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문제 정의
- 1). 따라서 이번 연구는 최근 한국의 밤나무에 피해를 주고 있는 병의 원인을 밝혀냄과 동시에 특징을 서술하며 그 원인에 따라 밤나무 품종에 따른 민감성 여부를 확립하고자 실시되었다.
제안 방법
- 접종은 지제로부터 15 cm 떨어진 지점과 그곳에서 다시 15 cm 되는 부분에 실시하였으며 서로 반대방향이 되는 지점에 접종하도록 하였다. 각 지역에서 분리된 균주들을 품종별로 세 그루씩 접종하였으며 접종후 처리는 실내검정에서 쓰인 방법을 사용 하였다. 배양은 두주 동안 야외에서 이루어졌으며 배양 후 조직 괴사부분의 길이를 기록하고 역시 ANOVA(SASS, SASS Statistics Inc.
- )로 분석하였고, 사진촬영을 실시하였다. 또한 코흐의 가설을 입증하기 위해 조직이 괴사된 부분으로부터 목편을 떼어내어 다시 분리배지에서 배양한 후 현미경 관찰을 실시하였다.
- 병원성 실내·외 검정을 위해 병원균을 일주일 동안 25℃ 에서 배양한 후 직경 5 mm cork borer를 이용하여 agar disc를 떼어내어 접종원으로 이용하였다. 실내에서는 하동 에서 분리된 1 균주, 실외에서는 하동, 합천, 영광에서 분리된 1 균주씩 사용되었다.
- 실내에서는 하동 에서 분리된 1 균주, 실외에서는 하동, 합천, 영광에서 분리된 1 균주씩 사용되었다. 비슷한 균주와 다른 역병균과의 유전자 염기서열분석을 위해서 하동과 합천에서 분리된 각각 1균주씩을 이용되었다.
- 실내실험을 위하여 8품종(이평, 이대, 유마, 대보, 박미2 호, 은산, 만적, 이취)의 밤나무 가지(30 cm(L) × 5 cm(D)) 를 하나씩 잘랐으며, 양쪽 끝부분은 파라필름(Parafilm M, PM-996)으로 감싸 수분 증발 및 오염을 예방하였다. 실험에 사용되기 전까지 증류수에 한쪽 끝부분은 침지하여 수분을 공급해 주었다.
- 여러 나라로부터 분리된 P. katsurae 균주간의 유전자 염기서열을 분석하였으며 또한 계통분류학적으로 P. katsurae 와 가장 가까운 P. heveae와의 염기서열 분석도 포함시켰다. P.
- 2B). 원활한 활착과 생장을 유도하기 위해 묘목을 두 달간 그대로 방치하여 두었다. 접종은 지제로부터 15 cm 떨어진 지점과 그곳에서 다시 15 cm 되는 부분에 실시하였으며 서로 반대방향이 되는 지점에 접종하도록 하였다.
- 1개를 수집하였다. 유전자 추출 후 시퀀스를 획득하였으며 그 외에 균주를 획득 하지 못한 균들은 역병균 웹페이지(www.phytophthoradb. org/)에서부터 시퀀스를 다운로드 받아 TreeView 소프트웨어(Roderic D. M. Page, Scotland, UK)를 통해 분석하였다 (Table 2).
- 원활한 활착과 생장을 유도하기 위해 묘목을 두 달간 그대로 방치하여 두었다. 접종은 지제로부터 15 cm 떨어진 지점과 그곳에서 다시 15 cm 되는 부분에 실시하였으며 서로 반대방향이 되는 지점에 접종하도록 하였다. 각 지역에서 분리된 균주들을 품종별로 세 그루씩 접종하였으며 접종후 처리는 실내검정에서 쓰인 방법을 사용 하였다.
- 분자생물학적 분석을 위해 Winton & Hansen(2001)의 유전자 추출방법에 따라 필요한 유전자를 획득하였으며 rDNA의 보편적인 프라이머 ITS1 과 ITS4를 이용하여 ITS 부분을 증폭시켰다. 증폭된 산물은 같은 프라이머를 사용하여 ABI 3730 시퀀서(Applied Biosystems, CA, USA)를 사용하여 유전자 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 웹페이지(http://www.
- 형태학적인 분석을 위해 광학 및 전자 현미경을 이용하여 포자의 형태 및 크기를 관찰하였다. 전자 현미경 사용을 위한 시료 준비는 β-CMA 배지위에 Nylon을 올려놓고 균을 접종하거나 혹은 배지위에 직접적으로 접종하여 자란 균사를 떼어내어 Oh & Hansen(2007)의 처리방법을 이용하였다.
대상 데이터
- 전자 현미경 사용을 위한 시료 준비는 β-CMA 배지위에 Nylon을 올려놓고 균을 접종하거나 혹은 배지위에 직접적으로 접종하여 자란 균사를 떼어내어 Oh & Hansen(2007)의 처리방법을 이용하였다. 난포자와 포자낭을 각각 50개씩 선택하여 크기를 측정하여 평균값을 획득하였다. 분자생물학적 분석을 위해 Winton & Hansen(2001)의 유전자 추출방법에 따라 필요한 유전자를 획득하였으며 rDNA의 보편적인 프라이머 ITS1 과 ITS4를 이용하여 ITS 부분을 증폭시켰다.
- 실외실험을 위해서 2007년 5월 말경 3년생인 두 품종(은기, 대보)의 밤나무 묘목을 시험포지에서 가져와 화분에 심어 나무병원건물 뒤편에 마련된 야외 실험장에 화분을 배치하였다(Fig. 2B). 원활한 활착과 생장을 유도하기 위해 묘목을 두 달간 그대로 방치하여 두었다.
- 증폭된 산물은 같은 프라이머를 사용하여 ABI 3730 시퀀서(Applied Biosystems, CA, USA)를 사용하여 유전자 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 웹페이지(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 분석되어졌다.
- 전라남도 영광을 비롯한 경상남도 합천과 하동에서 병징이 나타난 목재를 수집하였으며(Table 1), 목재의 변색부분과 건전부분이 포함된 2×2 mm의 목편을 잘라 항생제를 첨가한 CARP 배지(17 g/L cornmeal agar, 200 ㎍/mL ampicilin, 10 ㎍/mL rifampicin, 10 ㎍/mL pimaricin)에 병원균 분리를 시도하였다(Winton and Hansen 2001). 3일 동안 25℃ 에서 배양한 후, 생장된 균사를 β-CMA(17 g/L cornmeal agar, 20 ppm β-sitosterol)에 옮겨 같은 온도에서 일주일 동안 배양하여 순수 분리를 시도하였다.
데이터처리
- 2A). 그 후 조직 괴사 부분의 가로와 세로 길이를 측정하여 합산 후 ANOVA(SASS, SASS Statistics Inc.)로 분석하였고, 사진촬영을 실시하였다. 또한 코흐의 가설을 입증하기 위해 조직이 괴사된 부분으로부터 목편을 떼어내어 다시 분리배지에서 배양한 후 현미경 관찰을 실시하였다.
- 각 지역에서 분리된 균주들을 품종별로 세 그루씩 접종하였으며 접종후 처리는 실내검정에서 쓰인 방법을 사용 하였다. 배양은 두주 동안 야외에서 이루어졌으며 배양 후 조직 괴사부분의 길이를 기록하고 역시 ANOVA(SASS, SASS Statistics Inc.)로 분석하였다.
이론/모형
- 난포자와 포자낭을 각각 50개씩 선택하여 크기를 측정하여 평균값을 획득하였다. 분자생물학적 분석을 위해 Winton & Hansen(2001)의 유전자 추출방법에 따라 필요한 유전자를 획득하였으며 rDNA의 보편적인 프라이머 ITS1 과 ITS4를 이용하여 ITS 부분을 증폭시켰다. 증폭된 산물은 같은 프라이머를 사용하여 ABI 3730 시퀀서(Applied Biosystems, CA, USA)를 사용하여 유전자 염기서열을 분석하였다.
- 형태학적인 분석을 위해 광학 및 전자 현미경을 이용하여 포자의 형태 및 크기를 관찰하였다. 전자 현미경 사용을 위한 시료 준비는 β-CMA 배지위에 Nylon을 올려놓고 균을 접종하거나 혹은 배지위에 직접적으로 접종하여 자란 균사를 떼어내어 Oh & Hansen(2007)의 처리방법을 이용하였다. 난포자와 포자낭을 각각 50개씩 선택하여 크기를 측정하여 평균값을 획득하였다.
성능/효과
- P. katsurae와 P. heveae의 균주를 여러 나라에서 획득하여 분석한 염기서열과 역병균 웹페이지에서 획득한 염기서열을 비교·분석한 결과, 버지니아에서 분양받은 일본 균주와 뉴질랜드에서 분양받은 미동정된 역병균이 한국에서 분리된 균들과 유전적으로 100% 일치하는 것으로 나타났다. 그러나 나머지 P.
- rDNA의 ITS를 프라이머를 이용하여 특정부위의 유전자를 증폭시킨 결과 ITS1과 ITS4에 의해 각각 809 bp와843 bp의 산물이 얻어졌으며, 염기서열을 분석하였을 때 P. katsurae(AF266771)와 세 개의 염기가 달랐으며 이는 99%의 상동성을 보여주었다. 세 지역에서 분리된 균주는 서로 100% 일치하는 것으로 확인되어 형태학적·분자생물학적 결과를 바탕으로 한국의 밤나무에서 분리된 병원균은 P.
- 분리된 모든 균들이 배지상에서의 균사생장 형태와 모양은 같게 관찰되었다. β-CMA에서 순수 배양된 균들을 광학 현미경을 사용하여 관찰한 결과, 균사의 모양은 불규칙하게 짧은 가지를 형성하였으며 격막은 나타나지 않았다. 또한 매우 많은 난포자가 형성되었다(Fig.
- 외관상으로 관찰하였을 때 은기와 대보 품종은 각각 89%, 44%가 잎이 아래를 향해 있으면서 시들어 말랐다. 그러나 수피를 벗겨 보았을 때 은기 품종은 뚜렷한 병징이 있는 부분이 있는 것이 아니라 묘목전체가 고사된 것이 44%였다. 반면 대보 품종은 뚜렷한 병징이 나타나 설사 잎이 시들어 말라 있었더라도 묘목은 살아 있는 것으로 나타났다.
- 그러나 대조구보다는 괴사부분의 색깔과 크기가 달랐다. 또한 대조구에 비교할 때 접종된 품종들의 조직괴사 길이가 통계학적으로 다르다는 것을 확인되었다(Fig. 4). 조직이 괴사된 부분에서 목편조각을 떼어내어 역병균 선택배지에서 분리를 시도한 결과 처음 접종한 병원균과 같은 균이 분리되어 코흐의 가설을 완성하였다.
- 조직이 괴사된 부분에서 목편조각을 떼어내어 역병균 선택배지에서 분리를 시도한 결과 처음 접종한 병원균과 같은 균이 분리되어 코흐의 가설을 완성하였다. 또한 저항성과 민감성을 보이는 품종을 각각 선택하여 전자현미경으로 관찰한 결과, 민감성을 보이는 품종에서는 변재부의 도관 내에 많은 균사들이 생장하고 있었으며 그에 반해 저항성인 품종 에서는 균사생장이 관찰되지 않았으며 타일로스가 발견되었다. 역병균들이 주로 형성층을 침입하는 것으로 알려져 있었지만 최근에 변재까지 침입한다는 것이 입증되었고 저항성인 품종에서는 저항성물질이 발견된다는 사실들(Oh & Hansen, 2007; Parke et al.
- 그러나 수피를 벗겨 보았을 때 은기 품종은 뚜렷한 병징이 있는 부분이 있는 것이 아니라 묘목전체가 고사된 것이 44%였다. 반면 대보 품종은 뚜렷한 병징이 나타나 설사 잎이 시들어 말라 있었더라도 묘목은 살아 있는 것으로 나타났다. 실내·외 검정실험을 통하여 밤나무의 품종들이 각각 저항성과 민감성인 것으로 나누어지는 것을 알 수 있었으며 실험에 사용되었던 대부분의 품종들이 P.
- katsurae(AF266771)와 세 개의 염기가 달랐으며 이는 99%의 상동성을 보여주었다. 세 지역에서 분리된 균주는 서로 100% 일치하는 것으로 확인되어 형태학적·분자생물학적 결과를 바탕으로 한국의 밤나무에서 분리된 병원균은 P. katsurae로 것으로 결론지어졌다.
- 세 지역의 11 그루에서 채집한 목편 시료들로부터 선택 배지를 이용하여 분리한 결과, 11개의 균이 분리 되었으며 분리 비율은 100%이였고 각 지역별로는 85%로 조직으로 부터의 병원균 분리는 비교적 용이하였다(Fig. 3A). 분리된 모든 균들이 배지상에서의 균사생장 형태와 모양은 같게 관찰되었다.
- 반면 대보 품종은 뚜렷한 병징이 나타나 설사 잎이 시들어 말라 있었더라도 묘목은 살아 있는 것으로 나타났다. 실내·외 검정실험을 통하여 밤나무의 품종들이 각각 저항성과 민감성인 것으로 나누어지는 것을 알 수 있었으며 실험에 사용되었던 대부분의 품종들이 P. katsurae에 민감성을 나타내는 것으로 보아 앞으로 밤나무 농가에 크게 영향을 미칠 것으로 사료된다.
- 실외에서 대보와 은기 품종을 세 개의 분리균들로 접종 하여 배양한 결과, 세 균주 간에 조직괴사의 길이에 있어서는 차이가 있지 않은 것으로 나타났다. 외관상으로 관찰하였을 때 은기와 대보 품종은 각각 89%, 44%가 잎이 아래를 향해 있으면서 시들어 말랐다.
- 여덟 품종을 병원균을 접종한 후 관찰한 결과, 수피 위로 잉크색의 액이 흘러나와 있었다. 그 수피를 멸균된 칼로 벗겨 보았을 때 대조구에 비해 병징 즉 갈변된 조직괴사를 관찰할 수 있었다.
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