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문제 정의
- (24, 25). 이에 활성산소 중 하나이며, 최근 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 억제 효과를 알아보았다. RAW 264.
제안 방법
- 배양이 끝난 세포로부터의 total RNA 추출은 TRI-reagent(MRC) 를 이용하였으며, RNase-free한 조건하에서 이루어졌다. 1 μg의 total RNA를 oligo(dT)is primer, dNTP(0.5 pM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 M-MuLV reverse tran- scriptase(2U)로 70℃에서 5 min, 37℃에서 5 min, 37℃에서 60 min, 그리고 70℃에서 10 min heating시킴으로써 반응을 중지 시켰다.
- 14). 10 mM SNP 용액 200 nL에 시료를 농도별 (15.63, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000 ug/mL)로 첨가하고 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 반응액과 동일한 양의 Griess시약[2.
- 1% Tween 20) 용액 에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. COX-2의 발현 양을 측정하기 위해 1차 항체로서 anti-goat COX-2(BD biosciences)를 TBST 용액에서 희석(l:1000)하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TBST로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP(horse radish peroxidase)7|* 결합된 anti-mouse IgG와 anti-goat IgG(Amersham Co.
- Macrophage RAW 264.7 세포에서 염증성 prostaglandin E2(PGE2) 억제효과를 ELISA kit를 이용하여 정량하였다. RAW 264.
- RAW 264.7 세포에 LPS(1 pg/mL)를 사용하여 iNOS의생성을 유도한 후 청동풍뎅이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 iNOS 생성에 대한 억제 정도를 RT-PCR를 통해 알아보았다. 그 결과 RT-PCR에 의한 유전자 발현은 처리 농도가 증가할수록 iNOS의 유전자 발현이 강하게 억제되었다(Fig.
- 5 mM NBT를 첨가하여 반응시 켰다. Xanthine oxidase 억 제 및 superoxide 소거활성은 각각 생성된 uric acid와 superoxide 의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도 (ICG로 표시하였으며, 각 시료는 3회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
- 중 청동풍뎅 이a/bop汀。sa)의 추출물을 이용하여 항산화능을 측정 비교하고 항염증효과 등의 생리활성을 조사하였다.
- LDH(lactate dehydrogenase) 활성을 non-radioactive cytotoxicity assay kit(Promega)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심분리하여 얻은 배 양 배지 50 pL와 reconstituted substrate mix를 50 pL를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 11L의 stop solution을 넣어 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
- 2-B). 그러나 LPS가 첨가되지 않은 처리구(1, 000 μg/mL)에서도 세포독성 이 다소 나타남으로써 다음의 항염증활성 등의 세포 생리활성 실험은 500 tig/mL 이하의 농도에서 실시하였다.
- 배양이 끝난 후, 세포를 2~3회 PBS (phosphate buffered saline) 로세 척 후 300 uL의 lysis buffer를 첨가, 30분~1시간 동안 lysis시킨 후 원심분리(15,000 rpm, 15 min)하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 BSA(bovine serum albu- min)를 표준화하여 Bio-Rad Protein assay kit를 사용하여 정 량하였다. 30 曲의 lysate를 8% mini gel SDS-PAGE (poly acrylamide gel electrophoresis)로 변성 분리하여, 이를 PVDF membrane(BIO-RAD)에 200 mA로 2시간 동안 transfer하였다.
- Superoxide의 양은 nitroblue tetrazolium(NBT) 환원방법에 의해 측정하였다 (11, 12). 반응액으로는 각 농도별 시료(15.63, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000 μg/mL) 와 0.5 mM xanthine과 1 mM EDTA 를 200 mM phosphate buffer(pH 7.5) 100 11L에서 준비하였고 50 mU/mL xanthine oxidase® 첨가하여 uric acid의 생성을 유도하였다. Superoxide 소거활성은 위 반응액에 0.
- 5, 125, 250, 500, 1000 ug/mL)로 첨가하고 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 반응액과 동일한 양의 Griess시약[2.5%(v/v) phosphoric acid에서 l%(w/v) sulfanilamide와 0.1%(w/v) naphylethylenedi- amine]을 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 반웅시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염(nitrite)의 양으로 NO 소거활성을 산출하였다.
- 따라서 손상을 입은 세포가 분비하는 LDH activity를 측정하는 간편하고 간단한 colorimetric assay 방법이다. 본 실험에서는 LDH cytotoxicity detection kit를 사용하여 492 nm에서 ac- tivity를 측정하였다. RAW 264.
- 5xl05 cells/mL)를 DMEM 배지를 이용하여 24 well plate에 접종하고, 시험물질과 LPS(1 pg/ mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양을 Griess시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO「의 형태로 측정하였다. 세포배양 상층액 100 pL와 Griess시약[l%(w/v) sulfanilamide, 0.
- 1%(w/v) naphylethylenedi- amine]을 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 반웅시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염(nitrite)의 양으로 NO 소거활성을 산출하였다. NO 소거활성은 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도(ICG로 표시하였다.
- 전체를 25 hL로 맞춘 다음 Perkin-Elmer Thermal Cyclei를이용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR cyclee 94℃/45초, 55~60℃/45초, 72℃/60초, 30회이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.5% agarose g이에서 전기영동을 실시하고 ethidium bromide로 염색하여 특정 band를 확인하였다. 각 primer의 염기서열은 다음과 같다.
- 질소산화물(nitric oxide: NO)은 활성종으로서 세포독성이 강하며 다량의 NO 가 생성되면 nitrosation, nitration과 같은 간접적 효과 및 산화 반응을 야기하여 유해한 효과를 나타내게 된다. 이에 청동 풍뎅이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 NO 생성저해 활성을 NO를 생성하는 물질인 sodium nitroprusside(SNP) 를 사용하여 아질산염 (nitrite)의 양으로 NO 소거활성을 측정하였다. 청동풍뎅 이 성충과 3령 유충 에 탄올 추출물의 NO 생성저해활성 역시 그다지 높게 나타나지 않았으나, xan- thine/xanthine oxidase system에 의한 항산화 즉정 결과와 마찬가지로 고농도로 갈수록 농도 의존적으로 다소나마 NO 생성저해활성이 높아짐을 확인할 수 있었다(Fig.
- 5x IO。cells/mL로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 5% CO2 항온기에서 18시간 전 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 10배 농도(1 mg/mL)로 조제된 시험물질 50 11L와 450 虬의 LPS 최종농도(1 pg/mL)를함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 전배양과 동일 조건에서 배 양하였다. 24시간 후 prostaglandin E?(PGE2)를 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min) 하여상층액을 얻었다.
- 자연적으로 nitric oxide(NO)를 생성하는 물질인 sodium nitroprusside(SNP)를 사용하여 시료의 NO 소거활성을 검색하였다(13, 14). 10 mM SNP 용액 200 nL에 시료를 농도별 (15.
- 1% Triton X-100), 250 μM dNTP, 25 mM MgCb, 1 unit Taq polymerase(PromegaX 섞고 distilled waters. 전체를 25 hL로 맞춘 다음 Perkin-Elmer Thermal Cyclei를이용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR cyclee 94℃/45초, 55~60℃/45초, 72℃/60초, 30회이며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.
- 39 胞/mL로 나타났다(Table 1). 청동 풍뎅이 에탄올 추출물들의 xanthine oxidase 저해활성과 superoxide radical 소거활성을 xanthine/xanthine oxidase system에 의해 측정하였다. 청동풍뎅 이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 xanthine oxidase 저해활성은 그다지 높게 나타나지 않았지만 각 추출물의 농도가 높아질수록 xanthine oxidase에 대한 저해효과도 높아졌으며 (Fig.
대상 데이터
- 7 세포를 KCLB (Korean Cell Line Bank)로부터 분양 받아 100 units/mL penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)°1 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃ 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3~4일에 한번씩 계대배양을 시행하였다. Lipopolysaccharide(LPS, E. coli serotype O111:B4)를 Sigma로부터 구입하여 사용하였다.
- Murine macrophage cell line RAW 264.7 세포를 KCLB (Korean Cell Line Bank)로부터 분양 받아 100 units/mL penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)°1 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃ 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3~4일에 한번씩 계대배양을 시행하였다. Lipopolysaccharide(LPS, E.
- Xanthine/xanthine oxidase에 의한 uric acid 생 성은 290 nm에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였고, 대조군으로는 allopurinol (Sigma)을 사용하였다. Superoxide의 양은 nitroblue tetrazolium(NBT) 환원방법에 의해 측정하였다 (11, 12).
- 실험재료는 민간약제로 사용해 왔다고 보고된 풍뎅이류 중 청동풍뎅이aZbopilosa)의 성충(imagcO과 3령 유충(굼벵 이, larva)을 동결 건조시 킨 후 마쇄 기로 갈아 각각의 미세말 시료 성충 28 g과 유충 37 g을 각각 80% 에탄올 500 mL에 침적하고 초음파를 이용하여 1시간씩 3회 추출하였으며, 그 후 상층액을 회수하여 감압 농축하여 성충 추출물 4.08 g, 유충 추출물 4.72 g을 수득하여 사용하였다.
데이터처리
- 그룹 간의 유의적인 통계차를 분석하기 위하여 p<0.05의 유의수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였다.
- 실험결과는 SAS Program(statistical analysis system) 을 이용하여 분석하였고, 평균치와 표준편차로 나타냈다. 그룹 간의 유의적인 통계차를 분석하기 위하여 p<0.
이론/모형
- albopilosa for 24 hr. COX-2 protein level was determined using immunoblotting method.
- NO production was determined by ELISA method. Cell viability was determined using LDH method. Data represent the mean±SD of triplicate experiments.
- albopilosa. NO production was determined by ELISA method. Cell viability was determined using LDH method.
- 따라서 COX-2에 의한 prostagladin의 합성은 염증반응을 매개하는 것으로 여겨진다. RAW 264.7 세포에 LPSd ug/mL)를 사용하여 COX-2의 생성을 유도한 후 청동풍뎅 이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 COX-2 생성에 대한 억제 정도를 western blot을 통해 알아보았다. 그 결과, 청동풍뎅이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물에서 대조구인 LPS 단독 처리군에 비해 COX-2의 단백질 발현이 감소되는 경향을 나타내었다.
- albopilosa for 24 hr. Supernatants were then collected after 24 hr and PGE2 concentration from supernatants was detei*mined by ELISA method. Data represent the mean ± SD of triplicate experiments.
- (Sigma)을 사용하였다. Superoxide의 양은 nitroblue tetrazolium(NBT) 환원방법에 의해 측정하였다 (11, 12). 반응액으로는 각 농도별 시료(15.
- 항산화활성은 1, 1 -diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, Sig- ma)를 이용하여 시료의 라디칼 소거 효과(radical scavenging effectX 측정 하는 Blois법을 활용하였다(10). DPPH 약 2 mg을 EtOH 15 mL에 녹여 DPPH용액을 제조하였다.
성능/효과
- 1에 나타내었다. DPPH의 free radical 소거활성은 성충 및 3령 유충 에탄올 추출물 모두에서 처리농도에 따라 농도 의존적으로 DPPH의 free radical 소거활성이 증가함을 보였으며 (Fig. 1-A), 성충 및 3령 유충 에탄올 추출물 각각의 1瞞)값은 280.02 μg/mL오+ 483.39 胞/mL로 나타났다(Table 1). 청동 풍뎅이 에탄올 추출물들의 xanthine oxidase 저해활성과 superoxide radical 소거활성을 xanthine/xanthine oxidase system에 의해 측정하였다.
- 본 실험에서는 LDH cytotoxicity detection kit를 사용하여 492 nm에서 ac- tivity를 측정하였다. RAW 264.7 세포(lSxltf5 cejls/ mL) 에 청동풍뎅이 성충 및 3령 유충 에탄올 추출물과 LPS(1 Ug/mL)를 동시 처리 하여 24시간 배 양한 후, LDH assay 방법을 이용하여 세포독성을 확인한 결과, 성충 추출물에서는 250 ug/mL 이상 처리시 세포독성을 보인 반면(Fig. 2-A), 유충 추출물에서는 세포독성이 처리 농도가 증가함에 따라 다소 독성을 나타냈으나 500 ug/mL 이하의 농도 처 리구에서는 세포독성이 거의 나타나지 않았다(Fig. 2-B). 그러나 LPS가 첨가되지 않은 처리구(1, 000 μg/mL)에서도 세포독성 이 다소 나타남으로써 다음의 항염증활성 등의 세포 생리활성 실험은 500 tig/mL 이하의 농도에서 실시하였다.
- 7 세포에서 염증성 prostaglandin E2(PGE2) 억제효과를 ELISA kit를 이용하여 정량하였다. RAW 264.7 세포에 LPS(1 pg/mL)를 사용하여 PGEz의 생성을 유도한 후 청동풍뎅 이 성충과 3령 유충 에 탄올 추출물을 농도별로 처리하여 확인한 결과(Fig. 5-A, B), 성충과 3령 유충 에탄올 추출물 모든 처리구에서 처리 농도가 증가할수록 그 억제효과도 유의적으로 높게 나타났으나, LPS를 첨가하지 않은 청동풍뎅이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물 각각의 단독 처리구에서는 PGE?의 생성억제 효과가 나타나지 않았다. 이는 청동풍뎅이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물에 의해 LPS에 의해 발현되는 PGE2 억제에 영향을 준다는 것을 의미하며, 이러한 결과는 COX-2의 생성억제가 PGE2 생성억제를 통한 것으로 여겨진다.
- 7 세포에 청동풍뎅이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 NO 생성 억제 효과를 세포 배양액 중에 존재하는 NO?「의 형태로 측정하였다. 그 결과 LPS 단독 처리군에서는 NO가 과량 생성되는 것을 확인할 수 있었으며, 청동풍뎅이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물을 동시에 처리한 시험구에서는 NO 생성량이 처리농도별에 따라 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). 그러나 결과에서 보듯이 청동풍뎅이 3령 유중 주줄 물 처리구(Fig.
- 7 세포에 LPS(1 pg/mL)를 사용하여 iNOS의생성을 유도한 후 청동풍뎅이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 iNOS 생성에 대한 억제 정도를 RT-PCR를 통해 알아보았다. 그 결과 RT-PCR에 의한 유전자 발현은 처리 농도가 증가할수록 iNOS의 유전자 발현이 강하게 억제되었다(Fig. 3).
- 7 세포에 LPSd ug/mL)를 사용하여 COX-2의 생성을 유도한 후 청동풍뎅 이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물을 농도별로 처리하여 COX-2 생성에 대한 억제 정도를 western blot을 통해 알아보았다. 그 결과, 청동풍뎅이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물에서 대조구인 LPS 단독 처리군에 비해 COX-2의 단백질 발현이 감소되는 경향을 나타내었다. 특히 청동 풍뎅이 성충 추출물 500 pg/mL에서 강한 억제효과를 볼 수 있었다(Fig.
- 2). 그러나 결과에서 보듯이 청동풍뎅이 3령 유중 주줄 물 처리구(Fig. 2-B)에서보다 성중 에탄올 주줄물 처리구 (Fig. 2-A)에서가 고농도로 갈수록 NO 생성 억제효과가 크게 나타났는데, 이러한 효과는 세포독성 작용에 의한 것으로 사료된다.
- 1-C), superoxide radical 소거 활성 또한 모두 농도 의존적으로 활성이 증가함을 보였다(Fig 1-B). 성충 에탄올 추출물의 superoxide radical 소거활성의 ICso값이 469.42 ug/mL로 청동 풍뎅이 성중 에탄올 주줄물이 3령 유중 에탄올 주줄 물에서보다 다소 높은 활성을 보였다(Table 1). 질소산화물(nitric oxide: NO)은 활성종으로서 세포독성이 강하며 다량의 NO 가 생성되면 nitrosation, nitration과 같은 간접적 효과 및 산화 반응을 야기하여 유해한 효과를 나타내게 된다.
- 이에 청동 풍뎅이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 NO 생성저해 활성을 NO를 생성하는 물질인 sodium nitroprusside(SNP) 를 사용하여 아질산염 (nitrite)의 양으로 NO 소거활성을 측정하였다. 청동풍뎅 이 성충과 3령 유충 에 탄올 추출물의 NO 생성저해활성 역시 그다지 높게 나타나지 않았으나, xan- thine/xanthine oxidase system에 의한 항산화 즉정 결과와 마찬가지로 고농도로 갈수록 농도 의존적으로 다소나마 NO 생성저해활성이 높아짐을 확인할 수 있었다(Fig. 1-D). 최근 Park 등(2)의 약용곤충추출물을 대상으로 한 항산화능 결과 보고에서도 장수풍뎅이 등 다수의 곤충 추출물들이 높은 항산화 능을 갖는다는 연구 결과와 마찬가지로 본 실험에서도 청동 풍뎅이가 우수한 항산화활성 물질을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.
- 청동 풍뎅이 에탄올 추출물들의 xanthine oxidase 저해활성과 superoxide radical 소거활성을 xanthine/xanthine oxidase system에 의해 측정하였다. 청동풍뎅 이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물의 xanthine oxidase 저해활성은 그다지 높게 나타나지 않았지만 각 추출물의 농도가 높아질수록 xanthine oxidase에 대한 저해효과도 높아졌으며 (Fig. 1-C), superoxide radical 소거 활성 또한 모두 농도 의존적으로 활성이 증가함을 보였다(Fig 1-B). 성충 에탄올 추출물의 superoxide radical 소거활성의 ICso값이 469.
- 그 결과, 청동풍뎅이 성충과 3령 유충 에탄올 추출물에서 대조구인 LPS 단독 처리군에 비해 COX-2의 단백질 발현이 감소되는 경향을 나타내었다. 특히 청동 풍뎅이 성충 추출물 500 pg/mL에서 강한 억제효과를 볼 수 있었다(Fig. 4).
후속연구
- 그러나 이 내인성 항산화 방어체계가 세포 내 산화-환원 균형을 유지하는데 문제가 생길 경우 결과적으로 산화스트레스가 일어나게 되며 이 산화스트레스는 직접적으로 세포 내 거대분자의 손상을 일으키거나 세포손상을 일으키는데 중요한 역할을 한다(16). 따라서 산소유리기의 자유기를 소거할 수 있는 물질 또한 산화적손상의 예방에 유용할 것으로 사료된다.
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