액을 lithum loading buffer (pH 2.2)로 정 용하여 아미노산 전용분석기 (Sykam amino acid analyzer. S433)로 분석하였다.
- GM10 세포를 5 mM glucose(저농도)와 25 mM glucose(고농도) 배지에 배양하였을 때 세포 증식에 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과, 저농도와 고농도 glucose 배지에 배양 하였을 때 세포수는 각각 45.
- GM10 세포를 저농도 glucose와 고농도 glucose 배지에서 배양하여 시간의 경과에 따른 glucose의 소비 수준를 살펴보았다(Fig. 1).그 결과 고농도 glucose에서 배양한 경우 24시 간보다 72시간 배양했을 때 10% 정도 감소하였으며, 결과에 제시하지는 않았지만 배양 120시간에는 25% 감소하였다.
- GM10 세포를 저농도와 고농도 glucose 배양 조건에서 5 일(120 hr)동안 배양하였을 때, 세포 배양액 내에 함유된 유 리아미노산 함량을 살펴보았다(Table 2). 저농도 fucose 배 양 조건에서는 배지의 총 유리아미노산 함량이 고농도 glucose 배양조건에 비해 매우 낮게 나타났다.
- 1% DEPC로 처리한 물에 녹여서 260 nm/280 nm에서 홉광도를 측정하여 정량하였다, 10 ug의 total RNA를 1% formaldehyde agarose gel에 전기영동 하고 nylon membrane (ICN BIOTRANSTM) 에 18시간 동안 transfer 하였다. Membranee 75 ℃ 에서 2시간 동안 bak- ing하고 68 ℃ 에서 1시간 동안 pre-hybridization(30 % formamide, 0.15 M NaCl, 0.12 M Na2HPO4, 7% SDS, 1 mM EDTA)한 다음 pre-hybridization 용액에 DIGdUTP가 label 된 DNA 20 μl 를 첨가한 hybridization 용액으로 68C 에서 18시간 동안 hybridization하였다. Hybridization 후/ mem- brane을 세척하고 실온에서 30분간 blocking시켰다.
- Clemmons 박사로부터 제공받았으며, probe 제조에는 PCR DIG Probe synthesis Kit (Boehringer Mannheim)를 사용하였다. MgCk를 포함하는 lx PCR reaction buffer, 200 μM dNTP mixture, PCR DIG-dUTP mixture, 2.6 U enzyme mixture (Expand™ High Fidelity), IGFBP-3 sense, antisense primer 각각 40 pmol, 0.1 U AMV-optimized Tag, IGFBP-3 DNA를 함유하는 PCR 반응 혼합물은 PCR Therm시 Cycler 480(TAKARA, Japan)를 사용하여 PCR을 행하였다. PCR 프로그램은 95℃에서 45초, 55℃에서 45초, 72℃에서 2분간 10 cycles, 95℃에서 45초, 5 5℃에서 45초, 72℃에서는 2분을 시작으로 1 cycle 돌 때마다 20초씩 늘어나도록 20 cycles을 구성하였다.
- 1 U AMV-optimized Tag, IGFBP-3 DNA를 함유하는 PCR 반응 혼합물은 PCR Therm시 Cycler 480(TAKARA, Japan)를 사용하여 PCR을 행하였다. PCR 프로그램은 95℃에서 45초, 55℃에서 45초, 72℃에서 2분간 10 cycles, 95℃에서 45초, 5 5℃에서 45초, 72℃에서는 2분을 시작으로 1 cycle 돌 때마다 20초씩 늘어나도록 20 cycles을 구성하였다. PCR 후, EtBr (10 mg/ml)을 함유하는 2% agarose gel에 전기영동하여 PCR 생성물의 band 를 확인하고 gel 에서 잘라내었다.
- PCR 후, EtBr (10 mg/ml)을 함유하는 2% agarose gel에 전기영동하여 PCR 생성물의 band 를 확인하고 gel 에서 잘라내었다. QIAGEN Gel Extraction Kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 잘라낸 gel로부터 DIG-dUTP label된 probe DNA를 추출 하였다.
- 원심분리하여 상층을 제거하고 남은 total RNA에 70% ice-cold ethanol로 2번 세척한 후 건조시켰다. 건조된 total RNA는 0.1% DEPC로 처리한 물에 녹여서 260 nm/280 nm에서 홉광도를 측정하여 정량하였다, 10 ug의 total RNA를 1% formaldehyde agarose gel에 전기영동 하고 nylon membrane (ICN BIOTRANSTM) 에 18시간 동안 transfer 하였다. Membranee 75 ℃ 에서 2시간 동안 bak- ing하고 68 ℃ 에서 1시간 동안 pre-hybridization(30 % formamide, 0.
- 6)로 실온에서 1시간 동안 blocking한 다음, TBS-T에 IGFBP-3(l:l, 500) 1차 antibody로 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 후 2차 항체 (1:15,000, anti-rabbit IgG- conjugated horseradish peroxidase)를 첨가하여 1시간 반응시키고 enhanced chemiluminescence substrate (ECL Western blotting detection reagent, Amersham, England)를사용하여 확인하였다.
- GM10 세포를 5 mM glucose 배지 또는 25 mM glucose 배지에서 배양한 후, 90%정도 자라면 무혈청 배지로 교환하여 24시간 배양하였다. 배양액 제거 후 세포를 PBS로 2회 세척하고 trypsin-EDTA 처리한 후 무혈청 배지로 세포를 회수 하였다, 회수한 세포는 Brightline hemacytometer (Hausser Scientific. USA)를 사용하여 세포수를 계산하였다.
- GM10 세포를 저농도와 고농도 gliicose 뱨.지에서 배양하여 시간의 경과에 따른 triglyceride의 수준을 살펴보았다 (Fig. 2). 그 결과 고농도 glucose에서 배양한 경우 trigly- ceride가 많이 생성되는 것으로 나타났다.
대상 데이터
- Dulbeco's Modified Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS)은 Gibco/BRL (Gaitherburg, MD, USA)에서 구입하였다. Sodium bicarbonate, antibiotics solution, bovine serum albumin (BSA), insulin, TRI-reagent, cell extraction buffer에 사용된 시약은 Sigma (St.
- Dulbeco's Modified Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), phosphate buffered saline (PBS)은 Gibco/BRL (Gaitherburg, MD, USA)에서 구입하였다. Sodium bicarbonate, antibiotics solution, bovine serum albumin (BSA), insulin, TRI-reagent, cell extraction buffer에 사용된 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA)제품을 사용하였다. 기타 세포배양용 시약 및 추출용 유기용매는 특급시약을 사용하였다.
- 기타 세포배양용 시약 및 추출용 유기용매는 특급시약을 사용하였다. 세포 배양본 실험에 사용된 GM10 세포는 5 mM(저농도) glucose DMEM 또는 25 mM(고농도) glucose DMEM에 3.7 mg/ml sodium bicarbonate, 100 U/ml penicillin, 100 U/ml strep- tomycin와 10% FBS를 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
- 실험에 사용한 IGFBP-3 DNA는 미국 North Carolina 대학교 의과대학 내분비 연구실 David R. Clemmons 박사로부터 제공받았으며, probe 제조에는 PCR DIG Probe synthesis Kit (Boehringer Mannheim)를 사용하였다. MgCk를 포함하는 lx PCR reaction buffer, 200 μM dNTP mixture, PCR DIG-dUTP mixture, 2.
데이터처리
- 본 연구의 모든 분석수치는 각 실험군의 평균±표준편차로 나타내었고, 결과는 SPSS PC 프로그램을 이용하여 통계 분석하였다. 각 실험군간의 유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 분석하였다.
- 본 연구의 모든 분석수치는 각 실험군의 평균±표준편차로 나타내었고, 결과는 SPSS PC 프로그램을 이용하여 통계 분석하였다. 각 실험군간의 유의성은 p<0.
이론/모형
- 5)로 회수하여 원심분리(12,000 rpmz 4℃z 3 min)하였다. 상층액을 회수하여 Biuret법으로 세포 내 총 단백질량을 450 nm에서 측정하였다.
성능/효과
- GM10 세포를 저농도와 고농도 glucose 배양 조건에서 총 단백질 함량 변화를 살펴본 결과, 저농도 조건에서 배양한 경우 세포 내 총단백질 함량이 증가하는 경향을 보인 반면, 고농도 조건에서는 감소하는 경향을 나타냈으나 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다(Fig. 3). Insulin 작용 부족에 의한 당뇨병에서는 조직의 포도당 이용이 낮아져서 해당계에서 얻어진 자유에너지가 부족하게 된다.
- GM10 세포를 저농도와 고농도 glucose 배양조건에 따른 IGFBP-3의 단백질 수준을 살펴본 결과, 고농도 glucose 배양 조건에서 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 4). Baxter와 Martin (2)은 혈당조절이 되 지 않은 당뇨병 환자에서 IGFBP- 3는 정 상인에 비해 감소되어 있다고 보고하였고, Rjeu와 Binoux [21]는 혈당조절이 불완전한 당뇨병 환자에서 IGFBP- 3가 감 소되어 있으며, 고혈당 상태와는 역상관관계를 관찰한 바 있으며, IGFBP-3는 임신[12]이나 수술 후 또는 당뇨병과 같은 특정 병리상태에서 부분적으로 분해되는 것으로 보고되고 있다[8].
- GM10 세포에서 저농도와 고농도 glucose 배양 조건 시 IGFBP-3 단백질 수준이 변하였으므로 IGFBP-3 mRNA의 발현정도를 살펴본 결과, 고농도 이ucose에서 IGFBP-3 mRNA 수준이 감소되는 것으로 나타났다(Fig. 5). 당뇨병을 유발시킨 쥐에 있어서 IGFBP-3 mRNA 발현이 저하된다고 보고하였으 나[10] Spoerri 등[22]은 당뇨병 환자에서 IGFBP-3 mRNA 수 준에는 거의 변화가 없다고 보고하였다.
- 1).그 결과 고농도 glucose에서 배양한 경우 24시 간보다 72시간 배양했을 때 10% 정도 감소하였으며, 결과에 제시하지는 않았지만 배양 120시간에는 25% 감소하였다. 그러나 저농도 이ucose에서 배양한 경우 72시간 배양시 35% 감소하였고, 결과에 제시하지는 않았지만 배양 120시간에서 는 84% 감소하는 것으로 나타났다.
- 2). 그 결과 고농도 glucose에서 배양한 경우 trigly- ceride가 많이 생성되는 것으로 나타났다. 이는 저농도보다 고농토 조건에서많이 흡수돠어진 이 ucose가 세포 내에서 triglyceride로 축적되며, 시간의 경과에 따른 triglyceride의 증가는 고농도 glucose 조건의 지속에.
- 6은 저농도와 고농도 glucose 배양조건과 고농도 glucose 배양 상태에서 IGF-I과 insulin을 처리한 세포 배양 액 중의 IGFBP-3 proteolysis를 살펴보았다. 그 결과, GM10 세포는 IGFBP-3 protease의 영향과 관련이 없다는 것을 확인할 수 있었다. Clemmons 등[기은 human epidermal fibro- blasts와 porcine aortic smooth muscle cells을 배양한 세포 배양액에서 IGFBP-3는 안정하며, IGFBP-3 proteolytic의 활성이 나타나지 않는다고 하여 본 연구 결과와 일치하는 것으로 나타났다.
- GM10 세포를 5 mM glucose(저농도)와 25 mM glucose(고농도) 배지에 배양하였을 때 세포 증식에 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과, 저농도와 고농도 glucose 배지에 배양 하였을 때 세포수는 각각 45.1±4.3xl04, 47.9±5x104 ceUs/cm2 으로 glucose 농도에 따른 세포 증식에는 유의적인 차이가나타나지 않았다(Table 1).
- 그 결과 고농도 glucose에서 배양한 경우 24시 간보다 72시간 배양했을 때 10% 정도 감소하였으며, 결과에 제시하지는 않았지만 배양 120시간에는 25% 감소하였다. 그러나 저농도 이ucose에서 배양한 경우 72시간 배양시 35% 감소하였고, 결과에 제시하지는 않았지만 배양 120시간에서 는 84% 감소하는 것으로 나타났다. 실제 감소되는 수준은 상대적으로 저농도 glucose군에서 많이 소모되는 것 같지만, 절대적인 값으로 보면 고농도 glucose에서 더 많은 glucose를 소비하는 것으로 나타났다.
- Baxter와 Martin (2)은 혈당조절이 되 지 않은 당뇨병 환자에서 IGFBP- 3는 정 상인에 비해 감소되어 있다고 보고하였고, Rjeu와 Binoux [21]는 혈당조절이 불완전한 당뇨병 환자에서 IGFBP- 3가 감 소되어 있으며, 고혈당 상태와는 역상관관계를 관찰한 바 있으며, IGFBP-3는 임신[12]이나 수술 후 또는 당뇨병과 같은 특정 병리상태에서 부분적으로 분해되는 것으로 보고되고 있다[8]. 또한 STZ을 투여하여 당뇨병을 유발시킨 쥐의 경우 혈장이나 간에서 IGFBP-3는 감소되어 있었으몌26], 본 연구에서 살펴본 고농도 glucose 배양 조건에서 IGFBP-3가 감소한다는 결과와 일치하였다.
- 사람의 섬유아세포인 GM10을 사용하여 glucose의 배양조건에 다른 물질대사 및 IGFBP-3 발현을 살펴본 결과, glucose 농도에 따른 glucose 소비와 triglyceride 축적 수준은 고 농도 glucose 배양 조건에서 증가한 반면, 총단백질 함량은 고농도 glucose 배양 조건에서 시간의 경과에 따라 감소하였다. 또한 고농도 glucose 배양 조건에서 5일 동안 배양한 세포 배양액내의 유리아미노산 함량은 저농도보다 고농도 glucose 배양 조건에서 높게 나타났다. IGFBP-3 단백질 수준과 mRNA 수준은 저농도 glucose 배 양 조건에서 증가하였으나, IGFBP- 3 단백질 분해효소에 따른 영향은 없었다.
- 따라서 총단백질 함량에 미치는 glucose의 영향은 triglyceride 축적에 비해 절대적이지 않는 것으로 보인다. 또한 아미노산중 cystine, glutamine, serine 등은 저농도 glucose 배양조건에서는 각각 60%, 81%, 61%로 감소하였고, 고농도 glucose 배양 조건에서도 각각 58%, 80%, 49%S- 감소를 보여, 저농도와 고농도 glucose 배 양 조건 모두에 있어서 크게 감소하는 것으로 나타났다. 이는 cystine, glutamine, serine 등의 아미노산이 에너지원으로 이용되는 것으로 보이며 반면, 대조군과 비교하였을 때 glycine,phenylalanine, threonine 등의 아미노산은 저농도와 고농도 이ucose 배양 조건에서 증가하는 것으로 나타났다.
- 사람의 섬유아세포인 GM10을 사용하여 glucose의 배양조건에 다른 물질대사 및 IGFBP-3 발현을 살펴본 결과, glucose 농도에 따른 glucose 소비와 triglyceride 축적 수준은 고 농도 glucose 배양 조건에서 증가한 반면, 총단백질 함량은 고농도 glucose 배양 조건에서 시간의 경과에 따라 감소하였다. 또한 고농도 glucose 배양 조건에서 5일 동안 배양한 세포 배양액내의 유리아미노산 함량은 저농도보다 고농도 glucose 배양 조건에서 높게 나타났다.
- 그러나 저농도 이ucose에서 배양한 경우 72시간 배양시 35% 감소하였고, 결과에 제시하지는 않았지만 배양 120시간에서 는 84% 감소하는 것으로 나타났다. 실제 감소되는 수준은 상대적으로 저농도 glucose군에서 많이 소모되는 것 같지만, 절대적인 값으로 보면 고농도 glucose에서 더 많은 glucose를 소비하는 것으로 나타났다. Kahn[13]은 STZ을 처리한 당뇨쥐에서 고혈당이 일어나는더], 이는 STZ이 췌장 랑게르한 스섬의 &-세포를 손상시킴으로써 인슐린 분비가 감소되며, 이로 인해 당질대사가 비정상화되어 당 이용은 줄어드는 대신 당신생이 증가되어 발생한다고 하였다.
- 이상의 결과로서 IGFBPs 중에서 양적으로 가장 많이 분비되고 있는 IGFBP-3의 경우, 이ucose가 단백질 수준뿐만 아니라 분자적 수준에 있어서 보여지는 IGFBP-3의 감소는 protease 활성과 관련한 것이 아니라, 분자적 수준의 전사단계에 서부터 glucose에 의해 조절되는 것으로 보여진다.
- GM10 세포를 저농도와 고농도 glucose 배양 조건에서 5 일(120 hr)동안 배양하였을 때, 세포 배양액 내에 함유된 유 리아미노산 함량을 살펴보았다(Table 2). 저농도 fucose 배 양 조건에서는 배지의 총 유리아미노산 함량이 고농도 glucose 배양조건에 비해 매우 낮게 나타났다. 이는 에너지원으로 이용할 수 있는 glucose 양이 부족한 저농도 glucose 배 양 조건에서는 고농도 glucose 배양조건보다 아미노산을 에너지원으로서 더 많이 소모하기 때문인 것으로 보여지며, 앞서 살펴본 저농도 glucose 배양 조건에서 총단백질 함량의 축적과 연관되는 것으로 여겨진다.
후속연구
- IGFBP-3 단백질 수준과 mRNA 수준은 저농도 glucose 배 양 조건에서 증가하였으나, IGFBP- 3 단백질 분해효소에 따른 영향은 없었다. 이상의 결과에서 glucose 배양조건에 따른 물질대사는 부분적으로 세포를 이용한 당뇨병 모델 실험에서 in vivo와 같은 결과를 얻지 못하였지만, IGFs와 같은 세포 성장인자에 대한 연구를 통해 세포수준의 당뇨병 모델화가 가능하다고 여겨진다.
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