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문제 정의
- 이러한 문제점을 극복하기 위해서는 지금까지 여러 연구자들[6, 10, 13, 23]에 의해 보고된 바 있는 microsatellite DNA marker중에서 제주마 집단의 특성을 가장 잘 나타내면서 국제기준에 부합되는 microsatellite DNA marker를 선택하여 제주마의 혈통등록을 위한 유전자 감정에 이용할 필요가 있다. 따라서 본 연구에서는 국내에서 사육 중인 제주마의 유전적 특성 및 계통학적 연구를 위한 기초자료를 확립하고자 제주마를 포함한 외래 품종을 대상으로 microsatellite DNA marker를 이용하여 제주마의 특이 대립유전자 분포 등 말의 유전적 다양성과 타 집단과의 유전적 관련성을 분석하였다.
제안 방법
- Microsatellite DNA형 분석을 위한 marker는 국제 panel 중에서 17개를 선정 (Table 1)하여 Bozzini 등[4]과 Dimsoski [1 이의 방법에 준하여 DNA를 GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, 미국)으로 증폭하였다. 사용된 primer는 multiplex-PCR을 수행하였으며 PCR 과정 은 다음과 같다.
- Microsatemte DNA형 분석은 PCR 산물 1 ㎕ GeneScan® 500 RIZ size standard (Applied Biosystems, 미국) 0.4 ㎕, deionized Hi-Di fornnamide (Applied Biosystems, 미국) 12 ㎕을 혼합하여 95℃에서 3분간 denaturation 시킨 후 ice 위에서 3분간 침지한 다음, 유전자형 자동분석기(ABI Prism 3100 analyzer, 미국)에 loading하여 POP4 (Applied Biosystems, 미국)상에서 15 kV로 전기영동 하였다. 그 후 Data는 GeneScan Software Ver.
- 사용된 primer는 multiplex-PCR을 수행하였으며 PCR 과정 은 다음과 같다. 먼저 95℃에서 10분간 가열하여 변성을 유도하고, 95℃에서 30초간 denaturationz 60℃에서 1분간 annealing 그리고 72℃ 에서 1분간 extention의 3단계를 총 30회 반복하였으며 마지막으로 72℃ 에서 60분간 final extention 과정을 거쳤다. 증폭된 DNA는 2.
- 먼저 95℃에서 10분간 가열하여 변성을 유도하고, 95℃에서 30초간 denaturationz 60℃에서 1분간 annealing 그리고 72℃ 에서 1분간 extention의 3단계를 총 30회 반복하였으며 마지막으로 72℃ 에서 60분간 final extention 과정을 거쳤다. 증폭된 DNA는 2.5% agarose gel로 전기영동하여 증폭산물을 확인한 후 microsatellite DNA다형 분석에 이용하였다.
대상 데이터
- 국내에서 사육중인 말 192두[제주마(Korean native horse) 84두, 제주경주마(Jeju racing horse) 37두, 몽고마(Mongolian horse) 25두, 더러브렛 ^(Thoroughbred horse) 26두, 웜브리드말(Warm blood horse) 11두, 미니츄어 말(Miniature horse) 9두]를 대상으로 하였다. 재료는 말의 경정맥으로부터 Heparin tube (Becton Dickson, USA)로 채혈한 혈액에서 Tozaki 등[23] 의 방법에 의해 추출한 genomic DNA를 사용하였다.
- 65개)보다는 낮은 수치였다. 또한 AHT5 marker에 서 대립유전자 P, ASB23 marker에서 대립유전자 Q와 R, CA425 marker에서 대립유전자 H, HMS3 marker에서 대립 유전자 S, HTG10 marker에서 대립유전자 J, LEX3 marker에 서 대립유전자 J 등 6개 marker에서 7개의 특이 대립유전자 가 관찰되었다. 관찰된 이형접합성(observed heterozygosity) 과 기대된 이형접합성(expected heterozygosity)은 각각 0.
- 대상으로 하였다. 재료는 말의 경정맥으로부터 Heparin tube (Becton Dickson, USA)로 채혈한 혈액에서 Tozaki 등[23] 의 방법에 의해 추출한 genomic DNA를 사용하였다.
이론/모형
- 4 ㎕, deionized Hi-Di fornnamide (Applied Biosystems, 미국) 12 ㎕을 혼합하여 95℃에서 3분간 denaturation 시킨 후 ice 위에서 3분간 침지한 다음, 유전자형 자동분석기(ABI Prism 3100 analyzer, 미국)에 loading하여 POP4 (Applied Biosystems, 미국)상에서 15 kV로 전기영동 하였다. 그 후 Data는 GeneScan Software Ver.3.7과 Genotyper Software Ver.3.7 (Applied Biosystems, 미국)을 이용하여 각 marker별 대립유전자의 크기(base pair)를 결정하였고, 대립유전자의 명명은 국체기준에 준하였다. 또한 microsatellite DNA다형 좌위의 대립유전자 출현빈도를 추정하고 이를 토대로 이형접합성(Het), 다형정보량(PIC), 부권부정율(PE), 그리고 집단 간의 유연관계는 Cervus Ver.
- 7 (Applied Biosystems, 미국)을 이용하여 각 marker별 대립유전자의 크기(base pair)를 결정하였고, 대립유전자의 명명은 국체기준에 준하였다. 또한 microsatellite DNA다형 좌위의 대립유전자 출현빈도를 추정하고 이를 토대로 이형접합성(Het), 다형정보량(PIC), 부권부정율(PE), 그리고 집단 간의 유연관계는 Cervus Ver.2.0 program[18] 과 Saitou와 Nei[20]의 방법에 따라 분석하였다.
- Biosystems, 미국)으로 증폭하였다. 사용된 primer는 multiplex-PCR을 수행하였으며 PCR 과정 은 다음과 같다. 먼저 95℃에서 10분간 가열하여 변성을 유도하고, 95℃에서 30초간 denaturationz 60℃에서 1분간 annealing 그리고 72℃ 에서 1분간 extention의 3단계를 총 30회 반복하였으며 마지막으로 72℃ 에서 60분간 final extention 과정을 거쳤다.
성능/효과
- 7 이상을 나타내었다. 17개 marker에 대한 전체 부권부정율(친부마 혹은 친모마 하나의 유전자형을 알고 있을 경우) 을 제주마에 적용 시 99.99%로 나타났다.
- 7 이상을 나타내었다. 17개 marker에 대한 전체 부권부정율(친부마 혹은 친모마 하나의 DNA형을 알고 있을 경우)을 제주마에 적용 시 99.99%로 나타났다.
- 2628의 유전적 거리를 보였다. Da genetic distance의 matrix를 이용하여 Neighbor Joining tree를 작성한 결과 두 개의 주요한 군집들로 구분됨을 확인할 수 있었다. 군집들 중 하나는 제주마와 몽고마로서 재래종 말 이였으며, 다른 하나의 군집에는 개량종인 더러브렛 말과 잡종마인 제주경주마로 구분되었다.
- Microsatellite marker를 이용한 제주마의 특이 대립유전자 분포 등 말의 유전적 다양성과 타 집단과의 유전적 관련성을 분석한 본 연구에서 제주마의 각 marker별 대립유전자의 수는 5-10개(평균 7.35개)로 분포하였고 제주마에서 관찰된 대립유전자의 총수는 125개가 관찰되어 평균 좌위 당 7.35개로서 몽고마의 130개(평균 7.65개)보다는 적었다. 또한 6개 품종의 말 유전자(DNA)형을 분석하여 비교한 결과 제주마에서 AHT5 marker는 대립유전자 P, ASB23 marker는 대 립유전자 Q와 R, CA425 marker는 대 립유전자 H, HMS3 marker는 대 립유전자 S, HTG10 marker는 대 립유전자 J, 그리 고 LEX3 marker는 대 립유전자 J 등 6개 marker에서 7개의 특이 대립유전자가 관찰되어 타 품종에 비해 제주마에서 marker별로 특이 유전자가 많이 나타났다.
- 65개)보다는 낮은 수치 였다. 관찰된 이형 접합성(observed heterozygosity)과 기대된 이형접합성(expected heterozygosity)은 각각 0.429-0.905 (평균 0.703)와 0.387-0.841(평균 0.702)로 나타났다. 다형 정보량(PIC)은 0.
- 23개(미니츄어말)로 분포하였고 17개 marker 전체에서는 153개의 대립유전자가 검출되었다. 관찰된 이형접합성(observed hetero- zygosity)과 기대된 이형접합성(expected heterozygosity) 은 각각 0.443-0.854(평균 0.696)와 0.647-0.867(평균 0.773)로 나타났다. 다형정보량(PIC)은 0.
- 또한 AHT5 marker에 서 대립유전자 P, ASB23 marker에서 대립유전자 Q와 R, CA425 marker에서 대립유전자 H, HMS3 marker에서 대립 유전자 S, HTG10 marker에서 대립유전자 J, LEX3 marker에 서 대립유전자 J 등 6개 marker에서 7개의 특이 대립유전자 가 관찰되었다. 관찰된 이형접합성(observed heterozygosity) 과 기대된 이형접합성(expected heterozygosity)은 각각 0.429- 0.905 (평균 0.703)와 0.387-0.841(평균 0.702)로 관찰되었고 다량정보량(PIC)은 0.354(HTG6)-0.816(LEX3)로서 평균 0.659로 나타났으며 17개 marker중 AHT4, AHT5, CA425, HMS2, HMS3, HTG10, LEX3, VHL20 marker 등이 다량정보량(PIC) 0.7 이상을 나타내었다. 17개 marker에 대한 전체 부권부정율(친부마 혹은 친모마 하나의 유전자형을 알고 있을 경우) 을 제주마에 적용 시 99.
- Da genetic distance의 matrix를 이용하여 Neighbor Joining tree를 작성한 결과 두 개의 주요한 군집들로 구분됨을 확인할 수 있었다. 군집들 중 하나는 제주마와 몽고마로서 재래종 말 이였으며, 다른 하나의 군집에는 개량종인 더러브렛 말과 잡종마인 제주경주마로 구분되었다.
- 그러나 집단간 유전자 분화정 도를 나타내는 Gst값과 각 marker별 대립유전자의 수와의 상관관계는 알 수 없었다. 그리고 AHT4외 7개 marker에서 다량정보량(PIC)이 0.7 이상으로 나타났고, 17개 marker에 대한 전체 부권부정율이 99.99%로 나타난 결과로 미루어 이들 marker를 제주마의 친자판정에 활용하면 더 좋은 감정 효율을 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 또한 품종의 보존을 위한 방향설정 시 유용하게 활용됨[1, 13]은 물론 제주마와 타 품종을 구별할 수 있는 하나의 수단으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 702)로 나타났다. 다형 정보량(PIC)은 0.354(HTG6)-0.816(LEX3)로서 평균 0.659로 나타났으며 17개 marker중 AHT4, AHT5, CA425, HMS2, HMS3, HTG10, LEX3, VHL20 marker 등이 다형정보량(PIC) 0.7 이상을 나타내었다. 17개 marker에 대한 전체 부권부정율(친부마 혹은 친모마 하나의 DNA형을 알고 있을 경우)을 제주마에 적용 시 99.
- 65개)보다는 적었다. 또한 6개 품종의 말 유전자(DNA)형을 분석하여 비교한 결과 제주마에서 AHT5 marker는 대립유전자 P, ASB23 marker는 대 립유전자 Q와 R, CA425 marker는 대 립유전자 H, HMS3 marker는 대 립유전자 S, HTG10 marker는 대 립유전자 J, 그리 고 LEX3 marker는 대 립유전자 J 등 6개 marker에서 7개의 특이 대립유전자가 관찰되어 타 품종에 비해 제주마에서 marker별로 특이 유전자가 많이 나타났다. 그러나 집단간 유전자 분화정 도를 나타내는 Gst값과 각 marker별 대립유전자의 수와의 상관관계는 알 수 없었다.
- 742로 나타났다. 또한 품종별로 분석한 결과 기대된 이형 접합성(expected heterozygosity)과 관찰된 이형접합성 (observed heterozygosity)은 각각 0.7950±0.0141(몽고마)- 0.6751±0.0378(미니츄어 말), 0.7135±0.0180(제주경주마)-0.56ZL ±0.0401(미니츄어 말)로 나타났다. 말 6개 품종을 17개 mi crosatellite marker로 분석한 결과 몽고마, 제주마, 제주 경주마 등의 순으로 높은 유전적 다양성을 보였다.
- 말 6개 품종 192두를 대상으로 17개의 microsatellite DNA marker를 이용하여 유전자(DNA/형을 분석하여 비교한 결과 제주마에서 각 marker별로 대립유전자의 수는 5-10개(평균 7.35개)로 분포하였고 제주마에서 관찰된 대립유전자는 총 125개가 관찰되 어 평균 좌위 당 7.35개로서 몽고마의 13개(평균 7.65개)보다는 낮은 수치였다. 또한 AHT5 marker에 서 대립유전자 P, ASB23 marker에서 대립유전자 Q와 R, CA425 marker에서 대립유전자 H, HMS3 marker에서 대립 유전자 S, HTG10 marker에서 대립유전자 J, LEX3 marker에 서 대립유전자 J 등 6개 marker에서 7개의 특이 대립유전자 가 관찰되었다.
- 말 6개 품종 192두를 대상으로 유전자(DNA)형을 분석한 결과는 Table 4와 5에서 보는 바와 같이 대립유전자의 수는 5(HTG7)-15(ASB17)개로 평균 9개로서 품종별로 분석하였을 때 평균 대립유전자의 수는 7.64개(몽고마)-4.23개(미니츄어말)로 분포하였고 17개 marker 전체에서는 153개의 대립유전자가 검출되었다. 관찰된 이형접합성(observed hetero- zygosity)과 기대된 이형접합성(expected heterozygosity) 은 각각 0.
- 말 6개 품종별로 분석하였을 때 평균 대립유전자의 수는 7.64개(몽고마)423개(미니츄어 말)로 분포하였고 17개 marker 전체에서는 153개의 대립유전자가 검출되었다. 품종별로 분석한 결과 기대된 이형접합성(expected heterozygosity)과 관찰된 이형 접합성 (observed heterozygosity)은 각각 0.
- 말 6개 품종을 17개 microsatellite marker로 분석한 결과 몽고마, 제주마, 제주경주마 등의 순으로 높은 유전적 다양성을 나타냈으며 제주마와 가장 가까운 유전적 유연 관계를 나타낸 집단은 몽고마로서 Da genetic distance에서 0.1517로 나타났고, 제주경주마와는 0.2628의 유전적 거리를 보였다. 이를 토대로 Neighbor Joining tree를 작성한 결과, 제주마와 몽고마인 재래종 말 집단과 개량종인 더러브렛 말과 잡종마인 제주경주마 집단으로 구분됨을 확인할 수 있었다.
- 0401(미니츄어 말)로 나타났다. 말 6개 품종을 17개 mi crosatellite marker로 분석한 결과 몽고마, 제주마, 제주 경주마 등의 순으로 높은 유전적 다양성을 보였다.
- 0401(미니츄어 말)로 나타났다. 말 6개 품종을 17개 mi crosatellite marker로 분석한 결과 몽고마, 제주마, 제주 경주마 등의 순으로 높은 유전적 다양성을 보였다.
- 분석한 결과는 Table 2에서 보는 바와 같다. 말 6개 품종의 유전자(DNA)형을 분석하여 비교한 결과 각 품종별로 특이한 대립유전자가 관찰되었다. 제주마의 경우 AHT5 marker에서 대립유전자 P, ASB23 marker에서 대립유전자 Q와 R, CA425 marker에서 대립유전자 H, HMS3 marker에서 대립유전자 S, HTG10 marker에서 대립유전자 J, LEX3 marker에서 대립유전자 J 등 모두 6개 marker에서 7개의 특이 대립유전자가 관찰되었다.
- 제주마의 경우 AHT5 marker에서 대립유전자 P, ASB23 marker에서 대립유전자 Q와 R, CA425 marker에서 대립유전자 H, HMS3 marker에서 대립유전자 S, HTG10 marker에서 대립유전자 J, LEX3 marker에서 대립유전자 J 등 모두 6개 marker에서 7개의 특이 대립유전자가 관찰되었다. 몽고마에서만 관찰된 대립유전자는 ASB2 marker에서 대 립유전자 P, HMS2 marker에서 대립유전자 R, HMS3 marker에서 대립유전자 K, HMS6 marker에서 대립유전자 Q, HMS7 marker에서 대립유전자 K, HTG6 marker에서 대 립유전자 M 등 6개 marker에서 6개의 대립유전자가 관찰되었고, 더러브렛종 말은 ASB2 marker 에서 대립유전자 B, HMS2 marker에서 대립유전자 N, HMS6 marker에서 대립유전자 I, HTG6 marker에서 대립유전자 N, LEX3 marker에서 대립유전자 Q 등 4개 marker에서 5개의 대립유전자가 관찰되었다. 웜브리드 말에서는 HMS7 marker에서 대 립유전자 P와 HTG6 marker에서 대 립유전자 L 등 2개 marker에서 2개의 대립유전자가 관찰되었으나, 제주 경주마와 미니츄어 말에서는 타 품종과 구별되는 특이적인 대립유전자가 관찰되지 않았다.
- 2628의 유전적 거리를 보였다. 이를 토대로 Neighbor Joining tree를 작성한 결과, 제주마와 몽고마인 재래종 말 집단과 개량종인 더러브렛 말과 잡종마인 제주경주마 집단으로 구분됨을 확인할 수 있었다. 이는 Cho[6]가 제주마는 몽고마와 유전적으로 가까운 거리에 있는 것으로 보고한 것과 Tozaki 등[22]이 일본 재래마는 몽고마에서 제주도를 거쳐 일본으로 유입되었을 것으로 보고한 결과와 아주 밀접한 관계가 있음을 알 수 있다.
- 이형접합성(Het), 다형정보량(PIC), 부권부정율(PE)을 분석한 결과는 Table 3에서 보는 바와 같다. 제주마에서 관찰된 대립유전자의 수는 총 125개로 나타났고, 각 marker 별로 관찰된 대립유전자의 수는 HTG4와 HTG7 marker의 5개부터 ASB17, HTG10, LEX3 marker의 10개까지 분포하였으며 marker당 평균 대립유전자의 수는 7.35개로서 몽고마에서 관찰된 대립유전자의 전체 130개(평균 7.65개)보다는 낮은 수치 였다. 관찰된 이형 접합성(observed heterozygosity)과 기대된 이형접합성(expected heterozygosity)은 각각 0.
- 64개(몽고마)423개(미니츄어 말)로 분포하였고 17개 marker 전체에서는 153개의 대립유전자가 검출되었다. 품종별로 분석한 결과 기대된 이형접합성(expected heterozygosity)과 관찰된 이형 접합성 (observed heterozygosity)은 각각 0.7950± 0.0141(몽고마)-0.6751±0.0378(미니츄어 말), 0.7135 ±0.0180(^] 주경주마)-0.5621±0.0401(미니츄어 말)로 나타났다. 말 6개 품종을 17개 microsatellite marker로 분석한 결과 몽고마, 제주마, 제주경주마 등의 순으로 높은 유전적 다양성을 보였다.
후속연구
- 99%로 나타난 결과로 미루어 이들 marker를 제주마의 친자판정에 활용하면 더 좋은 감정 효율을 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 또한 품종의 보존을 위한 방향설정 시 유용하게 활용됨[1, 13]은 물론 제주마와 타 품종을 구별할 수 있는 하나의 수단으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다. 향후 한반도 주변 국가에서 사육하고 있는 재래마를 대상으로 더 많은 품종의 시료와 marker 및 다양한 분석기법을 이용하여 연구하면 제주마의 품종 특이유전인자를 찾을 수 있을 것으로 사료된다
- 또한 품종의 보존을 위한 방향설정 시 유용하게 활용됨[1, 13]은 물론 제주마와 타 품종을 구별할 수 있는 하나의 수단으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다. 향후 한반도 주변 국가에서 사육하고 있는 재래마를 대상으로 더 많은 품종의 시료와 marker 및 다양한 분석기법을 이용하여 연구하면 제주마의 품종 특이유전인자를 찾을 수 있을 것으로 사료된다
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